神经科学中的荧光纳米显微镜综述：高端测量仪器和生物医学成像的新研究领域

工程16（2022）29研究高端测量仪器-综述神经科学中的荧光纳米显微镜王扬云斗，林健，张启明，陈Xi，栾海涛，顾敏上海理工大学光电与计算机工程学院，医学智能纳米光子学研究中心，上海200093阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年9月17日修订2020年11月30日接受2021年5月21日网上发售关键词：荧光成像衍射极限纳米分辨率神经科学A B S T R A C T荧光纳米显微镜提供了克服光学显微镜衍射限制分辨率障碍的成像技术，从而开辟了神经科学等领域生物医学成像的新研究领域。在这里，我们回顾了最重要的荧光纳米显微镜技术，包括它们在阐明蛋白质结构和流动性，实时测定参与神经过程的突触参数，三维成像和纳米级神经活动的跟踪中的应用描述。最后，我们讨论了荧光纳米显微镜的前景，特别关注其与相关技术（例如，机器学习）在神经科学中。©2022 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍神经科学的范围[1]包括对神经系统的组织及其在产生行为中的功能的科学研究从宏观的角度来看，神经系统包括分布在大脑中许多离散解剖位置的神经元和回路，并支持三种在纳米尺度上，突触相关蛋白的组织对于神经元过程（例如神经元传递）的稳定性和功能至关重要。例如，在化学突触的信号传递过程中，在可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物将两个膜结合在一起后，由动作电位（AP）（与突触结合蛋白相关）的到来引起的突触前Ca2+浓度升高导致神经递质释放[2，3]。一个精心制作的蛋白质为基础的细胞基质在释放过程中发挥了重要作用网格蛋白还参与质膜上囊泡的内吞出芽[4]。除了蛋白质的流动性，蛋白质分布在神经元信号传导中起着不同的功能作用。例如，突触以兴奋性突触后电流（EPSC）或抑制性突触后电流（IPSC）的形式传递的信息在轴突的起源处被整合和毛皮-*通讯作者。电子邮件地址：gumin@usst.edu.cn（M. Gu）。因此，EPSC模型反映了易释放池的初始大小及其从储备池的补充速率、突触囊泡（SV）释放的概率和突触易化[5]。轴突有一个独特的细胞骨架，含有肌动蛋白和血影蛋白等蛋白质，以及影响其功能完整性的相关蛋白质。膜相关周期性骨架（MPS）可能影响轴突中AP和其他信号通路的产生和荧光显微术是生物学领域中最普遍的成像技术，这是由于其在使用荧光标记的分子特异性标记方面的优势及其实时成像能力。由于光的衍射极限，它是不可能的，以解决蛋白质的流动性和亚细胞结构，如突触在纳米级使用传统的光学显微镜。近年来，已经出现了几种形式的荧光纳米显微镜，其成像分辨率是传统荧光显微镜的2-荧光纳米显微镜提供了一种强大的新成像工具，其分辨率与电子显微镜相似;同时，它具有适合于研究亚细胞结构和生物过程的某些优势，包括活细胞，荧光，实时和三维（3D）分子成像，以及跟踪能力[17]。与其他尖端技术相结合，荧光纳米显微镜提供了一条更好地了解神经元，神经元回路，以及最终神经系统功能的途径。在这篇综述中，我们总结了几种荧光纳米显微镜技术：结构照明显微镜（SIM），受激https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.11.0102095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engY. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2930¼×ffiffiffi发射耗尽（STED）显微术、随机光学重构显微术（STORM）/光活化定位显微术（PALM）和最小光子通量（MINFLUX）纳米显微术，其结合了STED显微术和STORM。然后，我们从分子和细胞神经科学的角度讨论了这些技术的先进应用。 最后，我们展望了荧光纳米技术在神经科学中的应用前景.2. 荧光和衍射极限2.1. 荧光原理荧光团是一种荧光化合物，它可以在“基态”吸收光子，导致“激发态”的荧光发射和振动弛豫。从基态到激发态的跃迁发生得非常快（超过fem-到seconds）。理解发射和吸收过程最有用的方法之一是雅布隆斯基图（图1）。单重态是由在单态内具有相反自旋的电子的磁矩抵消引起的。三重态的寿命相对较长。S0表示基态，S1和S2表示激发单重态。S2是比S1更高的能态，而S0是比S1更低的能态。由于荧光的斯托克斯位移，即发射光相对于吸收光的红移波长，荧光显微镜中的信号与背景比之间的对比度已显著提高[18]。此外，荧光显微镜的基本原理-即，用激发波长照射染色的样品，并在较长的发射波长下检测其荧光信号-很容易理解。2.2. 衍射极限的影响光学显微镜可以被认为是一个透镜系统，可以用来可视化在一个标本中的精细结构由于光是一种可以衍射的波，因此由点物体产生的3D点扩散函数（PSF）基于空间相长干涉，在焦平面内，点扩散函数的半高宽（FWHM）为Drk=102n×sin2a，Dlk= 102n×sin2a沿着光轴。这里，k、ai和n表示光，物镜的孔径角，和浸没介质的折射率，分别;DR是在横向方向上的PSF的FWHM;Dl是在轴向方向上的PSF的FWHM如图2所示，当用可见光（k1/4632： 8 nm）和具有数值孔径（NA）为1.40（NAnsina），PSF的横向尺寸PSF的轴向尺寸约为487 nm。光的有限衍射导致无法解析的分子结构，使得细胞中的纳米级基本机制仍然不可见。3. 荧光纳米技术自20世纪中期以来，已经引入了几个概念，包括共焦荧光显微镜[19]和多光子显微镜[20]，以减少离焦荧光背景和光学切片的能力从原则上讲，与常规荧光显微术相比，CAL荧光显微术将空间分辨率提高了P2实际上，由于探测器尺寸有限，它们是相同的。共焦单光子和双光子荧光显微镜技术提供几乎相同的分辨率。通过扩展照明或检测波前，4Pi显微镜可以在固定细胞中实现80至150 nm的横向分辨率[21]。基于莫尔效应，SIM将高频特征转移到低频，这可以通过显微镜检测到SIM提供100然而，分辨率仍然受到光的衍射的限制在荧光团荧光物理和光化学方面，取得最显著突破的技术是STED显微镜和STORM/PALM，这两种技术都通过顺序读取衍射区的分子荧光特征来突破衍射屏障具体地说，读出标记是指信号提供最近，MINFLUX纳米显微镜结合了两种技术的优势，为生物学研究提供了一种更强大、更通用的成像工具，在固定细胞和活细胞中实现了1-3 nm的分辨率 图图3显示了SIM、STED显微镜、STORM/PALM和 MINFLUX 纳 米 显 微 镜 的 成 像 原 理 。 与 STORM/PALM 类 似 ，MINFLUX纳米显微镜依赖于一次成像单个（或至少可识别）分子。换句话说，与MINFLUX纳米显微镜和STORM/PALM相反，STED显微镜主要读取图1.一、 说明荧光分子内能量状态的雅布隆斯基图。S0是基态;S1和S2是激发单重态;T0和T2是三重态。Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2931ð Þ¼ð Þð ÞG图二、 油浸物镜的PSF，NA = 1.40。激发波长为632.8nm。NA：数值孔径。输出荧光系综，依赖于暗态和亮态之间的可逆转换。3.1. 结构化照明显微术使用图案照明场，SIM[6]结合光学操作和计算算法以获得光学截面并促进3D成像。在空间域中，线性不变光学系统中的观测数据D可以表示为卷积的的发射对象E和的PSFH：D rE rHr，其中r 是本地化位置。 相反，卷积可以在傅立叶域中表示为点-其中O是光学传递函数（OTF），k是空间频率。OTF定义了可以被检测到的空间频率或可观察区域，显微镜。如图3所示，使用具有不同相位和取向的周期性照明图案的总和，可以在横向和轴向方向上提高发射物体的重建图像的分辨率[7，8]。3.2. STED显微术在20世纪90年代，STED显微镜的概念被提出用于远场中的传播光和规则透镜[9，10]。使用时序图案化照明，这是确定明亮标记的坐标的最直接的方法。该技术可被视为可逆的可饱和光学线性荧光跃迁（RESOLFT）。除了STED显微镜，图三. SIM、STED显微镜、STORM/PALM和MINFLUX纳米显微镜的工作原理和分辨率。使用正弦照明模式，SIM可以恢复傅立叶域中正常观察区域大小的两倍的换句话说，SIM在空间域（100- 120 nm）中获得两倍的正常分辨率典型的单点扫描STED显微镜使用环形STED光束（橙色）淬灭激发光束（蓝色）PALM和STORM随机读出单个分子。N1个光子允许计算衍射斑点内单个分子的质心。紫色的斑点代表一个衍射点，它被赋予了目标（白色的星星）的范围使用可调节的环形光束，目标坐标图案包括四个指定坐标（示出为黑色、红色、黄色和蓝色圆圈）。I：“STED”光束的峰值强度Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2932pffiffiffiffiðÞ¼×ffiffiffiffið- ÞRESOLFT是指基态耗尽显微镜[10]。如图3所示，基于共焦显微镜配置，荧光标记物被聚焦的激发光束激发。在荧光团的自发衰变内，激发和STED显微镜光束的重叠产生子衍射斑点。 的实际决议的STED显微镜是Dr k= 2 n sin a 1 I=IS。在这里，I是‘‘STED为了提高分辨率，由螺旋空间相位调制器或涡旋相位板产生的红移环形STED光束的强度必须满足I>IS。换句话说，STED显微镜的分辨率仅由STED光束决定通过增加STED光束的强度，有效光斑的直径被限制到20 nm的横向分辨率然而，为了避免光漂白，必须采用合适的染料和自适应照明。3.3. 风暴/棕榈与STED显微镜中选择的坐标相反，在STORM[11]，PALM[12，13]和纳米级形貌成像（PAINT）中的点累积中，从随机坐标中读出单个荧光分子（图3）。使用宽场照明，单个分子被打开或激活。下一个活化分子与前一个活化分子的距离为k=2n。分子的反复激发在照相机上形成放大的衍射点。然后，图像通过开关和非开关荧光团的暗-亮-暗状态机制逐分子组装。 所探测到的光子能够定位斑点的质心位置并确定分子的横向位置的光学分辨率STORM/PALM近似为k=2n sinapN，其中N是在荧光团位置的光子的BER应该提到的是，高质量的STORM图像需要荧光团具有高的光子产率，每个开关事件，低的开关占空比，高的存活分数，和几个在这些特性中，低的然而，激活光不改变每个切换事件检测到的光子的数量3.4. MINFLUX纳米显微镜2017年，Stefan Hell的实验室提出了一种名为MINFLUX纳米显微镜的定位概念该技术将图案化照明与单分子特征（如在STORM/PALM中 ） 相 结 合 以 获 得 目 标 分 子 的 坐 标 （ 如 在 STED 显 微 镜 中 ） 。MINFLUX nanoscopy先进的三维分子成像和跟踪到迄今为止尚未实现的制度的个位数纳米精度和approxi-100升秒的时间分辨率在一个可扩展的视野（FOV）。如图 3，MINFLUX纳米显微镜采用在其中心具有最小强度的可移动激发光束。该最小值用作参考坐标，发射的光子数随着其接近荧光团而减少。因此，与STED显微镜和STORM/PALM不同，MINFLUX纳米显微镜不需要大量的光子。MINFLUX纳米显微镜装置由激活光束和激发光束组成，激活光束激活约400 nm激活区域内的荧光团对于每个定位，光束首先被规则地聚焦;然后，具有逐渐收缩的直径（L）的调制的二维（2D）或3D甜甜圈图案被定位以通过分子在焦平面（x，y）或样品体积（x，y，z）中的最大似然估计来在一维，局部化的最小标准偏差，即区域L内的r≥L=104pN，其中r是定位位置;N<$n1<$n0是在环形图案中的不同位置（r1和r0 在激活区域内，仅用N 600个光子就可以预期一维上r 1 nm的定位精度。因此，MINFLUX纳米显微镜 的 迭 代 精 度 超 过 了 基 于 相 机 定 位 的 横 向 精 度 的 量 子 CRB（QCRB）除了直接克服光的衍射极限的荧光纳米显微镜之外，扩展显微镜（ExM）可以通过组织和器官标本的物理放大实现纳米级3D成像，即使使用传统的衍射极限显微镜也是如此[23]。在过去的几年中，已经提出了各种ExM协议用于蛋白质[24]和核糖核酸（RNA）[25]的高分辨率成像，或用于人类临床标本[26]的应用。为了实现各向同性的样本扩展，生物分子和/或标签首先机械耦合到聚合物网。然后将试样均质化并膨胀。ExM的分辨率可以通过使用CUBIC-X的两轮扩增达到亚细胞水平，CUBIC-X基于化学水溶液[27]。4. 荧光纳米显微镜在过去的几十年中，荧光纳米显微镜已经变得更适合于三维、多种颜色和具有纳米级分辨率的生命系统以商用STED为例：STEDINFINITY（Abberior Instruments，Germany）生产线可达到<（20nm × 20 nm）和<（70nm× 70 nm× 70 nm）。加上100倍物镜，FOV为80lm 80 l m。采用四轴扫描仪（Abberior Instruments），扫描线频率可达2.6kHz，对512像素×512像素的数据采集速度可达4.2帧/秒。使用自适应光学可以在复杂样品（如果蝇）内部实现高达100 μ m的成像深度为了减少光漂白和光毒性，STED与Dymin成像模式同时进行，使光剂量最小化并将信号增强一个数量级。在高分辨率成像技术中，特别是在荧光纳米显微镜中，空间和时间分辨率之间的权衡是必不可少的。STED可以以毫秒时间分辨率对相对较小的FOV成像[28]。STORM显微镜配备快速切换染料[29]和快速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机[30]，可在约20-30 nm空间分辨率下实现亚秒级时间分辨率，此外，在STED显微镜和STORM/PALM中，光漂白和/或光毒性可以显著降低。由于其低光毒性，图案化激活非线性SIM（PA NL-SIM）在数十个时间点的大FOV上显示出约60 nm空间分辨率和亚秒级时间分辨率的活细胞成像[31]。在MINFLUX纳米显微镜中，可以以其最小的光子预算（即，固定和活细胞的低光漂白/光毒性）和可扩展FOV[16]。5. 荧光纳米显微技术在神经科学中的应用虽然荧光纳米显微镜提供非常精细的结构信息（例如，在活性区（AZ）中密集堆积蛋白质的亚细胞区室），不同分子结构的特定生理特性仍然是一个主要挑战[32]。荧光纳米显微镜主要用于研究Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2933结构（例如，MPS和蛋白质的功能），特别是在突触按钮（例如，突触前AZ和突触后密度（PSD））。由于组织和光的性质，动态、活细胞和体内深部组织成像仍然具有挑战性[17]。由于STED显微镜提供了活细胞跟踪功能，神经元传递过程中的突触融合已被动态揭示5.1. 突触中蛋白质的空间组织AZ（CAZ）处的蛋白质基细胞基质对于促进SV释放过程至关重要Rab亚家族Rab3相互作用分子（RIM）结合蛋白（RBP）是AZ支架的引物效应子。因此，RBP家族在果蝇SV、Ca2+通道和SV融合机制的偶联中是必不可少的.双色STED显微镜已经证明，基于RBP的细胞基质在控制细胞数量方面具有直接功能。容易释放的SV。如图4（a）[33]所示，果蝇RBP（DRBP）围绕着中央Ca2+通道场。DRBP对于AZ支架的完整性和神经递质释放至关重要[33]。此外，根据直接STORM，CAZ包括含有137个Bruchpilot（Brp）蛋白的单元。这些单位的组织与各种AZ状态有关，这些状态与不同的神经传递释放概率相关[34]。在神经传递过程中，SV对Ca2+内流的反应是在AZ膜内融合.在核心融合复合物中，有SNARE蛋白、囊泡成分和AZ特异性蛋白，所有这些都有助于SV和膜对接和融合。已实施STED显微镜检查以可视化SNARE蛋白质突触融合蛋白[35]、不明蛋白质SC 35[36]和烟碱乙酰胆碱受体[37]。支架蛋白，如突触后密度蛋白95（PSD-95）[38]，鸟苷酸激酶相关蛋白[39]，con-致密的Shank 3[40]和Homer[41]是PSD的主要组成部分。STORM和PALM成像均绘制了突触前和突触后末梢中蛋白质的空间组织，包括突触前支架蛋白的方向、PSD的层状组织和神经递质受体的横向分布[42图4（b）[42]显示了突触前巴松管（红色）和突触后Homer 1（绿色）的轴向和径向3D STORM图像。应该注意的是，PSD-95在突触后膜中谷氨酸受体的锚定和重排中起关键作用[38例如，使用STED显微镜结合内源性蛋白质标记，PSD-95经常出现在扩展的分布中，而不是作为孤立的纳米簇[46]。最近，MINFLUX纳米显微镜表明PSD-95沿着边长为100-400 nm的略微弯曲的表面5.2. 轴突的细胞骨架结构轴突中的MPS首先使用STORM发现[47]。我们观察到，肌动蛋白帽蛋白覆盖的短肌动蛋白丝被组织成重复的环状结构，如轴突束。相邻的肌动蛋白环由血影蛋白四聚体连接该结构形成在轴突膜下方，具有约180-190 nm的周期性然而，最近使用MINFLUX纳米显微镜的研究人员发现，在2 nm的空间分辨率下，MPS类似于轴突中的周期性螺旋结构。此外，使用STED显微镜和STORM，观察到树突中的MPS[48，49]。但树突内MPS的形成倾向和发育速度均低于轴突。此外，在胞体中观察到由MPS组分形成的二维多边形晶格结构，图四、 突触蛋白结构的纳米成像。（a）左：果蝇神经肌肉接头突触处含有DRBP、Brp和电压门控Ca2+通道杂音（Cac）的突触前AZ的3D STED图像。右：倾斜视图中的AZ模型。DRBP：果蝇RBP; Brp：Bruchpilot; GFP：绿色荧光蛋白; CacGFP：GFP标记的Ca2+通道; GluRIID：谷氨酸受体亚基。（b）突触的3D STORM图像（c）PSD-95的MINFLUX纳米成像，3D分辨率为2（i）突触后PSD-95的草图（ii）PSD-95呈簇状分布在曲面上。（iii）具有2.0- 2.7nm的各向同性3D定位精度的单个荧光团PSD-95：突触后密度蛋白95。（a）复制自Ref。[33]经美国科学促进会许可©2011;（b）转载于Ref.[42]经Elsevier许可，©2010;（c）转载自Ref.[16]经Springer Nature许可，©2020。Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2934×树突和朗维尔结[48换句话说，神经元中MPS的结构需要进一步阐明，以便破译其在促进或辅助AP的产生和传播中的功能，这至今仍不清楚5.3. 囊泡融合已知CAZ在神经传递和通信期间提供用于释放SV的功能平台。然而，在STED显微镜发明之前，囊泡运动的原理是难以捉摸的，STED显微镜使海马神经元中SV的运动能够被跟踪。 用与Atto 647N（ATTO-TEC GmbH，Germany）偶联的抗体标记突触结合蛋白，并以每秒28帧的速度捕获空间分辨率为62 nm的最终图像，显示面积为1.8μ m±2.5μm [54]。这表明囊泡连续结合，然后以类似于“粘附和扩散”模型的方式扩散离开细胞器此外，isoSTED显微镜已用于在两个内吞和胞吐循环期间跟踪囊泡，表明相同的囊泡用于自发和刺激神经递质释放[55]。然而，囊泡运输的潜在机制仍然未知。STED显微镜也解决了突触结合蛋白I从单个SV囊泡融合后形成孤立的集群。通过用羊抗小鼠Atto 532染料标记突触结合蛋白，STED显微镜实现了对SV及其密集包装的分子货物成像的更高此外，在融合过程中，突触结合蛋白仍然聚集在囊泡内;也就是说，它在胞吐作用后不会扩散到质膜[56]。5.4. 三维纳米神经元成像荧光纳米显微镜已经为具有纳米级空间分辨率的神经回路成像铺平了道路。使用STORM，视网膜神经节细胞的神经元结构映射已经在三维中投影，在视网膜神经节细胞的神经元结构中提供突触连接神经回路量表[57]。在图5（a）[57]中，使用STORM[57]对视网膜神经节细胞（蓝色）、突触后支架蛋白桥蛋白（绿色）和突触前蛋白（品红色）进行成像。使用STED显微镜，在体内观察了来自小鼠体感皮层分子层的增强型黄色荧光蛋白（eYFP）标记神经元的树突和轴突结构[58];精细神经结构的投影体积和脊柱形态的时间动态以67nm的空间分辨率显示（图5（b）[58]）。此外，通过结合Besselbeam SIM（BB-SIM）和组织清除方法，可以在整个安装的成年果蝇大 脑 中 鉴 定 单 信 使 RNA （ mRNA ） （ 单 分 子 荧 光 原 位 杂 交（smFISH））的定位和丰度[59]。6. 未来研究方向6.1. MINFLUX纳米显微镜有时被称为MINFLUX纳米显微镜的一个潜在应用是确定突触参数和可视化突触可塑性。确定突触参数需要在囊泡融合或神经递质释放期间具有纳米空间分辨率和微秒时间分辨率的量化建模。持续数小时或更长时间的长期变化为学习和记忆提供了生理基础，而发生在毫秒到分钟的时间段内的短期变化。MINFLUX nanoscopy提供超高时空分辨率和长期活细胞跟踪和成像能力，能够实现精确的突触参数建模和突触可塑性可视化，同时降低光毒性。此外，通过物理样本扩展方法（ExM）结合高分辨率成像，图五. 离体和体内神经元的纳米成像。(a)视网膜神经节细胞的样品制备和离体STORM成像。最终图像的插图（右下）显示了枝晶部分的放大视图。(b)小鼠体感皮层的体内STED成像。(a)经Elsevier许可，转载自参考文献[57]，©2015;（b）转载自参考文献[57]，© 2015。[58]经美国科学促进会许可，©2012。Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2935可以潜在地实现荧光纳米显微镜，特别是MINFLUX纳米显微镜6.2. 荧光生物缀合物荧光纳米显微镜的性能与荧光探针的光学特性密切相关[60]。例如，已经使用新的光转换荧光蛋白（FP）pcStar开发了一种具有高时空分辨率的纳米技术，称为“快速单分子引导贝叶斯定位显微镜（quick-SIMBA）”，并已用于发现特定的“平行三柱”结构，果蝇胚胎中的神经元-神经胶质细胞连接[61]。除了内源性荧光探针（即FP）之外，正在开发新的外源性探针以增加图像亮度，提高空间分辨率并增强荧光纳米显微镜中标记的特异性，包括小分子有机染料[62]，量子点[63]，聚集诱导发射纳米颗粒[64]，聚合物点[65]和上转换纳米颗粒（UCNP）[66]。具有更小尺寸和更高效率的新型荧光探针生物缀合物的开发有可能导致荧光纳米显微镜成像分辨率的进一步进步。此外，使用染料标记的脱氧核糖核酸（DNA）探针的随机结合，DNA-PAINT在DNA折纸纳米结构上实现了类似的图像分辨率[67，68]。值得一提的是，可交换荧光团已成功用于STED，如STED-PAINT[69]。6.3. 基因组成像神经元的正常功能是基于许多类型分子的集体作用。然而，荧光团之间的光谱重叠限制了可以同时测量的分子种类的数量。最近开发的基因组规模成像技术，对复用荧光原位杂交（FISH）极大地增加了可以同时成像的分子种类的数量，并且具有一定的误差容限。例如，在标记RNA分子期间，可以将专门设计的多位二进制字编码到荧光探针中，可以根据码本探测。单细胞转录组成像方法已经通过原位测序[70，71]和FISH[72这些技术与荧光纳米显微镜的结合可能会在分子水平上为神经元的结构和功能提供新的见解。6.4. 光学工具和其他相关成像技术6.4.1. 光遗传荧光纳米显微镜是研究神经元内部和之间的动态过程的重要工具，其涉及对大脑中特定细胞的快速和精确控制，同时使其他细胞保持不变。电极的精度不够高，药物作用太慢。光遗传学是一种结合遗传和光学方法来激活或抑制活组织特定细胞中明确定义的事件的技术[75]。然而，可见光的穿透深度受到内源性发色团的强散射的限制[75]。近红外（NIR）光在生物组织中具有更深的穿透深度，但其波长位于光遗传学窗口之外。UCNP可以将低能量入射NIR光子转化为高能量可见光发射，并且可以调节光谱以适应不同的光激活通道[76]。结合荧光纳米利用UCNP介导的光遗传学进行的显微镜检查为大脑深处6.4.2. 神经元样结构我们能打印思想吗？这是一个令人着迷的问题。然而，大脑的复杂性超出了传统制造技术的能力。与直接激光写入相结合，荧光纳米显微镜可以促进仿生光子芯片的发展，更接近地模仿大脑功能。双光子直接激光写入已经产生了具有亚微米特征的各种拓扑结构的3D仿生神经元结构[77]，并且双光束激光写入可以制造具有小至9 nm特征的结构[78]。6.4.3. 相关成像技术AP的测量在神经科学中具有重要意义目前，使用膜片钳的电生理学是测量个体AP的金标准然而，尽管它具有优异的时间分辨率和良好的信噪比，但是空间分辨率被限制为大约10μ m。氮空位（NV）中心的光致发光随AP传播产生的磁场而变化，这一过程称为光检测磁共振（ODMR）。这使得在环境条件下生物系统中的高分辨率磁场感测成为可能[79，80]。例如，已经使用ODMR证明了单个神经元和完整生物体中AP的检测[81]。将荧光纳米显微技术与光学数字磁共振技术相结合，可以在纳米空间分辨率下观察和测量突触强度变化的AP脑组织中的成像深度主要受到可见光范围内的强光吸收和散射的限制，使得难以解析来自脑中更深层的图像，即使在小动物中也是如此。解决这个问题的一个直接方法是通过插入梯度折射率（GRIN）透镜进入目标深部区域[82]或纤维镜[83]，或通过使用微棱镜[84]。例如，可以使用微棱镜对组织的垂直横截面进行成像[84]。GRIN透镜已用于对深部脑组织成像，包括海马体、下丘脑、丘脑和精细结构，例如CA1海马体中的树突棘[85]。这些技术的空间分辨率是有限的，因此，将荧光纳米显微镜可以帮助实现全尺度脑深部成像。为了通过减少光吸收来提高穿透深度，多光子显微术（MPM）使用较长波长的激发。三光子荧光的成像深度已被证明是小鼠脑组织表面以下5此外，使用具有1280 nm激发的双光子荧光已经实现了小鼠脑表面下1.2-1.6 mm范围内的成像深度相干拉曼散射（CRS），例如受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射，是用于深层组织成像的另一种MPM技术。SRS已用于检测和成像亚细胞和多神经元尺度的膜电位分布[89，90]，并用于成像神经肌肉接头处的神经递质乙酰胆碱[91]。尽管CRS的空间分辨率受到光衍射的限制，但基于尖端增强CRS[92，93]、CRS的抑制或饱和[94-[97]这是一个解决这个问题的方法。未来的CRS发展可能实现纳米尺度的成像，并提供与荧光纳米显微镜互补的信息。除了光吸收之外，光散射是限制成像深度的另一个问题，因为它将像差引入成像深度。Y. Wang，J. Lin，Q. Zhang等人工程16（2022）2936成像过程。自适应光学（AO）使用有源器件，如可变形反射镜和液晶空间光调制器（SLM），以补偿波前畸变，可以直接[98]或间接[99]测量。AO已经应用于单分子定位显微术（例如，PALM 和STORM）[100，101]、SIM[102]和STED显微镜[103]，导致定位精度、图像清晰度和亮度的显著改善预计对AO的新研究将继续促进荧光纳米显微镜的进步，包括MINFLUX纳米显微镜。机器学习（ML）和荧光纳米显微镜的结合提供了另一个研究方向。最近，ML已通过散射介质应用于光学成像[104]，这可能对脑深部成像有用。ML还被用于加速STORM[105]中的数据处理，并提高成像的空间分辨率[106]。此外，ML 可以与光学数字化全息术（ODH）相结合，以实现激发场矢量的按需定制[107]，这可以增强荧光纳米显微镜的灵活性随着光子忆阻器的发展，其中光学特性根据透射光而变化[108]，可以制造用于全光学神经形态计算[109-7. 结论在过去的几十年里，荧光纳米显微镜研究以快速的速度发展，预计将刺激荧光探针和标记方法的进一步发展，以实现高分辨率成像，同时减少所需的光子预算和样品的光毒性。与传统显微镜不同，荧光纳米显微镜提供了一种实现基因组尺度成像的有前途的手段，这将产生细胞行为和功能的分子基础的清晰图像。结合其他光学方法，精确建模和操纵大脑深处的神经活动，荧光纳米显微镜将继续彻底改变神经科学。MINFLUX nanoscopy将使体内成像和神经活动的跟踪，以进一步量化与纳米空间分辨率和微秒时间分辨率的突触参数。基于ML的荧光纳米显微镜具有在神经科学中提供前所未有的应用发展的潜力由于其巨大的前景，所有形式的荧光纳米显微镜将继续阐明大脑的秘密，并有助于人工智能的突破性发展。致谢顾敏感谢张江国家自主创新示范区（ZJ 2019-ZD-005）的资金支持。林健感谢国家自然科学基金（11874267）的资助。王扬云斗博士获得中国博士后科学基金（2020M671169）资助。遵守道德操守准则Yangyundou Wang 、 Jian Lin 、 Qiming Zhang 、 Xi Chen 、Haitao Luan和Min Gu声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] Purves D ， Augustine GJ ， Fitzpatrick D ， Hall WC ， Lamantia AS ，McNamara JO，et al. 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