埃及藤壶提取物对癣菌病的实验疗效及作用方式的确定：以埃及藤壶为对象进行研究

i本文的最新情况见最后于二零一九年一月十五日发出之医疗器械注册证（二零一九年）100177埃及藤壶Balanites aegyptiaca（L.）Del.皮肤癣菌病：通过实验和计算方法确定疗效和作用方式Syed Abuthakir Mohamed Hussain，Sharmila Velusamy，JeyamMuthusamy印度哥印拜陀Bharathiar大学生物信息学系生物化学实验室A R T I C L E I N F O关键词：皮肤癣菌埃及龟头菌石膏样小孢子菌红色毛癣菌对接IFDA B S T R A C T皮肤癣菌病，也被称为癣或癣，是由一组真菌，皮肤癣菌，皮肤，指甲，头发和身体的潮湿区域引起的浅表感染。小孢子菌属、毛癣菌属和表皮癣菌属是被分类为皮肤癣菌的三个属。埃及藤壶（Balanites aegyptiaca），又名“沙漠枣”，是一种重要的药用植物。它是一种多刺的灌木或矮树，果实甜美，种子像石头，内核含油。这种植物的各个部分用于治疗人类的许多疾病，特别是皮肤病，黄疸，肠道蠕虫感染，伤口，疟疾，癫痫，痢疾，腹泻，胃痛和哮喘。在本研究中，将植物的不同部分，即地上部分、果肉、外果皮和仁部分分离并遮光干燥，并使用Sox hlet装置制备这些部分的提取物。采用食物中毒法测定了5种不同浓度（1、2、3、4、5 mg/ml）的提取物对石膏样真菌和红色毛癣菌的抗菌活性。并与治疗皮肤癣菌病的标准药物酮康唑进行体外实验比较。根据本研究的结果，发现果肉部分的甲醇提取物从3 mg/ml的浓度开始完全抑制石膏样霉和红色木霉的生长。对果肉进行LC-MS，并将鉴定的化合物与参与麦角甾醇生物合成的蛋白质，蛋白质合成和病原体的细胞壁对接，并使用Schrödinger的Glide模块与特定药物进行比较。矢车菊素-3-0-鼠李糖苷、牛磺胆酸、PRZ-M382、罂粟碱和美贝维林给出比药物更好的相互作用和dock评分，并且可在可食用的果实中果皮中获得。本研究表明，埃及藤壶果肉中的活性成分可能具有潜在的抗皮肤癣菌活性，其可食部分可进行体内验证。1. 介绍埃及藤壶Balanites aegyptiaca（L.）Del.是属于蒺藜科的常见野生树木。它生长在南亚和非洲的干旱地区。果实有粘性果肉，坚硬的核种子和油性内核[1]。埃及黄连具有潜在的药用价值，是一种中草药.果皮对皮肤病是有效的，根树皮被用作抗疟疾剂，并且叶被用于昏睡病和糖尿病[2]。它是皂苷的丰富来源，并且存在不同的化合物，如早期研究所报道 的 那 样 ， 包 括 Balanitin 、 Diosgenin 、 Balanitism H 、 Fur-anocoumarin和Bergapten。皮肤癣菌产生分解角蛋白的角蛋白酶，这有助于侵入角化组织[4]。真菌质膜的主要固醇是麦角固醇，其对真菌细胞功能如流动性和完整性非常有帮助[5]。唑类、苯胺类、多烯类、棘白菌素类、灰黄霉素类和环吡罗类是抗皮肤癣菌的重要药物组。唑类和烯丙基胺类化合物主要抑制麦角甾醇生物合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶和角鲨烯环氧酶。多烯通过与麦角固醇结合降低质膜完整性。通过细胞壁干扰剂，棘白菌素，抑制β-葡聚糖合成酶的功能发生[6]。阿莫罗芬（AMF）是另一种通过其抗霉菌特性抑制D-14还原酶和甾醇-D 7和D8异构酶来阻断麦角固醇合成的药物[7]。Tavaborole抑制亮氨酰转运RNA（tRNA）合成酶的功能，从而干扰真菌细胞中的蛋白质合成[8]。本研究通过抑制石膏样小孢子菌和红色毛癣菌的生长，通过LC-MS鉴定提取物中具有非常显著活性的化合物，并从LC-MS化合物中鉴定新的先导化合物，重点研究了埃及艳苔的地上部分、外果皮、果肉和种仁的体外*通讯作者。生物化学实验室，生物信息学系，Bharathiar大学，哥印拜陀，641 046，泰米尔纳德邦，印度。电子邮件地址：biothakir@gmail.com（S.A.穆罕默德·侯赛因），bioinfosharmi88@gmail.com（S. Velusamy），jeyam@buc.edu.in（J. Muthusamy）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2019.100177接收日期：2019年2月12日;接收日期：2019年3月19日;接受日期：2019年3月28日2019年4月6日的一份声明2352-9148/©2019由ElsevierLtd.这是一个不可避免的问题，因为CCBY-NC-NDLicense（http：//creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4。0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学杂志主页：www.elsevier.com/locate/imu于二零一九年一月十五日发出之医疗器械注册证（二零一九S.A. Mohamed Hussain等人2图1. 埃及藤壶不同部位提取物对石膏样霉菌的抑制率。图2. 埃及藤壶不同部位提取物对红色毛滴虫的抑制率。对接分析。2. 材料和方法果 实 收 集 自 印 度 泰 米 尔 纳 德 邦 该 植 物 由 印 度 植 物 调 查 局（BSI/SRC/5/23/2018/Tech.1582）认证将外果皮、粘果肉、种仁和刺状气生部分分离，遮光干燥，并依次用不同的溶剂（包括石油醚、己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和乙酸乙酯）提取。水还直接使用甲醇（DM）和水（DW）制备浸提液。皮 肤 真 菌 真 菌 石 膏 样 小 孢 子 菌 （ MTCC.6041 ） 和 红 色 毛 癣 菌（MTCC.8477）购自MTCC（微生物典型培养物保藏中心和基因库），昌迪加尔，用于本研究。2.1. 抗真菌测定埃及藤壶不同提取物的抑菌活性于二零一九年一月十五日发出之医疗器械注册证（二零一九S.A. Mohamed Hussain等人3表1果实中果皮甲醇组分的植物化学分析。S.无组别测试名称是否存在 *毒食术分析。将地上部分、外果皮、果肉和种仁的不同提取物与SDA培养基混合，获得1 - 5 mg/ml的不同浓度对照通过在无提取物培养基中的病原体塞制备，并且标准品为1.碳水化合物1.本尼迪克特试验 +2.费林试验+2.蛋白质和氨基酸1.双缩脲试验+2. 茚三酮试验+3. 米隆试验+3.皂苷起泡试验+Ketoconazole培养基分别在对石膏样霉菌和红色木霉孵育11天和21天4.酚类化合物氯化铁试验I ={（Dcontrol-Dtreated）/Dcontrol}X1005.Mayer’s Test+6.单宁KOH测试7.碱性试剂检测+8.萜类化合物Salkowiski试验+9.维生素C测试10.香豆素香豆素测试11.大黄素试验12.糖苷类Borntrager试验+* +表示存在，表2从埃及藤壶果肉的分级甲醇提取物的LC-MS分析中鉴定的化合物。S.no化合物名称保留时间（RT）LC-MS质量导出质量a分子式1.不，亚硝基芬·阿糖胞苷0.240260.09260.11C12H 15F 3N 2O2.γ-谷氨酰蛋氨酸0.240278.10278.09C10H 18N 2O 5S3.群地0.240360.12360.13C18H 20N 2O 64.阿莫西林0.240365.07365.10C16H 19N 3O 5S5.PRZ_M3820.240381.05381.04C14H 18Cl 3N 3O 36.N- 氧化氯氮平0.325342.13342.12C18 H19 CIN4 O7.吲达帕胺0.325365.07365.06C16 H16 CIN3 O3 S8.吩嗪0.428180.09180.06C12H 8N 29.乐果0.428229.01228.99C5 H12 NO3 PS210.哌泊噻嗪1.938475.28475.19C24H 33N 3O 3S 211.罂粟碱2.624339.13339.14C20H 21NO 412.N-乙酰神经氨酸2.984309.12309.10C11H 19NO 913.阿片碱2.984353.14353.12C20H 19NO 514.美贝维林3.241429.26429.25C25H 35NO 515.N，N-二乙基-4-羟基苯甲酰胺0.240193.05193.11C11H 15NO 216.N-乙酰美沙拉嗪0.240195.06195.05C9 H9 NO417.噻吩磺隆0.240387.05387.03C12H 13N 5O 6S 218.N-2-乙酰鸟嘌呤0.291193.05193.05C7 H7 N5 O219.丙硫咪唑0.291265.06265.08C12H 15N 3O 2S20.阿塞诺库莫拉尔0.291353.06353.08C19H 15NO 621.头孢克洛0.291367.07367.03C15 H14 CIN3 O4 S22.牛磺胆酸0.291515.07515.29C26 H45 NO7 S23.Rottlerin0.291516.08516.17C30H 28O 824黄尿酸0.446205.05205.037C10 H7 NO425矢车菊素-3-O-鼠李糖苷0.446433.03433.113C21H 21O 1026磷脂酰丝氨酸3.722783.30783.50C42H 74NO 10P27CycloX ydim3.962325.17325.17C17 H27 NO3 S实验一式三份进行。结果表示为平均值±标准误差（SE）。采用SPSS 20软件对数据进行统计分析2.2. MIC和MFC最低抑菌浓度（MIC）根据NCCLS的丝状真菌指南（M38-A2），使用两倍肉汤稀释法计算。用21天培养物制备接种物，用石膏样霉菌0.1~ 1.8 × 105 CFU/ mL和红色毛癣菌0.1 ~ 1.5 × 106 CFU/mL的孢子悬液进 行 M I C 和 M F C 测 定 。通过连续稀释法制备浓度为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19和0.1 mg/ml的溶液。将试管中的接种物在SDA培养基上传代培养在30 °C下孵育7天后，观察到MIC90为90%抑制，并在未观察到可见生长的情况下测定MFC（最小杀真菌浓度）[10]。2.3. 植物化学分析通过各种测试分析果实中果皮的甲醇级分是否存在植物化学物质，如碳水化合物、蛋白质、氨基酸、单宁、皂苷、香豆素和糖苷[11，12]。2.4. 化合物分析使用液相色谱-质谱法（LC-MS）进一步分析果实中果皮的分级甲醇提取物以鉴定存在的大分子和次级代谢产物在UPLC-QToF-MS系统（水）上进行LC-MS分析在30 °C下使用具有C-18柱的UPLC Acquity的配置文件Acquity UPLC BEH 2.1*50 mm反相颗粒（1.7μm直径） 流动相：溶剂A（0.1%HCO2H水溶液）和B（100%CH3CN）.使用的梯度：0%-5%的B（0-0.50 min ），5%-30% 的B（0.50-1.50 min ）， 30%-95% 的B（1.50-4 min ），95% 的B（4-5 min ），90%-5% 的B（1.50- 1.50min），90%-5%的B（1.50 - 1.50 min）。（5-5.50 min）和5% B（5.50-6 min）。流速：0.60 ml/min;进样量：1.0μL。将检测到的化合物质量与欧洲质量库进行比较。图3. 埃及藤壶果肉甲醇提取物对石膏样霉和红色木霉菌丝生长的抑制作用。（C）-对照，（D）-DMSO，（K）-酮康唑，（1）-1 mg/ml，（2）-2 mg/ml，（3）-3mg/ml，（4）-4 mg/ml，（5）-5 mg/ml。于二零一九年一月十五日发出之医疗器械注册证（二零一九S.A. Mohamed Hussain等人4表3果肉和药物的LC-MS化合物与石膏样霉菌的各种靶点在诱导拟合对接中的相互作用S·NO化合物名称角鲨烯环氧酶Dock评分相互作用残基粘合长度（mm）1.矢车菊素-3-O-鼠李糖苷-9.9TYR 110、ASP 111、LEU 3932.19，1.94，1.952.N-乙酰神经氨酸-9.6GLN 83、TYR 108、GLY 109（2）、VAL 112、ILE 1132.13、2.17、1.97、2.16、2.05、2.063.Rottlerin-8.4CYS411、TYR414、LUE419两点零九，两点零八，一点五十八4.泰尔比纳芬-7.0ASP1111.92羊毛甾醇14α-脱甲基酶1.矢车菊素-3-O-鼠李糖苷-14.5TYR106、SER366、ARG369、HIS 453（2）1.97，1.84，2.09，1.88，1.932.牛磺胆酸−13.3THR 289、SER 366、MET 368、ILEU 4561.82，1.83，2.04，2.143.N-乙酰神经氨酸-11.8TYR 106（2）、TYR 120、ARG 369（2）、SER 366、LEU 4952.19、2.19、2.49、1.81、1.91、1.89、1.924.酮康唑−8.2TYR52、TYR120、ARG369一点九六，一点八，二点一六D-8甾醇异构酶1.吲达帕胺-10.8TYR 161、GLU 1692.25，1.802.头孢克洛-10.6TYR 106、GLU 132、TYR 161一点八四，二点零四，二点零五3.N-乙酰神经氨酸-8.1HIS 85（2）、MET 89、TYR 161、GLU 1691.99，2.16，2.26，1.854.阿莫罗尔芬-7.3ASP1492.02亮氨酰t-RNA合成酶1.矢车菊素-3-O-鼠李糖苷-12.0THR 334、VAL 432、VAL 436、SER 440、ASP 443（2）、LYS504、ASP 5051.93、1.77、2.22、2.01、2.24、1.88、1.54、2.00（二）2.N-乙酰神经氨酸-9.1LEU330、LYS428（2）、SER440、ASP443（4）、LYS504（2）、TYR5082.08，1.93，2.25，2.19，1.77，1.70，2.02，2.33，2.47，2.14，2.033.PRZ_M382-9.0THR 329，LEU 330，THR 334，ASP 443（2）2.10、2.29、2.02、1.83、2.474.塔瓦博罗莱-5.5THR 329、LEU 330一点八八，二点一二几丁质酶1.罂粟碱-10.4ARG212.062.Rottlerin-9.5TRP101、GLY181一点八二，二点零一3.PRZ_M382−9.2ARG262（2），GLU283（2）1.69，2.11，1.72，1.864.别沙米丁-11.8GLU 141（2）、TYR 142、ASP 206（3）、PHE207、ARG 2621.90、2.21、2.05、2.16、2.21、2.38、1.93、2.25图第四章埃及藤壶果肉甲醇分级提取物对（A）-石膏样支原体和（B）-红色木霉菌的MIC和MFC。C-对照，（1）50 mg/ml，（2）25 mg/ ml，（3）12.5mg/ml，（4）6.25 mg/ml，（5）3.12 mg/ml，（6）1.56 mg/ml，（7）0.78 mg/ml，（8）0.39/mg/ml，（9）0.19 mg/ml，（10）0.09 mg/ml。2.5. 蛋白质-3D建模、细化和验证在蛋白质数据库中无法获得石膏样支原体和红色嗜热厌氧菌的选定靶标的3D结构因此，使用NCBI-BLAST搜索模板来启动蛋白质建模。石膏样真菌和红色木霉的羊毛甾醇14 α脱甲基酶模板的相似性分别为63%和62%，几丁质酶的相似性分别为60%和58%。因此，两种生物体的羊毛甾醇14α-脱甲基酶（Uniprot ID：E4 V4 J 0，A0 A178 EPF 7）和几丁质酶（Uniprot ID：E5 R 012，A0 A178 EQR 6）分别使用PDB ID：5FRB和1 W 9 P模板通过同源建模方法在Schrödinger中建模。两种生物体的其他蛋白质如角鲨烯环氧酶（E4 V2 X6，Q4 JEX 9）、亮氨酰t-RNA合成酶（E5 QZL 3，A0 A178 ESV 1）和C-8甾醇异构酶（E4 UNP 9，A0 A178 F144）的3D结构由PHYRE 2 V 2.0服务器建模，该服务器使用先进的远程同源性检测方法构建3D模型，预测配体结合位点，并分析给定序列的氨基酸变体效应[13]，因为在BLAST中发现的结构相似性小于40%。对于所有建模的蛋白质，通过ModRefiner（一种用于原子水平、高分辨率蛋白质结构细化的算法）细化环并最小化能量[14]。最后，使用来自PROTEINS的Ramachandran图验证建模的蛋白质[15]。2.6. 活性部位预测使用Clustal Omega服务器通过多序列比对预测活性位点，并将其与来自真菌（如念珠菌属和曲霉属）的蛋白质的现有解析晶体结构进行比较[16]。2.7. 配体制备从PubChem数据库中检索从埃及藤壶中果皮鉴定的LC-MS化合物的3D结构药物分子从药物库（www.drugbank.ca）下载。2.8. Adme性质通过Schrodinger的QikProp 3.5模块评估所有LC-MS衍生的植物化合物的ADME性质[17]。2.9. 分子对接利用Schr dinger的Glide模块进行蛋白质-配体对接，通过4个步骤进行：1.蛋白质制备，2.受体网格生成，3.配体制备和4.配体对接。在蛋白质制备向导中，蛋白质于二零一九年一月十五日发出之医疗器械注册证（二零一九S.A. Mohamed Hussain等人5图5. 埃及藤壶果肉甲醇提取物的LC-MS分析。分子，添加缺失的氢原子，分配键级，创建二硫键，以及优化Asn和Gln的羟基，酰胺基的氨基酸取向。OPLS 3e力场被固定用于能量最小化;非氢原子被最小化，直到平均均方根偏差（RMSD）达到默认值0.3 μm。生成覆盖从多序列比对中列出的活性位点残基的网格。为了优化配体分子，通过Ligprep工具，固定了力场OPLS3e，并使用Epik代替电离剂，以在给定的pH范围内产生可能的电离和互变异构结构。通过XP（超精密度）对接，使用选定的配体与选定的病原体靶标进行配体对接[18]。2.10. 诱导拟合对接（IFD）诱导拟合对接（IFD）是使用薛定谔[19]其中受体是可降解的并且结合位点根据配体的结合模式而改变。Glide和Prime模块用于对接和结构改进。IFD的过程从蛋白质制备开始，并通过选择活性位点的残基延伸到蛋白质网格然后，固定长度为20μ m的dock配体分子。再次制备从XP对接中选择的配体分子，并与每个蛋白质对接。

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