医学信息学解锁21（2020）100471通过抑制间日疟原虫裂殖子表面蛋白-1的综合计算研究探索对抗间日疟的新治疗策略Md Ohedul Islama，*，1，Parag Palita， 1，Jakaria Shawona， 2，Md Kamrul Hasanb， 2，Araf Mahmudc，Mustafa Mahfuza，Tahmeed Ahmed a，Dinesh Mondal a孟加拉国国际腹泻病研究中心b孟加拉国Gazipur孟加拉国国立大学Tejgaon学院生物化学和分子生物学系cShahjalal科技大学遗传工程和生物技术系，锡尔赫特，3114，孟加拉国A R T I C L EI N FO保留字：裂殖子表面蛋白-1 siRNA设计分子对接分子动力学抗疟肽A B S T R A C T疟原虫属的专性红细胞内原生动物寄生虫导致疟疾的表现，疟疾是一种威胁生命的疾病，全球每年约有660，000例死亡病例。此外，疟原虫对常规使用的药物青蒿素的耐药性导致每年2.19亿例新报告病例。虽然恶性疟原虫是造成大多数疟疾死亡病例的原因，但间日疟原虫也被认为是造成疟疾相关发病率的主要原因，特别是在亚洲和拉丁美洲。在这项研究中，我们使用了两种不同的计算方法，旨在建立先进的治疗方法的发展，对间日疟的目标是表面抗原，裂殖子表面蛋白-1（MSP-1）的概念。针对MSP-1的计算siRNA设计产生了总共四种非免疫原性候选siRNA，其中一种siRNA候选物（siRNA 05）在用大量算法证实后被合理验证后被发现表现出生物学稳定和可行的三级结构。此外，分子对接分析解开了三个抗寄生虫肽命名为AP 02283，AP 02285和AP 00101显示出相当大的与MSP-1的结合亲和力，从而提供了一个明显的指示，其抗疟疾性能。MD模拟揭示AP 02283是针对MSP-1的最佳肽候选物。然而，无论这些计算机模拟结果的前瞻性大小如何，这些结果都需要通过涉及体外和体内方法的进一步严格的实验室实验进行广泛验证。1. 介绍疟疾是一个严重的全球健康负担，估计每年有2.19亿新发病例，每年造成66万人死亡[1]。它是一种由疟原虫属的专性红细胞内原生动物引起的危及生命的疾病，主要通过受感染的雌性按蚊叮咬传播给人类。感染也可以是先天性获得的，也可以通过暴露于受感染的环境而发生。血液制品，一种被称为输血疟疾的现象[2]。人类可被疟原虫属的五种中的一种或多种感染，包括：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫。间日疟原虫在亚洲和拉丁美洲的不同地区最为流行，在少数地方间日疟原虫仅传播[3]。与恶性疟原虫不同，间日疟原虫感染的特征是低血期寄生虫血症，在疾病表现和休眠肝期之前出现配子体并导致复发[4]。* 通讯作者。电子邮件地址：ohedul. icddrb.org（M.O.伊斯兰教），parag.palit@ icddrb.org（P. Palit），jakaria. icddrb.org（J. Shawon），gmail.com（M.K.Hasan），arafmahmood005@gmail.com（A. Mahmud），mustafa@icddrb.org（M. Mahfuz），tahmeed@icddrb.org（T. Ahmed），din63b@icddrb.org（D.Mondal）。1 作者贡献相等。2 作者贡献相等。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100471接收日期：2020年7月9日;接收日期：2020年10月30日;接受日期：2020年10月31日2020年11月4日网上发售2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imu作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004712开发有效的抗疟疗法已成为一项重大的公共卫生挑战。急性临床疟疾通常危及生命，与循环红细胞中无性血液阶段寄生虫的复制有关[5]。新的抗疟疾药物开发的进展已经揭示了称为裂殖子表面蛋白-1（MSP-1）的疟原虫MSP-1在寄生细胞膜上表达为高分子量（180 kDa）表面蛋白，其经历严格的蛋白水解切割和转化，最终导致裂殖子从裂殖体的转化。这种加工改变了MSP-1的二级结构，赋予其与称为血影蛋白的细胞骨架蛋白结合以介导红细胞破裂的能力[10]。对该基因的结构研究表明，该分子的部分是保守的[9]。这种寄生细胞表面蛋白已在许多先前的研究中用作药物开发的靶标，这些研究使用从临床病例中分离的纯化调理抗体[11]，以及来自体内和体外研究，这些研究使用小分子靶向并抑制疟原虫寄生虫的MSP-1的活性[12]。一种针对多种疾病的新兴治疗方法例如，涉及通过使用siRNA分子利用转录后基因沉默的手段[13]。siRNA的核心作用是通过干扰蛋白质实现转录后基因沉默，其基本机制是结合并促进特定序列处信使RNA（mRNA）的降解[14]。使用计算工具设计有效的siRNA候选物已用于设计针对其他寄生虫的潜在治疗候选物，包括杜氏乳杆菌[15]和刚地弓形虫[16]。相反，抗微生物肽的使用代表了一种新的治疗后策略，以对抗微生物侵染并降低抗微生物抗性发展的发生率。抗微生物肽（AMP）是无脊椎动物和脊椎动物的先天免疫系统中普遍存在的宿主防御分子[17，18]。它们形成宿主防御病原性感染的第一道防线，是先天免疫系统的关键组成部分。由于这些古老的分子在数百万年后仍然有效，因此它们被认为是开发新一代抗菌剂以对抗许多抗生素耐药性超级细菌和寄生虫的重要模板。宿主昆虫和一般节肢动物，作为这种寄生虫的水库，已经开发出一种与这种寄生虫共存的方法。因此，这些生物体是抗寄生虫化合物的前景的有希望的来源，作为治疗原生动物相关疾病的替代方法[20]。在已经分离和研究的分子中，有对寄生虫具有高活性的蛋白质和肽，能够抑制不同发育阶段的寄生虫活性[21，22]。虽然研究仍在迈出第一步，但初步结果显示了寄生虫病治疗的新前景。设计有效的候选疫苗可能是主要的间日疟治疗方法的发展选择;这一策略的有效性当然有许多限制。 寄生虫细胞进化出复杂手段以通过消除大量抗原多态性和变异来逃避冗余寄生虫配体的抑制作用的前景表明，许多候选疫苗赋予的强回忆抗体应答的引发可能在限制疟原虫（包括间日疟原虫）的致病性方面无效[23]。此外，设计抗间日疟的潜在治疗性抗体的前景受到实验室发现的阻碍，这些发现表明抗恶性疟原虫MSP-1保守序列的抗体已显示不能提供抗疟疾临床表现的保护[24].计算方法被认为是一种有效的手段，的打击设计Therapeutics对耐多药微生物[25]。在最近的一项研究中，计算方法已用于鉴定潜在的抗微生物肽，并已在耐药鲍曼不动杆菌的情况下进行[26]。在目前的研究中，我们使用了两种不同的潜在治疗方法来靶向间日疟的MSP-1，目的是抑制MSP-1并建立针对间日疟的抗疟治疗新方法。本研究中使用的这些下一代治疗方法之一涉及潜在功能性siRNA载体的设计及其随后的验证，随后使用大量严格的计算工具和算法最终沉默MSP-1基因的表达。我们使用的另一种方法涉及纯化的抗寄生虫肽的计算评估，其可以作为用于开发间日疟的治疗后选择的方便的替代方案。在通过分子对接和分子动力学（MD）模拟研究评估这些肽的预测功效之前，通过计算评估肽的潜在变应原性。由于食品（转基因食品），治疗剂和生物制药中存在修饰蛋白，过敏蛋白的预测在当前非常相关[27]。因此，分子对接和MD模拟是最令人印象深刻的计算模拟过程之一，以检查配体-蛋白质复合物的稳定性以及配体与蛋白质的结合稳定性。我们利用这一点来评估我们的前3种肽-蛋白质复合物的RMSD、RMSF、Rg、自由结合能。2. 方法和材料本研究的工作流程概述见图1。 12.1. 方法I：设计潜在的siRNA候选物2.1.1. 序列检索和分析以及多序列比对从国家生物技术信息中心（www.example.com）的基因库数据库中检索https://www.ncbi.nlm.nih来自总共92个间日疟原虫分离株的msp-1基因序列的完整cds。gov/）。使用Clas-talO（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行随后的多序列比对。2.1.2. 靶点鉴定和潜在siRNA候选物siDirect 2.0（http://sidirect2.rnai.jp/）是一种有效的靶特异性siRNA设计工具，用于靶鉴定和siRNA设计[28]。在siDirect 2.0中，第一代siRNA设计算法， 即： Ui-Tei，Amarzguioui，Reynolds 规则与熔化温度低于21.5摄氏度被认为是绝对参数，潜在的siRNA双链体形成。此外，在这些第一代算法的概念上还考虑了其他组件，如表1所示。通过使用i-SCORE Designer软件进一步验证从siDirect 2.0获得的潜在siRNA候选物[29]。该在线软件采用三种重要的第二代算法，即：SCORE、s-Biopredsi和DSIR，以及第一代至第一代siRNA设计算法（Ui-Tei、Amarzguioui、Reynolds规则）。在使用i-SCORE Designer软件验证从siDirect 2.0获得2.1.3. 相似性搜索和目标对齐使用BLAST工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）检查其他非靶向生物体（尤其是人类）基因组中的任何脱靶序列相似性。通过应用预期阈值10和BLOSUM 62矩阵作为参数，对整个Genebank数据库使用BLAST。作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004713=表1Fig. 1. 研究工作流程。使用DNA/RNAGC含量计算器（http://www.endmemo.com/bio/gc.php）计算2.1.5. 通过热力学计算RNA-RNA相互作用并可视化siRNA-靶标结合为 了 研 究 预 测 的 siRNA 与 其 靶 标 之 间 相 互 作 用 的 热 力 学 ，RNAcofold程序（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAcofold）[31]。该程序计算两个RNA序列的杂交能量和碱基配对。RNAcofold遵循McCas- kill划分的功能算法来计算双链体结构的碱基配对概率、实际通信能量和平衡浓度。2.1.6. 双联式制冷剂热容及浓度图的计算使 用 DINAMelt 服 务 器 计 算 热 容 图 和 浓 度 图（http://unafold.rna.albany.edu//? qDINAMel t/Hybrid 2）用于预测的siRNA [30]。将热容（Cp）绘制为温度的函数，其中指示熔化温度Tm（Cp）。详细的热容量图也显示了每种物质对总体热容量的贡献，而浓度图-Tm（Conc.），双链分子的浓度为其最大值的一半的点定义解链温度Tm（Conc.）。使用RNAstructure（www.example.com）可视化靶序列和siRNA之间形成的二级结构https://rna.urmc.rochester。edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html ） 网 络 服 务 器[32]。该工具通过计算配分函数生成siRNA和靶标相互作用的二级结构，预测最大自由能结构以及最大预期准确度。2.1.7. 候选siRNA分子使用OligoWalk（http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi）（一种用于计算有义-反义杂交的热力学特征的在线服务器）来预测所设计的siRNA分子的功能效率以及它们各自的靶标可获得性。从以下获得的输出该工具以“End-diff（siRNA反义链5 ′端和3 ′端之间的自由能差异）“的形式遵循指定查询 表示 的 功能 效率 的 的 siRNA候选物在这里，“断塔”。ΔG（在与靶互补的区域中打开碱基对的自由能成本）“表示设计的siRNA的靶可及性[ 33 ]。该工具返回的另一个结果，即第一代siRNA分子合理设计的算法和规则2.1.8. 预测siRNA为了进一步验证设计的siRNA有义链5′反义链5′端的G/C5′端7个氨基酸有义链的bp无GC延伸更长9个核苷酸。双链体末端A/U差异>05′有义链强结合位置1没有U。在位置6处存在A3′端弱结合搁浅。位置19处无G每个规则被分配一个分数，该分数被加总为总双链体分数以提高siRNA的效率候选人，siRNAPred服务器（http://crdd.osdd.net/raghava/sirnapred/index.html）用于验证预测的siRNA种类。使用支持向量机算法和二进制模式预测方法针对Main21数据集评估预测的siRNA。siRNAPred评分大于1预示着非常高的疗效，评分范围为0.82.1.9. 设计的siRNA候选物的免疫毒性预测的mrna （https://webs.iiitd.edu.in/raghava/imrna/sirna.php）， 一个web2.1.4. 二级结构预测和GC含量计算预测了siRNA的二级结构和折叠自由能使用的mfold服务器（http://unafold.rna.albany.edu/?q= m倍） [30个] 只有那些 siRNA候选物显示 积极的折叠自由能（正ΔG）受GC含量的影响使用包含对设计基于RNA的治疗剂重要的各种模块的基于服务器来预测所设计的siRNA候选物的免疫原性[34]。默认阈值IM评分4.5用于预测设计的siRNA候选物的免疫原性/免疫毒性作用作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004714++++-2.1.10. 三级（3D）结构设计和验证使用RNA-Composer（http://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/）对已经通过免疫吸附性过滤器的候选siRNA序列进一步进行三级结构预测。RNAComposer是一种自动化的3D结构预测工具，可以从给定的siRNA序列中模拟潜在的3D结构[35，36]。 预测的3D结构用MOLprobityweb 服 务 器 （ http ： //molprobity. biochem.duke.edu/ ） 。MOLProbity使用3D siRNA的PDB文件来预测所有原子接触和几何形状、RNA糖皱褶、RNA骨架构象、氢键和范德华力，以确定最精确的3D模型结构[37]。2.2. 方法II：抗寄生虫肽作为抗疟疾药物2.2.1. AMP序列检索和过滤APD 3（http://aps.unmc.edu/AP/main.php）是所有抗寄生虫肽（包括抗疟疾肽）的综合数据库[18]。共检索到78个抗寄生虫肽和25个抗疟疾肽的氨基酸序列。发现与抗寄生虫肽共有或重叠的抗疟疾肽从研究中丢弃。2.2.2. 致敏性预测考虑到人类免疫系统及其过敏防御机制，任何外源肽序列都是非过敏性的是非常重要的[38]。因此，通过基于其变应原性过滤可引起可能的过敏反应的肽来避免它们。为此，将肽序列进行Algpred（http://crdd.osdd.net/raghava/algpred/index.html），这是一种在线工具，允许基于已知表位与肽序列任何区域的相似性预测过敏原[39]。将单个参数设置为混合选项，允许服务器使用组合方法（SVMc IgE表位ARPs BLAST MAST）预测过敏原。该组合算法探索了外源肽通过引发特异性IgE抗体应答或通过与任何宿主的交叉反应诱导I型超敏反应的前景。组件[39]。2.3. 抗寄生虫肽与MSP-1的分子对接2.3.1. 肽的3D结构的生成选择非过敏性肽序列作为Pepfold服务器（http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/）中的输入，以生成肽3d结构。在Pepfold服务器中，使用的模拟次数为200，sOPEP分选模型设置为默认参数。2.3.2. MSP-1三维结构检索MSP-1 （ 2NPR ） 的 蛋 白 质 结 构 从 ProteinDataBank（https://www.rcsb.org/）数据库下载。该结构（2NPR）基本上是在红细胞侵入期间从C-末端MSP- 1亚基MSP-1（42）裂解的15 kDa亚基MSP-1（19）。2NPR包括MSP-1的20个状态，并通过使用PyMOL状态1以PDB文件格式保存用于下游分子对接分析。2.3.3. 分子对接模拟MSP-1 （ 2NPR ） 针 对 所 选 肽 的 分 子 对 接 使 用 PatchDock（https://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/）服务器连同FireDock对接服务器（http://bioinfo3d.cs.tau.ac。il/FireDock/），一个用于优化PatchDock输出的优化和重新评分工具。将MSP-1（19）结构（2NPR）连同PDB格式的单个肽结构上传到PatchDock服务器中用于初始计算，并将前10个所得对接解决方案直接上传到FireDock服务器用于进一步计算。在对接后进行相互作用分析，以观察肽是否保留在结合口袋中，使用Antrys Discovery Studio [40]。2.3.4. 分子动力学模拟对得分最高的3种蛋白质-肽复合物进行分子动力学（MD）模拟。MD模拟可用于评估结合肽与表面蛋白的动力学行为。这可能潜在地预测结合形成的稳定性并提供对该过程的洞察。在GROMACS [41] 2020.1软件包中进行肽-蛋白质复合物的MD模拟。 模拟在Charmm36 [42]力场中进行。每个复合物与SPC水分子在立方体中溶剂化。加入Na和Cl离子以中和该体系。在1000 kL mol-1 nm-1的容限下，进行能量最小化。用恒定的粒子数、体积和温度（NVT）以及恒定的粒子数、压力和温度（NPT）对系统进行平衡，每次持续1ns。然后对系统进行100 ns模拟。还对MSP-1蛋白进行了100 ns MD模拟。对MD仿真轨迹进行了分析，绘制了根轨迹均方差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和回转半径（Rg）。RMSD图预测模拟中的结构与参考结构的偏差。RMSF预测了不同残基中的涨落，回转半径预测了结构的紧凑性。比较3种复合物与MSP-1apo蛋白的RMSD、RMSF和Rg图，以评价最佳结合结构。2.3.5. MM-PBSA计算为了评估肽与蛋白质的结合，从模拟轨迹评估蛋白质-肽复合物的自由结合能。分子力学-泊松玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）[43]方法用于该过程。g_mmpbsa工具[44]用于通过使用MD模拟轨迹计算复合物的自由结合能。计算采用了从模拟轨迹的最后20 ns中提取的100个快照。3. 结果3.1. 治疗方法I：针对MSP-1的siRNA设计3.1.1. MSP-1核苷酸序列收集和多序列比对从NCBI Nucleotide获得来自92个不同间日疟原虫分离株的msp-1的完整基因序列。随后使用Clustal Omega进行的多重序列分析揭示了总共17个保守序列（在补充文件01中示出），通过该方法将其用于进一步分析。3.1.2. 通过第一代和第二代算法在下一步中使用基于网络的高效siRNA计算工具siDirect 2.0。所有17个保守序列作为siDirect 2.0的输入序列，以设计具有降低的脱靶沉默概率的该工具预测了针对所有17个保守序列的总共36种不同的siRNA分子这些结果在以下所有三种控制siRNA序列偏好的第一代算法的基础上进一步过滤，即：Ui-Tei、Amarzguioui和Reynolds规则（U、R、A规则）。在所有这36个预测的siRNA分子中，发现只有12个siRNA完全符合所有三种算法，即U，R，A规则（表1）。在这12个候选siRNA候选物中，从第一个通过siDirect 2.0返回的第二代算法分析，发现仅9个siRNA候选物（siRNA 02、03、04、05、06、07、08、10和12）满足由组合的第二代算法设定的90%阈值，随后是i-SCORE Designer软件。从第一代和第二代算法获得的分析结果，作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004715siRNA设计已在表2中示出。使用NCBI BLAST程序确认siRNA最小化的脱靶相似性3.1.3. siRNA候选物的折叠自由能和二级结构预测由于siRNA的功能也严重依赖于分子结构，因此在预测RNA二级结构的计算方法中做出了相当大的努力[45]。最小自由能（MFE）被认为是siRNA分子结构准确性的基准[46]。自由能最小化是计算结构生物学中长期建立的范例，其基于以下假设：在平衡时，潜在分子折叠问题的解决方案是唯一的，并且分子折叠到最低能量状态[47]。在该分子评估过程中，通过使用mfold服务器来检查预测的siRNA引导链的稳定性，计算折叠的最小自由能（表2）[30]。这里，在满足第一代和第二代算法设定的阈值的总共9种siRNA候选物中，发现8种siRNA候选物（siRNA 02、03、05、06、07、08、10和12）表现出正的折叠自由能，因此考虑用于进一步的下游分析（表2）。这些预测的siRNA候选物的二级结构已显示在图1中。 二、3.1.4. 预测siRNAsiRNA的GC含量是其二级结构潜力稳定性的决定因素，并且30在该研究中，来自DNA/RNA GC含量计算器的结果显示，在已经满足siRNA设计的第一代和第二代算法的参数并且已经表现出正的折叠自由能的8个预测的siRNA候选物中，GC含量在30-60%的推荐范围内（表3）。3.1.5. 热稳定性分析DINAMelt网络服务器可以预测任何作为温度的函数的整个平衡解链曲线，其中具有核酸的杂化对的解链温度。热容量或Tm（Cp）表示为温度的函数，而Tm（Conc）是核酸的温度达到其最大值的一半[30]。已知二级结构确实可以引起RNAi的抑制[49]。在本研究中，所有预测的siRNA均显示Tm（Cp）和Tm（Conc.）约80℃（表3），明显高于体内生理温度（37.4℃）。3.1.6. RNA-RNA结合能计算RNA-RNA结合能的可靠预测对于深入了解RNAi分子与靶mRNA的结合至关重要。RNAcofold是来自Vienna RNA webservers的程序，其用于计算两个RNA序列的杂交能量和碱基配对模式[50]。这种RNA-RNA相互作用的热力学可以理解为两种能量贡献的总和：(1) “打开”结合位点所需的能量因此，RNA-RNA结合的精确计算处理是功能靶标预测算法的组成部分。对于单个siRNA，程序注释两个序列，即序列A和序列B，并将它们与标签连接到该特定连接。除了异二聚体的最小自由能（ΔGAB）之外，序列A和序列B的异二聚体的自由能（ΔGA和ΔGB）可以使用以下等式[31]计算。Δ G结合=ΔGAB- ΔGA使用该方程计算结合自由能（Δ G结合）。例如，对于靶序列1和其预测的siRNA的相互作用，结合自由能为-Δ G结合=ΔGAB- ΔGA- ΔGB=-33.955671kcal/mol-（-0.543202kcal/mol）-（-0.417886kcal/mol）=-32.99千卡/摩尔对其余靶序列及其预测的siRNA进行RNAcofold，并根据默认参数设置计算自由结合能。表3中报告了已经通过阈值的每种siRNA候选物的结合自由能，所述阈值由迄今为止使用的大量工具和算法设定。表3中报道的所有siRNA候选物均已定义表2通过用于设计siRNA的第一代和第二代算法分析的有效siRNA分子以及它们各自的折叠自由能。siRNA靶序列预测的siRNA双链体siRNA候选物在37℃（5′至3′）组合第二代算法siRNA折叠的自由能（Kcal/mol）1GAGCTACGAAGAATTCAATCAAC UGAUUGAAUUCUUCGUAGCUC 90%阈值GCUACGAAGAAUUCAAUCAAC2GTCCAGAATCTTCTTAAGAATGC AUUCUUAAGAAGAUUCUGGAC> 90%阈值0.50CCAGAAUCUUCUUAAGAAUGC3AAGGGAAATTGACAAGTTGAAGG UUCAACUUGUCAAUUUCCCUU> 90%阈值3.40GGGAAAUUGACAAGUUGAAGG4>90%阈值-1.60奇瓜库奇奥奥加库5ATCCCAAATTGACAAGTACAACG UUGUACUUGUCAAUUUGGGAU> 90%阈值1.30CCCAAAUUGACAAGUACAACG6CTGAAGAAGAAGCTACAAGTATC UACUUGUAGCUUCUUCAG> 90%阈值1.60GAAGAAGAAGCUACAAGUAUC7TGGAAAGTACAAGCTCAAATTGG AAUUUUGAGCUUGUACUUCCA> 90%阈值1.60GAAAGUACAAGCUCAAAUUGG8AAGGAAGATTAGGAAAGAACATC UGUUCUUUCCUAAUCUUCCUU> 90%阈值4.50GGAAGAUUAGGAAAGAACAUC990%阈值CUAGCCGGAAUGUACAAA10AACGATAAAGAAGCAATTGGAAA UCCAAUUGCUUUAUCGUU> 90%阈值3.10CGAUAAAGAAGCAAUUGGAAA1190%阈值CACGUAAACGYUUAACACU12CTCTGATTTGAACCCATTTAAGT UUAAAUGGGUUCAAAUCAGAG> 90%阈值0.70CUGAUUGAACCCHUUAAGUa从用于siRNA设计的第二代评分工具的结果获得的组合评分，即：i-SCORE、s-Biopredsi和DSIR。作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004716图二、 从Mfold网络服务器获得的8种不同siRNA的预测二级结构。表3设计的siRNA分子具有其各自的siRNA与靶标结合的自由能、热力学特征、功能效率、靶标可及性和设计的siRNA的有效性。有效性- -- -- -- --- -- -asiRNA反义链5′端和3′端之间的自由能差b在与靶标互补的区域中打开碱基对的自由能成本（IMscore= 6）表2中每个预测的候选siRNA的相应编号。3.1.7. siRNA与靶标之间的可视化二级结构siRNA及其相应靶标的二级结构不仅为RNA-RNA相互作用的结构而且为 RNA-RNA 相 互 作 用 的 热 力 学 提 供 了 方 便 且 易 于 计 算 的 估 计 。RNAstructure程序通过最小化折叠自由能预测靶-siRNA双链体结构折叠结构的预测在最方便的温度是37℃。描述了我们的候选siRNA分子与其相应靶标之间的图3.第三章。3.1.8. 功能效率和目标可及性的预测所设计的siRNA候选物的功能效率和靶可及性的结果已显示在表3中。在表3中，每种分析的siRNA候选物的得分表示为diff“评分往往具有更高的功能效率[ 33 ]。尽管如此，我们所有的候选siRNA分子都表现出阳性的在设计的siRNA候选物中，siRNA 03和siRNA 05导致最高的另一方面，每个候选siRNA的相应值在表3中表示为“断裂靶”。ΔG/在与靶标互补的区域中打开碱基对的自由能成本因此，具有较低负性“断裂靶”的siRNA候选物。ΔG“评分更接近目标。表3中所示的另一个评分，即siRNA靶序列GC内容TmCp（0C）Tm浓度结合自由能端差a停-停。有效概率siRNA免疫原（%）（0℃）目标值（千卡/ΔGbsiRNA评分摩尔）（二进制）02GTCCAGAATCTTCTTAAGAATGC33.3379.078.2-30.192.16-1.200.9300.906免疫原03AAGGGAAATTGACAAGTTGAAGG33.3380.779.432.092.330.400.9620.909免疫原05ATCCCAAATTGACAAGTACAACG38.1083.282.033.332.330.200.944（IMscore= 4.6）0.925非免疫原性06CTGAAGAAGAAGCTACAAGTATC33.3381.880.431.531.470.90.946（IMscore= 2.8）0.987免疫原07TGGAAAGTACAAGCTCAAATTGG33.3381.279.832.701.871.00.871（IMscore= 6.9）0.878非免疫原性08AAGGAAGATTAGGAAAGAACATC33.3380.278.931.501.70.000.926（IMscore= 3.2）0.978非免疫原性10AACGATAAAGAAGCAATTGGAAA30.4380.278.931.500.460.400.890（IMscore= 3.9）0.948免疫原12CTCTGATTTGAACCCATTTAAGT33.3380.078.831.601.601.50.928（IMscore= 6.9）作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004717图三. 预测的二级双链体结构是由于单个siRNA及其相应靶序列的结合而形成的。每种颜色代表siRNA分子的每个核苷酸与其靶标结合的相应概率。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版见图4。从RNA-Composer获得并通过MOLProbity web服务器验证的siRNA 05的三级结构。发现该结构满足MOLProbity网络服务器为验证设置的所有阈值分数，包括所有原子接触和核酸化学的阈值分数。设计的siRNA候选物的可及性[33]。根据我们的分析，所有设计的siRNA候选物基于该标准返回高分，从而表明我们所有的候选siRNA分子被预测具有高功能效率和实质性的靶可及性。3.1.9. 预测siRNAsiRNA有效性评分已显示在表3中。根据二元模式预测方法，所有预测的siRNA均表现出0.8至1.0之间的有效性评分，表明与靶标结合的高效力3.1.10. siRNA候选物在分析用于预测免疫原性/免疫原性的8个总siRNA候选物中，基于用于评估查询siRNA序列的潜在免疫原性的默认阈值IM评分设置，发现4个siRNA候选物是非免疫原性的这些被预测为非免疫原性的siRNA候选物是（表3）siRNA 05、siRNA 08、siRNA 10和siRNA12，其经受涉及稳定三级结构预测的进一步下游分析。3.1.11. 3D结构设计和验证使用 RNAComposer为通 过免疫 原性过 滤器的 四种siRNA 候选 物（siRNA 05、siRNA 07、siRNA 08和siRNA 12）中的每一种生成单独的3D 结 构 ，并 将 这 些单 独 的3D 结 构 保存 为PDB 格 式 ，以 用 于 使用MOLProbity网络服务器的下游验证步骤。这四种siRNA候选物的各个三级结构的验证分数已在补充文件02中显示。在产生的3D结构中，只有siRNA 05显示出中等的冲突分数/每1000个原子的严重空间重叠的数量（>0.4 μ m），而所有其他siRNA候选物显示出不可接受的冲突分数以及无法通过其他验证分数（补充文件02）。3.2. 治疗方法II：抗寄生虫肽作为抗疟疾药物的评价3.2.1. 肽序列检索和抗原性预测从APD 3数据库中，共检索到101种抗寄生虫肽和25种抗疟疾肽。发现这些肽中的大多数是两栖动物或节肢动物来源的，已知它们是抗微生物肽的主要来源[18]。发现这25种抗疟药与从数据库获得的抗疟肽列表重叠，随后从研究中排除。对剩余的抗寄生虫肽中的76种进行了变应原性测试，发现其中10种具有非过敏性特征，并选择其进行进一步分析（表4）。作案手法Islam等人医学信息学解锁21（2020）1004718-±-±表4从AMP数据库检索的具有非过敏特性的抗寄生虫肽序列及其来源。肽ID（AMP ID）源序列AP00101两栖动物FVQWFSKFLGRILAP00146节肢动物GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQAP00190合成HPLKQYWWRPSIAP00367牛GGLRSLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRIGAP00672节肢动物DCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEGRSSGHCSPSLKCWCEGCAP00686哺乳动物KRFGRLAKSFLRMRILPRRKILLASAP01699节肢动物GRGREFMSNLKEKLSGVKEKMKNSAP02283两栖动物SLFGTFAKMALKGASKLIPHLLPSRQQAP02284两栖动物GVFGLLAKAALKGASKLIPHLLPSRQQAP02285两栖动物KLGFENFLVKALKTVMHVPTSPLL3.2.2. 肽3D结构生成PEP-FOLD生成信息报告，以指导用户选择最佳型号[52]。该服务器为每个查询序列预测一个结构簇。根据它们的sOPEP得分定义簇等级，并且将得分最高的结构作为PDB下载用于对接分析。3.2.3. 抗寄生虫肽与MSP-1的PatchDock提供了具有精细评分的肽-2NPR的对接复合物。前10个复合物被定向到FireDock，并具有细化分数，用于在全局能量方面进一步增强和重新评分（即，溶液的结合能）。尽管具有相当大的全局能量，但6种肽-2NPR复合物被列为最终结果，4种被淘汰，因为未发现它们与蛋白质的预期位点结合。基于我们的对接研究，所有6种肽均显示出良好的结合能，与不同研究组先前报道的至少一个确切的结合沟氨基酸相互作用[53，54]。我们使用disparation studio visualizer找到msp-1最可能的相互作用氨基酸（表5）。肽和MSP-1对接的交互式图像通过discovery studio visualizer 进 行 说 明 并 描 绘 在 图 5 中 。 AP02285 、AP00190和AP02284显示最大相互作用表5使用PatchDock和Firedock，Global Energy和Interactive Amino Acids对接肽对2NPR。粗体字母中的氨基酸是msp-1结合沟中的匹配结合氨基酸根据与MSP-1结构、结合沟和抑制剂的选择相关的其他组的先前研究，具有靶氨基酸残基。3.2.4. 分子动力学模拟使用肽作为治疗药物的类似研究的文献综述[55，56]表明，分子动力学模拟可用于辅助肽设计过程。在我们目前的工作中，我们对前03种蛋白质-肽复合物和脱辅基蛋白进行了MD模拟，以评估肽的结合及其相互作用。图6表示MSP-1_AP 02283和MSP-1_AP 00101模拟前后肽的定位。在MSP-1_AP02283中，MD模拟前后复合物AP 02283几乎保持在相同位置，但AP 00101没有。复合物的RMSD图（图7a）显示MSP-1_AP 02285复合物的结构存在主要偏差，这表明肽与MSP-1蛋白的不稳定结合。另外两种蛋白-肽复合物i.e. MSP-1_AP02283和MSP-1_AP00101最初显示偏离，随后在70 ns后稳定，并在模拟过程的其余部分保持稳定。AP02283在约70 ns处显示最高峰（1.1 nm），但随后稳定并接近脱辅基蛋白的峰，并在剩余的运行时间内保持在那里。这表明肽AP 02283的结合在结合时不会使蛋白质的整体结构稳定性不稳定，因为RMSD在大部分模拟时间内保持在1 nm以下。RMSF（图）MSP-1_AP02
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