工程6（2020）1276研究医用添加剂制造-制品3D打印多细胞组织工程细胞容器状支架王晓雅a，b，#，张梦a，b，#，马敬戈a，b，徐梦驰a，b，蒋畅a，b，迈克尔·格林斯基c，Chengtie Wua，b，吴成铁中国科学院上海硅酸盐研究所高性能陶瓷及超细结构国家重点实验室，上海200050b中国科学院大学材料科学与光电子工程研究中心，北京100049c德累斯顿工业大学卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯医学院附属医院骨、关节和软组织转化研究中心，德累斯顿01307，德国阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2019年12月6日修订2020年5月10日接受在线预订2020年保留字：3D细胞容器非接触多细胞共培养相互作用血管生成A B S T R A C T开发一种能够模拟人体组织体内细胞微环境的工程化非接触多细胞共培养模型仍然具有挑战性。在这项研究中，我们成功地制造了一个细胞容器状支架组成的b-磷酸三钙/羟基磷灰石（b-TCP/HA）生物陶瓷，包含四种不同的孔结构，包括三角形，正方形，平行四边形，和矩形，通过三维（3D）打印技术。这些支架可用于以非接 触方 式同 时培 养四 种类 型的 细胞 。 构建 了由 人骨 髓间 充质 干细 胞（ HBMSCs） 、人 脐静 脉 内皮 细胞（HUVECs）、人脐静脉平滑肌细胞（HUVSMCs）和人真皮成纤维细胞（HDFs）组成的三维共培养模型，以研究这些细胞在成骨和血管生成中的单独或协同作用结果表明，与单一细胞类型相比，三种或四种细胞在三维细胞容器中共培养的细胞增殖率更高对HBMSCs和HUVECs之间细胞-细胞相互作用的详细研究表明，具有四个独立空间结构的3D细胞容器通过放大共培养细胞的旁分泌效应来此外，与单细胞培养模式和双细胞共培养模式相比，在三维细胞容器中分别建立3种细胞和4种细胞的多细胞非接触培养体系，在促进成骨和血管生成分化方面具有明显优势。这项研究提供为开发基于支架的多细胞非接触共培养系统用于组织再生提供了新的方向。©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍组织工程的最终目标是获得在结构和功能水平上与天然相似的组织或器官[1然而，到目前为止，组织工程技术在模拟生物组织的复杂结构和功能方面仍然面临挑战[4，5]。人体组织含有200多种细胞类型，这些组织中的大多数由多种细胞组成，这些细胞是维持正常组织功能所必需的。因此，目前不可能构建复杂的*通讯作者。电子邮件地址：chengtiewu@mail.sic.ac.cn（中国）Wu）.#这些作者对这项工作做出了同样的体外三维（3D）组织和器官[6]。因此，开发类似于体内细胞小生境的体外细胞培养模型以研究细胞增殖、分化和细胞行为的体外模型在模拟天然组织和器官中起着关键作用。常规的二维（2D）细胞培养模型如细胞培养板不能为细胞提供适当的微环境以维持自然形态或有效的通信[7，8]。在2D表面上培养的细胞被认为显示出改善的细胞增殖，但抑制细胞分化[9]。此外，天然组织是由两种或多种类型的细胞组成的复杂系统，这些细胞通过生命运动相互交流[10]。虽然在细胞上建立共培养系统https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.08.0012095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng··××××X. Wang等/ Engineering 6（2020）1276-12841277培养板可以增强因此，需要一个更合适的工程模型来创造生长条件和解决问题。以前，已经开发了3D细胞培养模型，以根据组织结构和功能，以无支架或基于支架的培养系统的形式提供相对自然的形态和细胞功能已知骨组织是一种复杂系统，其包含响应于机械和生理刺激而在细胞外基质中有序排列的多种类型的细胞[13]。基于支架的培养系统是有利的，因为它们提供机械支持和组织连续性。因此，基于支架的共培养系统已被建立用于研究细胞-细胞相互作用以及骨组织再生中的个体或协同效应。例如，在b-磷酸三钙（b-TCP）支架上共培养人 骨 髓 源 性 间 充 质 干 细 胞 （ HBMSC ） 和 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞（ HUVEC ） 比 HBMSC 单 一 培 养 物 表 现 出 更 高 的 碱 性 磷 酸 酶（ALP）活性[14]。然而，大多数基于支架的共培养系统将不同类型的细胞混合在一起，使得不可能分别区分直接细胞间接触和旁分泌效应的具体贡献[15]。此外，人体组织中的各种细胞通常表现出一定的非接触空间排列，因此简单地将细胞混合在一起并不能准确地模拟它们的体内状态[7]。对于间接共培养系统，已经通过不同类型的剪接使用了双纺支架[16]和多层水凝胶[17]然而，据我们所知，包括三种或四种不同类型的细胞的非接触共培养模型尚未建立。很难在集成支架中建立非接触式多细胞共培养系统，该系统可以允许细胞在3D环境中与其周围环境相互作用3D打印技术提供了一个有价值的途径，分割复杂结构支架的制造，这些支架可以作为细胞载体，以实现精确的细胞接种[18]。在这项研究中，我们制造了一个b-TCP/羟基磷灰石（HA）双相生物陶瓷细胞容器，具有四种不同的孔结构，包括三角形，正方形，平行四边形和矩形集成在一起，通过3D打印技术。将骨相关 细 胞 包 括 HBMSCs 、 HUVECs 、 人 脐 静 脉 平 滑 肌 细 胞（HUVSMCs）和人真皮成纤维细胞（HDFs）接种于细胞容器的不同孔中，以研究它们在成骨和血管生成中的单独或协同作用。将4种细胞同时接种于2D细胞培养板中作为对照。据我们所知，这是第一个报告的四细胞非接触共培养系统在一个单一的集成细胞容器，模仿骨组织中的细胞龛。本工作为研究多细胞间相互作用机制提供了一个研究模型，并为开发以组织再生为最终目标的基于支架的多细胞共培养系统指明了方向。2. 材料和方法2.1. 材料b-TCP/HA粉末购自昆山中技新材料有限公司，Ltd.（中国），并通过200目筛过滤。将Pluronic F-127（Sigma-Aldrich，USA）溶解以形成20重量%水溶液作为粘合剂。然后通过将4gb-TCP/HA与100 g H2O混合来制备均匀的可印刷油墨。2 g Pluronic F-127溶液。2.2. 3D细胞容器利用计算机辅助设计（CAD）设计了一个整体框架，该框架分为四个部分，具有不同的孔结构，包括三角形，正方形，平行四边形为了确保细胞容器能够将四种不同的细胞类型独立地容纳在相应的部分内，所有的壁、底部和不同微结构部分之间的边界都是无缝连接的。用于研究细胞增殖的细胞容器的尺寸为12 mm × 12 mm × 4.8mm，而用于细胞分化实验的细胞容器设计为24 mm × 24 mm × 4mm ， 几 何 形 状 相 似 。 然 后 使 用 基 于 挤 出 的 BioScaffolder（GeSiM，Germany）制造细胞容器。为了使挤出线材一致和连贯，在室温下将打印头的移动速度设定为4-在印刷过程之后，将生坯体在室温下干燥24小时，然后在1100 °C下以2 °C min-1的加热速率烧结3小时，以获得纯陶瓷电池容器。2.3. 3D细胞容器通过X射线衍射（XRD; D8 ADVANCE，Bruker，Germany）测量b-TCP/HA电池容器的相组成通过数码相机（Nikon，日本）观察细胞容器的三个正投影视图，而通过光学显微镜（S6D，Leica，德国）表征四种显微结构。2.4. 细胞培养及多细胞共培养体系的建立HBMSC和HBMSC培养基购自Cyagen Biosciences Inc.（中国）。根 据 先 前 描 述 的 方 法 分 离 HUVEC[19] 并 在 内 皮 细 胞 培 养 基（Sciencell，USA）中培养。HUVSMC和平滑肌细胞培养基购自STEMCELL technologies Inc.（加 拿大） 。根据先 前的方 法获得HDFs[20]并在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（高葡萄糖，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中生长。细胞增殖实验的细胞接种密度为50 000个细胞/支架，定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）实验的细胞接种密度为800 000个细胞/支架，这对于单培养或共培养都是常数。对于双细胞共培养，将HBMSCs接种在支架的矩形和正方形 部 分 ， 而 将 HUVEC 接 种 在 支 架 的 三 角 形 和 三 角 形 部 分 。HBMSCs和HUVECs的接种比例为1：1。 对于三细胞共培养，将HBMSCs接种在支架的矩形和正方形部分，而将HUVEC和HUVSMC分别接 种 在 支架的三 角 形 和 三 角 形 部 分 。 HBMSC 、 HUVEC 和HUVSMC 的接种比例为 2 ： 1 ： 1 。 对 于 四 细 胞 共 培 养 ， 分 别 将HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF接种在支架的正方形、三角形、三角形和矩形部分上。HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF的接种比例为1：1：1：1。对于2D培养模型，细胞在细胞培养板上以与3D培养模型中相同的细胞接种密度和比率进行单培养或共培养所有上述共培养细胞均在与共培养细胞的种类和比例相对应的混合培养基中孵育2.5. 细胞增殖和附着测定使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Beyotime，中国）测定分析细胞增殖。单培养和共培养细胞1278X. Wang et 其他/工程 沪公网安备31010502000119号接种在支架上1、3和7天。在酶标仪（Epoch微量板分光光度计，BioTek，USA）中在450 nm波长下测量吸光度在四细胞共培养模型中，观察1天和7天后的细胞形态用磷酸盐缓冲盐水（PBS，SangonBiotech，中国）冲洗细胞接种的支架一次，并用2.5%戊二醛固定，然后在分级乙醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%（v/v））中脱水。2.6. 磁珠法分离HBMSCs和HUVECs的研究为了测量两细胞共培养模型中每种细胞被另一种细胞激发的基因表达，使用磁珠分离共培养的细胞。在HBMSC-HUVEC共培养模型中然后将细胞重悬于缓冲溶液PBS中，PBS含有0.1%牛血清白蛋白（BSA，Sangon Biotech，China），Dynabeads（Invitrogen，USA）与分化簇（CD）31抗体组合。在4 °C下孵育20分钟后，将细胞悬浮液置于磁体中2分钟，并将上清液转移至新管中。将该分离过程重复三次以获得高纯度的分离细胞。共培养系统中分离的HBMSC和HUVEC在本文中分别称为Co-HBMSC和Co-HUVEC。制 造 商 的 说 明 实 时 PCR 使 用SYBR Green qPCR Master Mix（TaKaRa，Japan）。使用循环阈值（Ct）计算相对基因表达水平。值比较（2-DDCt）法。GAPDH用作管家基因。引物序列列于表1中。2.8. 统计分析所有实验数据使用Student’s t检验分析软件进行统计学分析结果表示为平均值±标准差（SD）。通过t检验检测组间差异，认为p0.05为组间显著差异。3. 结果3.1. 3D打印细胞容器样支架图1（a）示出了可以使用3D打印技术制备具有不同微结构的3D打印细胞容器。 图图 1（b）和图 1 （c）提供了 一个集成的表1用于qRT-PCR的引物2.7. 定量实时聚合酶链反应靶基因正向引物序列（50为了评价单培养细胞和分离的和未分离的共培养细胞中成骨特异性基因（BMP 2、Runx 2、ALP、OCN和Col 1）和血管生成特异性基因（VEGF、KDR、eNOS和VE-Cad）的信使RNA（mRNA）表达水平，在第3天使用TRIzol试剂（Invitrogen，USA）提取总RNA用NanoDrop仪器（NanoDrop Technologies，Thermo，USA）检测RNA浓度。互补DNA（cDNA）使用GAPDHACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGBMP 2TTCGGCCTGAAACAGAGACCCCTGAGTGCCTGCGATACAGRunx2TGGTTACTGTCATGGCGGGTATCTCAGATCGTTGAACCTTGCTAALPACCACCACGAGAGAGTGAACCACGTTGTCTGAGTACCAGTCCCOCNTCACACTCCTCGCCCTATTGGTACCTCGCTGCCCTCCTGCTTCol1GAGGGCCAAGACGAAGACATCCAGATCACGTCATCGCACAACVEGFTATGCGGATCAAACCTCACCACACAGGGATTTTTCTTGTCTTGCTKDRCCCAGGCTCAGCATACAAAAAGAC CCAGTACAAGTCCCTCTGTCCCeNOSTGTCCAACATGCTGCTGGAAATTG AGGAGGTCTTCCTGGTGATGCCVE-CadGGCTCAGACATCCACATAACCCTTACCAGGGCGTTCAGGGACPrimeScript RT Master Mix试剂盒（TaKaRa，日本），图1.一、3D打印细胞容器的形态（a）具有不同微结构的3D打印的b-TCP/HA细胞容器的数字照片;（b）具有或（c）不具有不同细胞系的3D细胞容器的示意图;（d）3D细胞容器的前视图、（e）侧视图和（f）后视图;具有包括（g）三角形、（h）正方形、（i）平行四边形和（j）矩形的四种孔结构组合的3D细胞容器的显微照片注意，（g）X. Wang等/ Engineering 6（2020）1276-128412793D细胞容器，结合了四种不同的孔结构（三角形，正方形，三角形和矩形），有或没有接种细胞。将不同的细胞分别接种于支架的四个部位，建立了四种细胞的非接触共培养模型。使用基于挤出的3D打印机，制造具有明确限定的几何形状的微结构化支架（图1A和1B）。1（d）和（g）-（j））。从扫描电子显微镜（SEM）显微照片可以清楚地看出，不同微结构化部件的所有壁、底部和边界都是无缝连接的，使得制造出密封的细胞容器（图1A和1B）。1（d）-（f））。打印的细胞容器的XRD组成分析示于图2中，表明烧结后获得b-TCP/HA双相支架图二. 3D打印的b-TCP/HA双相生物陶瓷支架的XRD分析。a.u.：任意单位; 2h：散射角。3.2. 单培养和共培养模型中的细胞活力和形态图3中的SEM图像显示了在第1天和第7天在支架的规定部分上共培养的HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF的细胞形态。所有共培养的细胞均铺展良好，在第1天显示出丰富的伪足，并在第7天覆盖整个支架。图4显示了支架中单培养和共培养的细胞在不同时间的细胞增殖。结果表明，3D打印支架中的非接触共培养细胞模型在增强细胞活力方面表现出显着优势。在第3天和第7天，HBMSC/HUVEC/HUVSMC共培养组和HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF共培养组的增殖率均高于单培养组。HBMSC/ HUVEC/HUVSMC/HDF共培养组的增殖效率最高。3.3. HBMSCs与HUVECs三维共培养模型的成骨、血管生成及为了研究非接触式三维共培养模型对细胞-细胞相互作用的影响在共培养3天后，将两种类型的细胞从细胞容器中分离，并测量来自分离的细胞的成骨基因（BMP 2、Runx 2、ALP、OCN和Coll）和血管生成基因（VEGF、KDR、eNOS和VE-Cad）的表达（图1A和1B）。 5和6）。一般而言，在非接触式3D培养系统中，发现成骨和血管生成基因的表达在单培养细胞和分离的细胞中均显著上调。图3.第三章。分别在培养1天和7天后，对3D打印的b-TCP/HA细胞容器上的（a）方形孔中的HBMSC、（b）方形孔中的HUVEC、（c）三角形孔中的HUVSMC和（d）矩形孔中的HDF的细胞形态进行SEM分析1280X。 Wang et 其他/工程 沪公网安备31010502000119号图四、分别在第1天、第3天和第7天在3D打印的b-TCP/HA细胞容器中对单培养细胞和共培养细胞的细胞增殖进行CCK-8分析HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF：在3D细胞容器中单培养HBMSC、HUVEC、HUVSMC或HDF; HBMSC/HUVEC：首先将HBMSC接种在3D细胞容器的正方形和矩形孔中，然后与HUVEC在三角形和正方形孔中共培养;HBMSC/HUVEC/HUVSMC：首先将HBMSC接种在3D细胞容器的正方形和矩形孔中，然 后 与 HUVEC 在 三 角 形 孔 中 共 培 养 ， 与 HUVSMC 在 三 角 形 孔 中 共 培 养 ;HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF：首先将HBMSC接种在3D细胞容器的正方形孔中，然后与HUVEC在三角形孔中共培养，与HUVSMC在矩形孔中共培养。 * <表示共培养HBMSC/HUVEC/HUVSMC组分别与单培养HBMSC、HUVEC和HUVSMC组相比存在显著差异（p 0.05）;#表示<共培养HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF组分别与单培养HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF组相比存在显著差异（p 0.05）（每组n = 6）。与2D培养系统相比，共培养的细胞。更有趣的是，在HBMSC/HUVEC共培养体系中，骨相关基因BMP 2主要由Co-HUVEC表达，且三维共培养模型中Co-HUVEC表达的BMP 2显著高于二维共培养模型中Co-HUVEC表达的BMP 2此外，血管内皮生长Co-HBMSCs主要表达促血管生成因子（VEGF），三维共培养模型中Co-HBMSCsVEGF表达明显高于二维共培养模型。此外，三维支架中的Co-HBMSC显示Runx 2、ALP、OCN和Col 1的水平显著提高，而KDR、eNOS和VE-Cad主要由三维支架中的Co-HUVEC表达。3.4. 三维共培养模型单 培 养 （ HBMSC 、 HUVEC ） 和 共 培 养 （ HBMSC/HUVEC 、HBMSC/HUVEC/HUVSMC和HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF）细胞在3D细胞容器中的细胞生长速率明显高于在2D细胞培养板中的细胞生长速率（图1A和1B）。第7和第8段）。在三维多细胞共培养体系中，两细胞共培养、三细胞共培养和四细胞共培养模式在促进成骨和血管生成方面均优于单细胞共培养模式。 在共培养系统中加入HUVSMC和HDF，成骨基因Runx 2、ALP、OCN和Col 1以及血管生成基因VEGF、KDR、eNOS和VE-Cad的表达显著提高，并且在3D细胞容器中的四细胞非接触共培养模式（HBMSC/ HUVEC/HUVSMC/HDF）显示出最佳的成骨和血管生成活性。4. 讨论组织和器官的复杂结构和功能的构建失败的一个可能原因是没有合适的工程化细胞培养模型可以模拟人组织的多细胞组分在三维水平上建立组织特异性的多细胞共培养系统对于研究细胞间的相互作用和进一步在在过去的几年中，3D共培养系统已被广泛设计和使用，图五、通过在细胞培养板和3D细胞容器中培养的细胞表达成骨标志物基因（a）BMP 2、（b）Runx2、（c）ALP、（d）OCN和（e）Col1 HBMSC、HUVEC：单培养的HBMSC或HUVEC; Co-HBMSC：从共培养的HBMSC/HUVEC中分离的HBMSC; Co-HUVEC：从共培养的HBMSC/HUVEC中分离的HUVEC* 、§、※和#分别表示b-TCP/HA支架和“空白”组之间HBMSC、HUVEC、Co-HBMSC和Co-HUVEC的基因表达的显著差异（p0.05）X. Wang等/ Engineering 6（2020）1276-12841281见图6。通过在细胞培养板和3D细胞容器中培养的细胞表达血管生成标志物基因（a）VEGF、（b）KDR、（c）eNOS和（d）VE-Cad。‘‘Blank” refers to cells HBMSC、HUVEC：单培养的HBMSC或HUVEC; Co-HBMSC：从共培养的HBMSC/HUVEC中分离的HBMSC; Co-HUVEC：从共培养的HBMSC/HUVEC中分离的HUVEC* 、§、※和#分别表示b-TCP/HA支架和“空白”组之间HBMSC、HUVEC、Co-HBMSC和Co-HUVEC的基因表达的显著差异（p0.05）见图7。在单培养系统或多细胞共培养系统中，在细胞培养板和3D细胞容器中培养的细胞的（a）Runx2、（b）ALP、（c）OCN和（d）Col1 HBMSC、HUVEC：单培养的HBMSC或 HUVEC;HBMSC/HUVEC ： HBMSC 和 HUVEC 双 细 胞 共 培 养 系 统 ;HBMSC/HUVEC/HUVSMC ： HBMSC 、 HUVEC 和 HUVSMC 三 细 胞 共 培 养 系统 ;HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF ： HBMSC 、 HUVEC 、 HUVSMC 和 HDF 四 细 胞 共 培 养 系 统 。 * 、 y 、 λ 和 D 分 别 表 示 b-TCP/HA 支 架 和 “ 空 白 ” 组 之 间 HBMSC 、HBMSC/HUVEC、HBMSC/HUVEC/HUVSMC和HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF的基因表达的显著差异（p0.05）1282X. Wang et 其他/工程 沪公网安备31010502000119号见图8。在单培养系统或共培养系统中的细胞培养板和3D细胞容器中培养的细胞的（a）VEGF、（b）KDR、（c）eNOS和（d）VE-Cad的 HBMSC、HUVEC：单培养的HBMSC或HUVEC;HBMSC/HUVEC ： HBMSC 和 HUVEC 双 细 胞 共 培 养 系 统 ;HBMSC/HUVEC/HUVSMC ： HBMSC 、 HUVEC 和 HUVSMC 三 细 胞 共 培 养 系 统 ;HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF：HBMSC、HUVEC、HUVSMC和HDF四细胞共培养系统。* 、§、y、 λ和D分别表示b-TCP/HA支架和“空白”组之间HBMSC、HUVEC、HBMSC/HUVEC、HBMSC/HUVEC/HUVSMC和HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF的基因表达的显著差异（p <0.05）模拟体内的生理环境，并且少数工作集中于将共培养细胞的混合悬浮液接种到均质多孔支架或胶原蛋白、纤维蛋白或丝凝胶中[21尽管之前的研究已经证明，简单地将多个细胞混合在3D龛中是有效的，与传统的2D共培养相比，在增强细胞增殖和分化方面[26]，大多数细胞在体内以非接触的方式彼此通信。 因此，开发一种三维非接触式多细胞共培养容器以实现细胞间的充分尽管已经开发了许多方法，例如模制和冰模板，以制造含细胞支架，但制备的孔结构不是最佳的。众所周知，3D打印是有效制备具有各种孔径和形态的复杂结构支架的优选技术[27在这项研究中，我们通过使用基于挤出的3D打印方法成功地制造了具有四种不同孔结构（包括三角形、正方形、平行四边形和矩形）的b-TCP/HA复合支架（图1）。①的人。先前的研究发现，在细胞接种操作过程中，大量细胞从3D打印的多孔支架中泄漏出来。本研究制作了一种细胞容器，其中支架的不同微结构部分之间的壁、底部和边界无缝连接。该方法允许精确控制细胞接种密度和比例，而不损失细胞悬浮液。据报道，支架的多孔结构和孔形态在影响细胞反应方面很重要，包括细胞附着和增殖、营养转运和组织生长[32本研究发现，具有不同孔隙结构的三维非接触细胞容器不仅促进了单一类型细胞的增殖，而且显著刺激了共培养细胞的增殖。特别地，与单一细胞类型相比，三种或四种细胞与3D支架的共培养在刺激细胞增殖方面表现出显著这表明在3D非接触细胞容器中发生了细胞-细胞相互作用和通信。支架调控细胞增殖可能存在多种潜在的分子机制;我们倾向于认为，三维细胞容器样支架一方面可能通过结构效应影响细胞骨架，激活细胞增殖相关的信号通路，促进细胞增殖，另一方面可能通过放大共培养细胞的旁分泌效应来促进细胞增殖当然，这些假设还需要进一步证实。为了阐明3D细胞容器在影响细胞间通讯中的作用，我们首先选择了一个相对简单的HBMSC和HUVEC双细胞共培养系统 先前关于2D直接接触HBMSC/HUVEC共培养系统的研究表明，HBMSC分泌的血管生成生长因子VEGF促进HUVEC中KDR的活化，这进一步增强了BMP 2和eNOS的表达，以启动骨生成和血管生成[12]。我们的研究表明，HBMSCs和HUVECs在成骨和血管生成中的协同作用在基于支架的3D间接共培养系统中被放大，其特征在于与2D模型相比，3D模型中有趣的是，我们的实验显示血管生成生长因子VEGF主要由Co-HBMSCs表达，并且在3D共培养模型中Co-HBMSCs的VEGF表达显著高于2D共培养模型。同时，VEGF受体如KDR的表达从共培养的HUVECs 在 3D 细 胞 容 器 中 显 着 增 强 。 此 外 ， 3D 支 架 中 的 Co-HUVEC显示出血管生成基因如eNOS和VE-Cad的更高上调。据报道，与2D基质相比，在3D基质中HBMSC和HUVEC的共培养物中，HBMSC可能通过微结构敏感性旁分泌效应促进血管生成[36]。因此，有理由推测，与2D相比，X. Wang等/ Engineering 6（2020）1276-12841283细胞培养板，具有3D多孔结构的细胞容器将增强共培养物的血管生成效应，可能是因为它将放大共培养系统的旁分泌效应。除VEGF外，另一种重要的生长因子BMP 2已被发现在骨再生的早期阶段发挥重要作用[37，38]。有趣的是，我们的结果发现，BMP 2主要由Co-HUVECs表达，并且在3D 共培养模型中Co-HUVECs 表达的BMP 2显著高于在2D共培养模型中的表达有报道称HUVEC分泌的BMP 2可以调节HBMSCs的成骨作用[12]。我们的研究结果还表明，三维支架中的Co-HBMSCs表现出更高的成骨基因上调，如Runx 2，ALP，OCN和Col 1。综上所述，可以明确，在三维水平的HBMSC/HUVEC共培养体系中，Co-HBMSC表达的VEGF可以作用 于 Co-HUVEC ： 一方 面 激活 其表 面 VEGF 受 体 KDR ， 促进 Co-HUVEC中eNOS、VE-Cad等下游基因的表达，启动血管生成;另一方面刺激Co-HUVEC中BMP 2的表达，促进Co-HBMSC中Runx 2、ALP、OCN、Col 1等下游基因的表达，启动成骨。我们的研究结果表明，制备的细胞容器提供了一个良好的三维环境，在过去的几十年里，用于增强血管生成的生长因子和成骨作用已广泛应用于骨组织工程应用中，许多研究报道在组织工程支架中加入生长因子BMP 2和VEGF可增强生物材料的成骨和血管生成活性[39然而，由于活性维持和受控递送的挑战，外源性生长因子的应用在临床应用中受到限制[42，43]。在本研究中，3D细胞容器通过增加共培养细胞中BMP 2和VEGF的表达来激活骨组织再生过程中的骨生成和血管生成这两个这一结果表明，工程化的3D共培养模型创造了一种环境，在这种环境中，细胞可以相互交流，并进一步分泌内源性生长因子，以增强组织再生。本研究结果为组织工程的构建提供了新的由于骨形成是血管依赖性过程，因此血管生成在骨修复和骨骼发育中起关键作用[44，45]。除内皮细胞外，平滑肌细胞和成纤维细胞是血管壁的主要细胞成分，这些细胞以更复杂的自分泌和旁分泌方式相互作用，以维持血管的稳态[46本研究在HBMSC/HUVEC双细胞共培养体系中加入平滑肌细胞和成纤维细胞，构建三细胞和四细胞共培养体系，从三维水平研究多细胞共培养模式对共培养物成骨和血管生成的影响结果表明，与单细胞和双细胞共培养模式相比，三细胞共培养和四细胞共培养模式在促进成骨和血管分化方面均显示出明显的优势。在共培养体系中加入HUVSMCs和HDFs后，成骨基因Runx 2、ALP、OCN和Col 1以及血管生成基因VEGF、KDR、eNOS和VE-Cad的表达显著提高。此外，在3D细胞容器中的四细胞非接触共培养模式（HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF）表现出最佳的成骨和血管生成活性。我们的研究结果表明，基于三维支架的多细胞非接触共培养系统的开发允许构建多种生理组织的细胞共培养物，这对于模拟体内组织微环境和进一步的组织再生非常有帮助。5. 结论在这项研究中，我们通过3D打印技术成功地制造了具有四种不同孔结构的细胞容器状b-TCP/HA支架，包括三角形，正方形，平行四边形和矩形 使用该支架，构建了由HBMSC、HUVECs、HUVSMCs和HDF组成的具有空间控制分布的工程化3D共培养模型，以模拟人骨组织的细胞微环境。与2D平面培养相比，3D打印的细胞容器样支架在促进细胞增殖以及在共培养模式下的成骨和血管生成分化方面表现出明显的在双细胞共培养模式下，HBMSCs与HUVECs之间的相互作用表明，不同孔结构的三维细胞容器通过放大共培养系统的旁分泌效应，增强了共培养系统的血管生成和成骨作用，其中VEGF和BMP 2的表达的刺激起着关键作用。此外，在3D细胞容器中的四细胞非接触共培养模式（HBMSC/HUVEC/HUVSMC/HDF）表现出最佳的成骨和血管生成活性。我们的研究为开发基于支架的多细胞非接触共培养系统向组织再生方向发展指明了新的方向确认本研究得到了国家重点研究发展计划（2016 YFB 0700803）、国家自然科学基金（51761135103）、中国科学院科技创新跨学科合作团队计划（JCTD-2018-13）、中国科学院STS科技服务网络计划等项目的支 持 （ KFJ-STS-QYZD-092 ） 、 上 海 市 科 学 技 术 委 员 会（17441903700）和德国研究基金会（DFG，GE 1133/24-1）。遵守道德操守准则Xiaoya Wang、Meng Zhang、Jingge Ma、Mengchi Xu、JiangChang、Michael Gelinsky和Chengtie Wu声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] Langer R，Vacanti J.组织工程。Science1993;260（5110）：920-6.[2] Hopkins AM，DeSimone E，Chwalek K，Kaplan DL.中枢神经系统的3D体外建模。Prog Neurobiol2015; 1 - 25：1-25.[3] Giger RJ ， Hollis ER ， Tuszynski MH. 轴 突 再 生 中 的 引 导 分 子 。 Cold SpringHarbor Perspect Biol 2010;2（7）：a001867.[4] [10] Annabi N，Tamayol A，Uquillas JA，Akbari M，Bertassoni LE，Cha C.25周年纪念文章：水凝胶在再生医学中的合理设计和应用。Adv Mater2014;26（1）：85-124.[5] [10]张文辉，张文辉. 纺织技术与组织工程：通向器官编织的道路。AdvHealthcMater 2016;5（7）：751-66。[6] [10]张文，张文.三维生物打印。中国生命科学2015;58（5）：411-9.[7] 放大图片作者：Anti D，Burckel H，Josset E，Noel G.三维细胞培养：体内研究的突破。IntJ Mol Sci 2015;16（3）：5517-27.[8] Park SB，Lee SY，Jung WH，Lee J，Jeong HG，Hong J.代谢综合征治疗剂体外三维共培养系统的开发。Diabetes Obes Metab2019;21（5）：1146-57.[9] Knight E，Przyborski S. 3D细胞培养技术的进展使组织样结构能够在体外产生。 JAnat 2015;227（6）：746-56。[10] Battiston KG，Cheung JWC，Jain D，Santerre JP.共培养系统中的生物材料：支架内组织整合和细胞信号的优化。生物材料2014;35（15）：4465-76。[11] Li H，Chang J.生物活性硅酸盐材料通过旁分泌效应刺激成纤维细胞和内皮细胞共培养系统中的血管生成。Acta Biomater2013;9（6）：6981-91。[12] Li H，Xue Ke，Kong Ni，Liu K，Chang J.硅酸盐生物陶瓷通过刺激1284X. 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