壳聚糖纳米粒包裹的多酚E抑制小鼠Ehrlich实体瘤的增殖和生长

-----埃及基础与应用科学杂志5（2018）110完整文章壳聚糖纳米粒包裹的多酚E抑制小鼠Ehrlich实体瘤的增殖和生长阿扎岛放大图片作者：Ibrahim M.放大图片作者：El-Sherbinyb.放大图片作者：ElMissiryA.Alia，Engy AbdElhakimaa埃及曼苏拉曼苏拉大学理学院动物学系b埃及吉萨Zewail科技城材料科学中心阿提奇莱因福奥文章历史记录：2017年9月7日收到2017年10月21日收到修订版，2017年2017年11月13日在线发布关键词：绿茶癌艾氏瘤壳聚糖纳米粒A B S T R A C T绿茶多酚有限的生物利用度阻碍了它们向肿瘤的递送，从而阻碍了治疗效果。研究了壳聚糖纳米粒（CSNPs）包裹的多酚-E（PE）对小鼠Ehrlich实体瘤的抗肿瘤活性。粒径为53-69 nm的CSNPs-PE在37 °C、pH = 7.4时表现出83%的包封率和PE的缓释。数据表明，在交联程度较低的制剂中，释放的药物百分比较高。艾氏腹水癌-小鼠背部皮下注射EAC细胞（2.5×106口服施用CSNP-PE 30天产生肿瘤体积的显著减小（53%），与游离PE和空隙CSNP（72%）相比，重量与游离PE和对照组相比，细胞周期显示G 0/G1期阻滞与增殖细胞核抗原（PCNA）的减少有关CSNPs-PE治疗组小鼠肿瘤组织中Bax和p53的表达明显增强，caspase-3、caspase-8、caspase-9和CD 95的表达明显增强，Bcl-2的表达明显降低，VEGF和总之，将PE封装到CSNP中为癌症化疗提供了良好的平台，并提高了不同多酚在纳米化疗/预防中的现有应用。©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇开放获取的文章，CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。介绍天然产物对抗癌症生长和增殖的治疗潜力受到其较差的口服生物利用度和随后递送至肿瘤的限制基于纳米技术的绿茶多酚口服给药可以克服由于纳米颗粒的理化特性而导致的常规治疗的局限性[1]。包封到壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）中的表没食子儿茶素没食子酸酯在体外和体内对人黑色素瘤细胞生长具有显著的抑制作用[2，3]。壳聚糖（CS）是从甲壳类动物坚硬的外骨骼中获得的天然多糖[4]。它具有优越的物理化学和生物学特性，因此具有广泛的生物医学应用[5，6]。CSNP还通过增强肠道稳定性来改善绿茶提取物的血浆暴露[7]。癌症是世界范围内死亡率最高的疾病之一肿瘤化疗和预防的主要靶点是诱导细胞周期阻滞、凋亡和抑制*通讯作者。电 子 邮 件 地 址 ： elmissiry@mans.edu.eg ， maelmissiry@yahoo.com （ 硕 士 ）ElMissiry）。血管生成[8]。同时，大自然提供了大量的医药产品，被认为是治疗癌症的无毒药物的重要来源。富含多酚的植物衍生化合物通过靶向细胞凋亡的分子途径被证明具有很好的治疗特性[9]。在天然膳食化合物中，绿茶多酚在几种癌症类型中显示出令人印象深刻的化学预防潜力[10]，包括前列腺癌[11]、人黑色素瘤细胞[3]和肺癌[12]。Polyphenon-E（PE）是绿茶提取物，含有60%的纯儿茶素，具有高EGCG含量[13，14]。其主要成分为表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）65%，表没食子儿茶素（EGC）4%，表儿茶素9%，表儿茶素没食子酸酯6%，没食子儿茶素（GGC）4%，表儿茶素没食子酸酯6%。儿茶素-3-没食子酸酯，4%;（±）-儿茶素-3-没食子酸酯，0.2%;没食子儿茶素，0.2 %;儿茶素，1.1%和咖啡因，0.7%[15]。PE显著下调MCF-7细胞中的几种miRNA表达谱[16]，诱导人膀胱癌细胞凋亡[17]并抑制前列腺癌的转移进展[18]。它还抑制N-乙基-N-羟乙基亚硝胺诱导的肾细胞致癌性[13]。Ehrlich肿瘤是最常见的癌症模型，最初在小鼠中表现为自发性乳腺癌，然后用作小鼠中的实验性可移植肿瘤[19]。绿茶儿茶素的抑瘤作用在许多类型的癌症中显示https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2017.10.0082314- 808 X/©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbasA.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120111WoMi×而其对Ehrlich细胞癌的作用尚未完全研究。因此，本研究研究了口服封装到CSNPs中的polyphenon-E对小鼠实体Ehrlich肿瘤模型的抗肿瘤效率材料和方法化学品通过元素分析测定，中等MW的聚苯酚-E（PE）、脱乙酰壳多糖（CS）、% N-脱乙酰化约81%，和五碱三磷酸钠（STPP）购自SigmaAldrich（St. Louis，MO）。冰醋酸、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和所有其他试剂均为分析级。抗PCNA、VEGF、CD 31、P53、CD 95、BcL-2、BAX和半胱天冬酶3、8和9抗体从Thermo Scientific获得。小鼠单克隆抗体（Cat No MS-106-P0，USA），（Thermo scientific，兔多克隆抗体，Cat No RB-9031-P0，USA），（Thermoscientific，兔多克隆抗体，Cat No RB-10333-P0，USA），（兔IgG抗体批号：GR 110207-3 abcam USA），（小鼠IgG 1一抗，批号：5120612021Milteny Biotec ） ， （ 小 鼠 IgG 1 抗 体 代 码 ： F7053 DAKOA/SDenmark），（单克隆IgG抗体批号：GR 142124 -1 abcam USA），（目录号51- 68654 X批号：16374兔IgG BD Biosciences USA），（兔单克隆一抗ab 32125批号：YH 080907 D abcam USA和山羊pAb抗兔IgG作为二抗（批号：15232- 1 abcam USA ）和（兔单克隆IgG抗体批号：GR 63053 -2 abcam USA）。负载多酚-E的CSNP壳聚糖纳米颗粒（CSNP）使用离子凝胶化技术制备[20]，稍微修改 。 简 言 之 ， 通 过 将 CS 溶 解 于 0.1%w/v 乙 酸 中 获 得 CS 水 溶 液（0.1%w/v）。然后，在温和磁力搅拌下将0.1%STPP水溶液逐滴加入CS溶液中20分钟。在室温下自发形成乳白色悬浮液，将其作为水凝胶NP进一步检查使用相同的程序制备负载PE-60的CSNP，但是将250mg/kg体重的PE-60溶解在CS溶液中。形态和粒度测量通过透射电子显微镜（TEM，JEOL，JEM-1230，Japan Ltd.）加速电压为200 kV。通过在涂覆有薄碳层的铜网格上干燥NP来制备用于成像的样品。还通过动态光散射（DLS）（Malvern nanosizer，Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，UK）。纳米粒子的溶胀行为通过在含有1.5mlPBS（pH7.4）的Eppendorf管中孵育一定量的干燥颗粒（10 -15mg），同时在37℃下以120rpm振荡，来研究冷冻干燥的普通CSNP的溶胀行为。以一定的间隔，将溶胀的样品与PBS溶液分离并称重，以使用以下关系式计算其溶胀百分比：S≤ %≤Wt-Wo×100其中W。是初始重量，Wt是时间t时溶胀颗粒的重量。溶胀数据表示来自三次独立溶胀实验的平均值± SD。药物包封效率PE-60的包封率（EE%）通过在14，000g下超离心从一定体积的其水性悬浮液中分离负载PE-60的CSNP来测定，4°C持续20分钟（SORALL® Bioguge Stratos Ultracentrance ge），随后使用UV-Vis分 光 光 度 法 （ EvolutionTM 300 UV-Vis 分 光 光 度 计 ， ThermoScientific，USA）在442 nm的kmax然后根据以下关系计算PE-60的包封率（EE%）：E E%¼。mr×100其中mi和mr分别是初始负载的PE-60和保留在NP中的PE-60的量（mg）体外释放研究在PBS（pH 7.4）中进行来自开发的CSNP的PE-60的体外累积释放研究。简而言之，通过在14，000g和4 °C下超离心20分钟（SORALL®Bioguge Stratos Ultracenthalge），然后冻干沉淀物，从制备的水性悬浮液中分离负载PE 60的CSNP。然后，通过孵育预称重的干粉样品（10- 10015mg ），同时在 37 °C 下在 2ml 缓冲溶液 PBS （ pH 7.4 ）中以120rpm振荡。孵育后，从缓冲溶液中取出100μ l等分试样，通过紫外-可见分光光度计（Evolution TM 300紫外-可见分光光度计，ThermoScientific，USA）在442 nm的kmax下进行分析。取出的样品用等体积的新鲜缓冲溶液替换，以保持释放流体的体积恒定。所收集的数据表示三次独立放行实验的平均值±动物分组目前的研究是在从开罗肿瘤中心购买的体重为25-30 gm的雌性白化小鼠上进行的。将它们在标准实验室条件（26 °C，12小时光照/黑暗循环）下饲养在标准尺寸的笼中。Ehrlich腹水癌细胞获自开罗肿瘤中心。根据Mansoura University的Institutional Animal EthicsCommittee（IAEC），按照实验动物的护理和使用指南进行动物处理。每只小鼠背部皮下注射2 × 10 - 6艾氏腹水癌细胞（EAC）（0.2ml/只）。注射日指定为第0天。在第5天，将动物随机化并分为4组，每组10只动物：对照组（C），移植EAC细胞。第二组在移植后第5天口服0.1ml壳聚糖纳米粒（Cs），每周3次，共30天。第三组（CSNPs-PE）在EAC细胞注射的第5天给予CSNPs-PE，每周3次，共30天，总体积为0.1 ml口服胃管。第四组（PE组）于移植后第5天口服游离多酚-E（PE）0.1ml，每周3次，共30天。在所有情况下，PE的浓度为250mg/kg体重。在30天的实验期完成后，处死过夜禁食的动物并切除肿瘤。肿瘤重量和体积采用非侵入性标准方法测定肿瘤体积[21]。肿瘤体积使用外部测量仪112A.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120从肿瘤细胞移植后第10天开始，在30天的实验期内每周记录卡尺。肿瘤体积用改良的椭球公式估计。肿瘤体积1/4=2 mm长×2mm宽在完成30天的实验期后，处死禁食过夜的动物，切除肿瘤并称重。将每个肿瘤分成两部分进行免疫化学、生物化学和分子生物学研究。分子测定通过机械解离技术进行用于流式细胞术的实体瘤制备[22]。细胞周期分析将获得的肿瘤细胞透化，固定，然后使用Cycle TEST PLUSDNA试剂盒用碘化丙啶（PI）标记核DNA[23]。使用Cell Quest软件（Becton Dickinson）在FACS荧光检测器上测定细胞周期期的核DNA分布总共获得10，000个事件，并对流式细胞术数据进行分析。使用Mod Fit软件进行。显示了DNA含量与计数的直方图凋亡分析根据制造商描述的说明书，使用来自Clontech（Palo Alto，CA）的Annexin-V FITC/PI，ApoAlert试剂盒来区分凋亡和坏死。染色前，使用2%多聚甲醛固定细胞，并用皂苷（0.5%v/v，在PBS中，pH 7.4）透化。将细胞洗涤并悬浮于含有0.2%BSA的PBS（pH 7.4）中，分成等分试 样 用 于 流 式 细 胞 术 分 析 。 使 用 CellQuest Pro 软 件 （ BectonDickinson ） 在 FACSCaliburTM 细 胞 仪 （ BD Biosciences ， SanJose，CA）上进行流式细胞术分析，以进行数据采集和分析[24]。共获得10，000个事件，并将细胞适当门控用于分析。增殖标志物、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的测定为了测定p53、Bax、Bcl-2、CD 95和半胱天冬酶3和9的表达，如前所述各组细胞（1 × 106）分别与抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体孵育30 min，流式细胞术分析Bcl-2和Bax的表达。小鼠抗P53 FITC用于通过流式细胞术进行P53分析的情况下Fig. 1. 所制备的负载多酚-E的壳聚糖纳米颗粒的示意图。A.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120113caspase 3、8和9分别使用FITC兔抗活性caspase 3、抗caspase将细胞用PBA/BSA彻底洗涤，以400g离心5 min，重悬于PBS/BSA中的0.5%多聚甲醛中，并在配备有488 nm氩激光光源和515 nm FITC荧光带通滤光片的流式细胞仪上分析。共获得10，000个事件，并将细胞适当门控用于分析。免疫组织病理学评估将肿瘤组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中，制备5μ染色。 增殖细胞核抗原（PCNA）、血小板内皮细胞粘附分子-1（PCAM/CD 31 ）和血管内皮生长因子（VEGF ）从Thermo-Fisher Scientific，USA获得，具有以下规格：（PCNA，小鼠单克隆抗体，MS-106-P0，USA）、（CD 31，兔多克隆抗体，RB-10333-R7）和（VEGF，兔多克隆抗体，RB-9031-R7）.通过将肿瘤切片与适当稀释的1：50-1：400一抗孵育进行免疫组织化学研究。阴性对照切片不使用第一抗体制备。使用光学显微镜检查所有组织切片，以使用Olympus（IX 51）显微镜获得图像[25]。PCNA和VEGF由两名研究者使用光学显微镜独立评估和评分。在400个癌细胞中对阳性癌细胞核的数量进行评分，并将染色细胞与总细胞的比率定义为PCNA或VEGF指数[23]。在计算机辅助数字图像分析（数字形态测量研究）上对CD 31表达进行评分使用安装在Olympus显微镜上的Olympus数码相机对组织切片使用适用于面积百分比测量和对象计数的Video-Test Morphology软件（Rus-sia）结果CSNPs和CSNPs-PE的制备和表征使用离子凝胶化技术制备壳聚糖纳米颗粒（CSNPs），如图1所示。1.一、测定在不同STPP浓度下获得的空隙CSNP（A1和A2）和负载PE的CSNP（A1-D和A2-D）的平均粒度图二.（A B）制备的空隙（A2）纳米颗粒和负载儿茶素的CS（A2-D）纳米颗粒的透射电子显微照片。(C)不同STPP浓度（Al和A2）的CS纳米颗粒在PBS（pH 7.4）中在37 °C下的溶胀行为。(D)在37 °C下在PBS（pH 7.4）中从不同交联程度的CS纳米颗粒（A1-D和A2-D）中的负载的儿茶素的累积释放研究。数值为一式三份的平均值114A.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120一***mmt表1制备的不同组成的空隙和PE负载CS纳米颗粒的平均粒径和它们的包封率。制剂CS（% w/v）STPP，(0.1%w/v）（ml）平均粒径（nm）± SDEE% ± SDA10.11021.4± 7.6–A20.12016.7± 9.2–A1-D0.11069.8± 7.783.0± 2.1A2-D0.12053.1± 14.686.3± 1.6使用动态光散射，如表1所示。数据显示，增加STPP含量倾向于减小所得NP的尺寸例如，当交联剂STPP的体积加倍时，空隙CSNPAl的尺寸在负载PE的NP（A1-D和A2-D）的情况下也注意到相同的结果与相应的普通CSNP相比，生物活性成分PE的掺入增加了粒度（表1）。通过动态光散射和透射电子显微镜测定粒径在53和69 nm之间的CSNPs-PE这些粒度结果也从图2（A和B）中所示的获得的TEM显微照片中得到证实。TEM显微照片还证明了所制备的NP的几乎球形的形态测定了PE在开发的CSNP中的包封率（EE%），发现其在83.0 ± 2.1%和86.3 ± 1.6%之间的范围内，这取决于交联剂STPP的含量（表1）。制备的NP的溶胀能力是决定其适用于各种生物医学应用的关键特征之一。如图2C所示，研究了在不同STPP浓度（A1和A2）下获得的空隙CSNP的溶胀行为。数据显示，增加NP中的STPP含量倾向于降低在平衡时获得的溶胀值。在37 °C下，在PBS（pH 7.4）中，负载的PE从不同交联程度的CSNP的累积释放模式示于图2D中。如图所示，释放的PE的百分比随着时间逐渐增加，直到在约3-4小时后达到几乎恒定的值数据还表明，与交联程度较高的纳米颗粒（A2）相比，在交联程度较低的制剂（A1）的情况下释放的药物的百分比相对较高。765抗肿瘤反应通过评估EAC细胞接种后30天的肿瘤重量（图3A）和肿瘤体积（图3B），证明了包封多酚-E的壳聚糖纳米颗粒（CSNP-PE）对植入小鼠中的EAC肿瘤的抗肿瘤作用。携带EAC的小鼠显示肿瘤重量和体积显著增加。与荷瘤小鼠相比，空CS-NP、游离PE和CSNP-PE治疗导致肿瘤重量分别显著降低53%、60%和72%。当口服给予CSNPs-PE时，在肿瘤体积中证明了类似的趋势，其在实验期间显著减小。在所有情况下，CSNPs-PE比游离PE对肿瘤重量和体积产生显著的抑制作用为了研究CSNP-PE给药诱导的肿瘤生长的减少是否是由于肿瘤细胞增殖的抑制，我们使用流式细胞仪分析了细胞周期。S期细胞百分比从荷瘤对照小鼠的约25.09 ± 1.76%降低（P 0.05），分别降至CSNPs-PE和PE处理的4.13% ± 0.21%和9.90% ± 1.4（图4）。细胞周期分析还揭示了分别用CSNPs-PE和PE处理的小鼠获得的肿瘤中的G 0/G1周期停滞。用免疫组化方法检测福尔马林固定石蜡包埋肿瘤细胞增殖相关的细胞周期抗原-增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，研究肿瘤细胞的增殖活性。在CS-NPs中包裹PE对PCNA表达的抑制比对照肿瘤显著高56%此外，与荷瘤对照组相比，无效CSNP和游离PE处理组显示PCNA表达分别显著降低33%和40%（图5A）。在不同条件下，荷艾氏癌小鼠肿瘤组织中p53水平的流式细胞仪分析示于图5B。与细胞凋亡增加相关，与空白CSNP和游离PE处理的携带EAC的小鼠相比，用CSNPS-PE处理的小鼠的肿瘤组织中p53显著升高两倍（图1B）。 5 B）。图 6显示了不同荷瘤小鼠中VEGF和CD 31的免疫组织化学检测。30天后，CSNPs-PE治疗组中的VEGF与荷瘤对照组相比显著减少34%。当与对照组相比时，口服施用无效CSNP或游离PE分别使VEGF降低15%和27%（图6A）。同时3025CSNPs-PE2043152101500PECSC0 10 17 24 30天图三.包封到壳聚糖纳米颗粒（CSNP-PE）中的多酚-E（PE）对（A）体重变化和（B）肿瘤体积的影响。皮下注射EAC细胞（2 × 106个细胞/小鼠）以在Swiss白化小鼠中诱导实体瘤。每天口服施用CSNPs-PE，持续30天。数值为三次测定的平均值± SEM。* 与对照组相比P 0.05，与PE治疗组相比P 0.05B**.GMA.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120115CPECSCSNPs-PE12010080%6040200302520%1510504.543.532.5%21.510.50图四、壳聚糖纳米粒包封的多酚-E（PE）对细胞周期的影响用碘化丙啶染色流式细胞仪检测不同动物组EAC荷瘤小鼠细胞核DNA的细胞周期分布DNA直方图显示了细胞周期各阶段中细胞的分布和百分比显示了DNA含量（x轴，PI-荧光）与计数（y轴）的直方图显示。数值表示为细胞周期G 0/G1、S和G2/M期CSNPs-PE使细胞周期阻滞于G 0/G1期，S期细胞数减少研究了EAC中内皮标志物CD 31的免疫组织化学表达，作为血管生成拟态的可能证据（图6B）。用抗CD31的抗体进行的免疫染色显示，对照荷瘤小鼠显示出比其他处理组显著更高的免疫染色肿瘤细胞。CSNP-PE处理组显示出比CSNP和PE处理的动物显著更低的免疫染色肿瘤细胞（图1B）。6 B）。这些数据表明，PE抑制肿瘤组织中的新血管生成，并且CSNPs-PE比单独的PE更有效用Annexin/PI标记荧光技术检测CSNPs-PE的生长抑制作用是否与诱导细胞凋亡有关 数据显示，与对照荷瘤小鼠相比，从用CSNPs-PE处理的小鼠获得的凋亡细胞的数量增加，并且活细胞的数量显著（P >0.001）更低（表2和图3）。 7）。CSNPs-PE也使对照肿瘤小鼠的坏死细胞计数显著增加。与对照肿瘤相比，从无效CSNP和游离PE处理的小鼠获得的肿瘤细胞的膜联蛋白-V染色数据还显示，CSNPs-PE处理的小鼠的凋亡细胞显著（P> 0.001）高于游离PE处理的大鼠。这种作用反映在CSNPs-PE中的活细胞百分比显著低于游离PE和CS处理的大鼠。这些发现表明，CSNPS-PE的效果比游离PE更显著，表明CSNPS-PE的优点。儿茶素包封在CS纳米颗粒中。评估了参与细胞凋亡的蛋白质表达并显示在图8（A）中，流式细胞仪图的图示示于图8（B）中。Bax表达CSNPs-PE口服治疗增加。同时，CSNPs-PE降低了Bcl-2的表达（图8）。数据还显示了与天然PE和CSNP相比包封的PE的优势。与游离PE和无效CSNP相比，在用CSNP-PE处理的动物中，胱天蛋白酶3、8和9的活化分别显著增加（图8）。这些变化表明，包封形式的PE比天然PE更有效。与空白CSNP和天然PE相比，在从用CSNP-PE处理的荷瘤小鼠获得的EAC细胞中证实了CD 95表达的显著增加（图1B）。（八）。讨论茶儿茶素具有显著的抗肿瘤作用，然而，由于其体内稳定性差、生物利用度有限、在胃肠道中降解和肠吸收不足，其在临床环境中的药理学应用有限[7]。用于药物递送的CS纳米制剂显示出增强生物利用度并增加茶多酚的吸收[26，27]。在水介质中，通过CS的氨基与STPP的磷酸基团的相互作用制备CSNPs合成的CSNP为绿茶儿茶素提供了嵌入聚合物网络中的制剂[11]，因此可以保护绿茶儿茶素免受胃和胃肠道的苛刻环境中的降解[28]。 这得到了PE的稳定持续释放的支持，并且与颗粒的溶胀模式和药物释放一致（图1）。 2）。CS和STPP的浓度对于确定尺寸是重要的。.G0/G1***S*.**G2/M*.*116A.I. Othman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）110-120CCS80706050403020100C CSCSNPs-PE PE80706050403020100C CS CSNPs-PE PECCSCSNPs-PEPE图五、壳聚糖纳米粒包裹的多酚-E（PE）（CSNPs-PE）对小鼠肿瘤组织中PCNA（A）和p53（B）表达的影响使用特异性抗体对肿瘤切片进行染色。用苏木精进行复染。显微照片（放大倍数，×20）显示了两个独立样品（A）的代表性图片。使用流式细胞仪估计P53（B）。*< 与对照组相比P 0.05，与

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