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HiTIME:一种用于检测LC-MS数据中未知药物代谢物的有效模型
软件X 12(2020)100559原始软件出版物HiTIME:一种用于检测LC-MS数据中未知药物代谢物的有效模型选择方法Michael G.李明a,安德鲁·P·艾萨克b,c,卢克·扎皮亚d,e,理查德·A·J.A. 作者:Donaldf.教皇b,g,h,a澳大利亚墨尔本大学化学与生物学院21分子科学生物技术研究所b墨尔本生物信息学,墨尔本大学,澳大利亚c沃尔特和伊丽莎霍尔医学研究所,澳大利亚d澳大利亚墨尔本大学生物科学学院澳大利亚默多克儿童研究所(Murdoch Children's Research Institute)f澳大利亚新南威尔士大学化学学院g澳大利亚墨尔本大学临床病理学系h澳大利亚莫纳什大学中央临床学院医学系ar t i cl e i nf o文章历史记录:2019年12月5日收到2020年6月29日接受保留字:液相色谱-质谱联用代谢物a b st ra ct代谢物的鉴定在理解药物功效和安全性方面起着重要作用,然而这些化合物通常难以在复杂混合物中鉴定鉴定药物代谢物的一种方法涉及利用差异同位素标记的药物化合物来产生可通过液相色谱-质谱法(LC-MS)检测的独特同位素信号。用户友好的,有效的,计算工具,允许选择性地检测这些信号是缺乏的.我们开发了一种高效的开源软件工具HiTIME(高分辨率双离子代谢物提取),可过滤LC-MS数据中的双离子信号。输入中的每个数据点的强度由Z分数代替,该Z分数描述该点与理想化双离子信号相对于替代离子特征的匹配程度。在这里,我们提供了一个详细的描述算法,并证明其性能的模拟和实验数据。©2020作者由爱思唯尔公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。代码元数据当前代码版本1.1此代码版本使用的代码/存储库的永久链接https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX_2019_370Code Ocean compute capsuleLegal Code License3-Clause BSD使用git的代码版本控制系统使用C++的软件代码语言、工具和服务编译要求,操作环境&依赖性C++库:Boost,OpenMS,lru_cache。 编译:CMake,Docker(可选)如果可用,链接到开发人员文档/手册https://github.com/bjpop/HiTIME-CPP/blob/master/README.md问题支持电子邮件bjpope@unimelb.edu.au1. 动机和意义液相色谱质谱法(LC-MS)常用于检测生物细胞、组织和体液中的药物代谢物。对于未知和意外的代谢物,确定数千种代谢物中的哪一种可能具有挑战性。Correspondingauthor at:Melbourne Bioinformatics,The University ofMelbourne,Victoria,Australia,3010.电子邮件地址:bjpope@unimelb.edu.au(B.J. Pope)。https://doi.org/10.1016/j.softx.2020.100559检测到的离子对应于给药化合物的代谢物。这个药物代谢物的非靶向检测的一种方法是同时施用药物的混合物,受控比例的同位素标记变体[2如果保留同位素标记,则当通过LC-MS分析时,形成的代谢物将与相同2352-7110/©2020作者。由爱思唯尔公司出版。这是一篇开放获取的文章,使用CC BY-NC-ND许可证(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页:www.elsevier.com/locate/softx2M.G. Leeming,A.P.艾萨克湖Zappia等人粤公网安备44010502000119号+·+ −+ −+·+ −+ −·+ − + −图1.一、 用于检测LC -M S 数 据 中 双离子的HiTIME过程。然而,作为前体,质荷比(m/z)值因同位素标记物的质量而不同。这些我们已经开发了一个名为HiTIME的软件系统,可以搜索LC-MS数据中的双离子签名。HiTIME已成功应用于检测药物处理大鼠血浆中药物对乙酰氨基酚(APAP)和丙戊酸的代谢物[3,6]、与嗜中性APAP代谢物共价结合的内源性蛋白质[7]和APAP的核碱基加合物[8]。本文首次对HiTIME系统进行了完整的描述,详细阐述了它的基本算法,并在合成数据集和真实数据集上演示了它的性能。2. 软件描述识别孪生离子的HiTIME过程包括4个步骤(图1):(1)通过实验测定产生双离子LC-MS数据,产生mzML格式的原始数据(以曲线或质心模式);(2)基于模型选择对数据进行评分;(3)将评分过滤至局部最大值;以及(4)可视化并审查候选结果。我们开发了两种新的软件工具来促进这一过程:HiTIME用于评分和过滤输入的LC-MS数据,HTInspect用于可视化和审查。核心HiTIME算法采用了一种新的模型选择方法,将LC-MS数据的连续“邻域”与一对二维(高斯)洗脱峰进行比较,并与单离子(“重”或“轻”)特征进行对比。对于给定保留时间(rt)和质荷比(m/z)的数据点,第一个模型峰以该点为中心,第二个模型峰以( rt , m/z= m/z ) 为 中 心 。 模 型 峰 由 rt 维 度 中 的 半 峰 全 宽(FWHM)和m/z维度中的FWHM参数化。通过计算与目标信号的相关性来确定该模型与周围数据的拟合优度,并对其进行评分 与可选的非目标信号(单峰)相比。 指定给给定数据点的总分使用修改的Z检验计算[9]。计算两个分数,一个用于与仅“轻"同位素模型相比的双离子模型,一个用于与仅重同位素模型相比的双离子模型。最小Z分数用作最终分数。大于零的分数表示周围区域中的数据与双离子模型具有更高的相关性,而小于零的分数表示与单峰(重峰或轻峰)更好的匹配。评分数据被写入mzML文件,可以在开源软件中进一步处理。相比之下,以前的方法来检测双离子采用两步过程的不可知特征发现和随后的过滤结果[10HiTIME过滤评分数据以找到局部最大值,输出候选双离子列表作为CSV文件,其中包含局部最大值处的rt、m/z和评分数据。然后使用我们的辅助图形工具HTInspect(https://github.com/mgleeming/HTInspect)进行候选双离子的用户可视化和审查,该工具以具有质谱经验的研究人员熟悉的格式绘制提取的离子色谱图和质谱图。可以导出确认的双离子的最终列表。HiTIME算法在图1中由伪代码示出。2,由用于评估单个谱中的数据点的得分函数和用于并行化的线程_工作函数组成。该算法通过实验定义的天然丰度与同位素丰度的比率(R)、对应于由同位素富集引入的质量差的m/z差(m/z差)以及保留时间(rt)维度中的半峰全宽(FWHM_rt,以扫描次数计)和m/z维度中的半峰全宽(FWHM_mz,以百万分率计)来参数化。所提供的FWHM_rt和FWHM_mz用于确定数据区域的边界和用于计算每个点(rt,mz)处的分数的高斯模型。保留时间界限定义为rt/ 2σrt,质荷界限定义为mz(1 / 2σmz)。其中,σrt和σmz分别通过缩放FWHM_rt和FWHM_mz导出。数据和拟合模型之间的相关性分两部分计算,一部分用于天然区域,另一部分用于rt的同位素区域/2 σrt(mz)(一)/2 σmz)和rt/2σrt分别由(mz<$ mz)(1 / 2σmz)表示。相关性的计算是为了给每个区域以相等的权重,而不管区域之间的样本量计算三个相关性,每个模型一个,并用于产生每个数据点的最终Z分数。在结构上,HiTIME算法是一个模板卷积。在(rt,mz)处的每个输出数据点分别从输入文件中在(rt,mz)和(rt,mz)处的两个数据点的如果假设所有输入和输出数据在整个计算期间都保持在存储器中,则Stenointment卷积算法是数据并行的并且相对容易并行化,从而导致对于大小为N的输入文件的2N存储器使用(一个副本用于输入,并且一个相等大小的副本用于输出)。输出)。我们的目标之一是使HiTIME能够在商品硬件(例如笔记本电脑)上使用,因此这种简单的并行化方法是不可行的,因为高分辨率的LC-MS文件可以很容易地达到数千兆字节的大小。因此,这项工作的一个重要贡献是开发了一个内存高效的并行化策略。为了做到这一点,我们采用了一种全局变量跟踪下一个未求解的输入光谱的ID。线程只能通过get_next_spectrum_todo()方法读取和更新此变量,该方法通过使用C++互斥锁保护变量来防止竞争条件当线程需要从频谱中读取时,它通过其ID来执行,如下所述。这种蛙跳方法允许我们将处理工作均匀地分布在可用的CPU线程上,但它在文件输入和输出处理方面存在两个主要挑战:1. 线程将处理光谱的重叠邻域窗口(通过get_neighborhood()函数)。我们试图避免必须从输入中多次重新读取相同的光谱,并且我们不希望在存储器中同时具有相同光谱的多个副本。M.G. Leeming,A.P.艾萨克湖Zappia等人粤公网安备44010502000119号3图二. HiTIME算法的伪代码。单个光谱中的每个数据点根据其与双离子模型的拟合优度通过评分函数进行评分。每个并行线程执行thread_worker函数,该函数按保留时间顺序迭代输入文件中的可用光谱2. 我们不能保证线程将按保留时间顺序完成光谱评分。因此,我们可能不一定能够在评分后立即将输出光谱写入文件;可能需要在内存中进行一些重新排序。我们对第一个挑战的解决方案是维护程序当前正在处理的光谱的缓存,并在线程之间缓存通过频谱ID进行索引我们采用了最近最少使用(LRU)缓存实现(来自https://github.com/lamerman/cpp-lru-cache , 采 用 3- ClauseBSD许可证)。LRU保留策略支持对数据元素的快速访问,同时保持良好的时间局部性。当线程需要访问频谱时,它必须使用频谱的ID通过缓存发出请求。如果频谱不在缓存中,则使用OpenMS [14]提供的IndexedMzMLFileLoader方法从输入文件中获取,该方法提供对索引mzML文件的缓存通过线程安全的C++共享指针(shared_ptr)引用各个光谱,这些指针是引用计数的。这可确保光谱在由一个或多个线程处理时保留在内存中,并(仅)在不再需要时自动释放。重要的是,这使得能够正确的频谱的存储器分配,即使它们被从高速缓存中驱逐,同时仍然被程序处理-这种情况可能会出现小的高速缓存大小和/或大的邻域窗口。缓存的大小默认为50个光谱,但可以通过命令行参数覆盖。我们对第二个挑战的解决方案是保持输出光谱的优先级队列,按保留时间排序线程通过put_spectrum()方法将输出光谱放入队列。只有当排队的光谱按保留时间顺序是下一个未写入的光谱时,才将其写入磁盘。蛙跳并行化策略通常确保输出队列不会变得非常大。在典型的LC-MS测试数据集上,它很少长于一个元素。蛙跳并行化策略与输入缓存和输出缓存的结合导致了一种内存高效的算法,该算法可以很好地随可用CPU线程的数量而扩展。图图3展示了HiTIME的线性加速和内存使用与14 GB代表性全剖面(非质心)数据集上的线程数的关系。图 三 . HiTIME 数 据 分 析 的 线 程 数 与 磁 盘 加 速 和 内 存 使 用 ( 最 大 驻 留 集 大 小(RSS))。输入测试数据是在2.3 GHz Intel Xeon E5-2698 v3上的1至32个CPU内核上测试的14 GB mzML文件,每个节点32个内核。3. 说明性实例采取两种不同的方法来证明HiTIME过程(除了以前的出版物)。首先,产生合成LC-MS数据,其除了许多非双离子信号之外还包含恰好17个在此合成数据上运行HiTIME导致成功识别所有17个真实信号,并且没有额外的信号。其次,我们使用与化学合成的APAP代谢物N-乙酰基-对醌亚胺(NAPQI)和等量的同位素富集的13C6-NAPQI反应的纯蛋白质,针对真实LC-MS数据测试HiTIME。3.1. 合成LC-MS数据一个小的测试用例数据集在硅片上生成,称为synthetic17。mzML是使用MSSimulator [15]生成的, 一个自定义的Python脚本 , 用 于 生 成 一 个 包 含 确 切 已 知 数 量 的 双 离 子 的 文 件 。synthetic17.mzML文件可以从以下网址获得:4M.G. Leeming,A.P.艾萨克湖Zappia等人粤公网安备44010502000119号图四、 通过分析NAPQI/13 C 6-NAPQI处理的BSA消化物生成的TOPPView中可视化的未处理LC-MS数据。https://melbourne.figshare.com/ndownloader/files/16247657我们提供了一个方便的包装器脚本,hitime-docker.sh运行HiTIME Docker容器。使用包装器脚本,程序可以像这样在测试用例上运行,产生一个新的重新加权的mzML文件results.mzML作为输出:./ hitime-docker.sh-i synthetic17.mzML -o results.mzML --d6.0201 -r 3 -m 30在上述示例中,参数-d 6.0201 -r 3 -m 30分别指定双离子m/z差为6.0201、保留时间半峰全宽(FWHM)大小为3个步长、以及m/z FWHM为百万分之30。必须选择这些参数以匹配输入数据集,并且取决于实验,这些参数可以由用户预先知道,或者可以通过检查关键分子(例如前体)的光谱来凭经验确定。HiTIME还可用于过滤输出数据,以仅包括保留时间半高宽(FWHM)大小和m/z FWHM边界定义的区域中具有最大值的点。例如,这可以应用于上面重新缩放的输出,如下所示:./ hitime-docker.sh-i results.mzML-o max.results.mzML--l 0.3 -u 0.7-r 3参数保留了上面的含义,而-L 0.3 -U 0.7规定了局部最大值窗口的较低和较高的m/z偏移;这些也可以通过检查关键分子(例如前体 ) 的 光 谱 而 凭 经 验 确 定 。 此 命 令 将 生 成 两 个 文 件 ,max.results.mzML和max. results. csv。CSV文件是一个逗号分隔的文本文件,列出了局部最大值。可以对该列表进行排序,以帮助识别最强的双离子信号匹配。图形工具HTInspect作为Python包提供,允许对结果进行在图形用户界面中,选择上面生成的CSV输出(最大结果.csv)作为“HiTIME输出文件”字段。这将显示局部最大值点的m/z与保留时间 图 。 在 “mzML File” 字 段 中 选 择 原 始 mzML 文 件(synthetic17.mzML)“mzDelta "字段是如上所述的重同位素和轻同位素之间的质量差,并且”EIC宽度“是指当提取质谱数据以用于分析时使用的质量容差(以m/z计)。EIC图。可以根据需要设置输出文件,并通过单击“运行后处理”开始处理。这将生成一个输出文件,其中包含以下各项的EIC迹线和质谱:检测到的局部最大值。要以交互方式查看这些结果,请选择用户界面的然后可以交互地检查每个命中的“重"和”轻"同位素的EIC迹线rt维度的半峰全宽可以通过对已知化合物信号(例如前体化合物的信号)3.2. 真实LC-MS数据:牛血清白蛋白为了在含有许多双离子的样品上测试HiTIME,使纯蛋白质(牛血清白蛋白,BSA)与化学合成的APAP代谢物N-乙酰基-对醌亚胺(NAPQI)和等量的同位素富集的13 C 6-NAPQI反应。该样品制备的实验细节见附录A。然后消化蛋白质并通过LC-MS分析。四、数据明显由少量高丰度离子主导,使得难以检查丰度低得多的可能的双离子信号。为了鉴定潜在的孪生离子,使用台式计算机在1分钟内用HiTIME处理该数据。<在使用HTInspect进行可视化时,这些被确认为对应于真实的双离子信号(图1)。5(a))。 通过比较,未暴露于13 C6 -NAPQI的对照BSA消化物数据集的相同处理,未发现令人信服的双离子(图 5(b))。在对照数据中,偶然地仍然有离子匹配 双离子剖面HiTIME的灵敏度允许检测这些信号和可视化允许分析师接受或拒绝作为目标双离子的功能4. 影响评估异生素的代谢特征对于了解该分子的治疗和毒性作用至关重要然而,在活的生物体上,由于生物流体如血液(含有数千种不同的化合物)的复杂性,区分异生代谢物和内源物质可能是困难的。因此,同位素标记的异生物质可用于在常规LC-MS分析中提供同位素特征[5]。HiTIME允许研究人员检测M.G. Leeming,A.P.艾萨克湖Zappia等人粤公网安备44010502000119号5图五、(a)NAPQI/13 C 6-NAPQI处理的 BSA消化物和(b)对照BSA消化物的HTInspect可视化截图。并回顾在双离子实验中LC-MS数据中形成的双离子特征使用HiTIME方法可以导致通过LC-MS在复杂混合物中检测到比使用替代质心方法更多的代谢物[3]。HiTIME已成功用于研究扑热息痛(一种镇痛药)[3]和丙戊酸(一种抗癫痫药物)[6]的体内代谢,从而成功检测到结构多样的代谢物,包括6M.G. Leeming,A.P.艾萨克湖Zappia等人粤公网安备44010502000119号××−×一系列1相氧化产物以及许多极性II相共轭产物。此外,HiTIME和双离子实验已用于帮助鉴定体外形成的化学反应性代谢物的蛋白质共价修饰靶点[7],这些代谢物被认为是特异质药物不良反应的重要介导物[16]。在研究DNA药物靶标的不同方法中,我们将同位素标记的核碱基脱氧胞苷与NAPQI反应以鉴定不同类型的加合物[8]。我们目前正在使用HiTIME和LC-MS来识别在暴露于不同类别的农药后可以被共价修饰的体内我们还收到了一些大型制药公司的兴趣,在他们的药物开发计划中使用HiTIME。5. 结论HiTIME是一种用于检测LC-MS数据中双离子信号的灵敏工具,已在检测APAP处理大鼠血浆中对乙酰氨基酚(APAP)代谢物和与亲电APAP代谢物共结合的内源性蛋白质的大量工作HiTIME接受输入并以标准mzML格式生成输出,便于与其他工具和工作流集成此外,我们的HTInspect工具允许用户可视化、查看和过滤检测到的离子,以提高特异性。HiTIME的一个显著优点是它支持轮廓和质心模式的输入,并且其新颖的存储器高效和可扩展的并行化算法允许在商品计算硬件上及时处理大数据集。CRediT作者贡献声明Michael G.概念化,方法论,软件,验证,写作-原始草稿. 安德鲁·艾萨克:概念化,方法论,软件,写作-原始草稿,形式分析,监督。卢克扎皮亚:软件,写作-重新查看编辑. 理查德A. J.William A.概念化,方法论,写作-评论&编辑,指导. Bernard J. Pope:概念化,方法论,软件,写作-原始草稿,监督。竞合利益作者声明,他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系,可能会影响本文报告的工作确认我们衷心感谢Kin Kuan Hoi对HiTIME早期版本的评估。我们感谢Michael Small教授的有益讨论关于识别双离子峰的数学方法。我们感谢墨尔本大学跨学科种子资助计划的资助。这项研究得到了维多利亚生命科学计算倡议(VLSCI)的进一步支持。BP得到了澳大利亚维多利亚州健康和医学研究奖学金的支持。MGL感谢伊丽莎白和弗农Puzey基金会授予博士奖学金和墨尔本大学授予诺玛希尔达舒斯特奖学金。附录A将N-乙酰基-对-氨基苯酚(APAP,28.9mg)、环-13C6-APAP(30.0mg)和新鲜制备的Ag2 O(117.8mg)在无水二氯甲烷(4.5mL)中合并,并在氮气气氛下在环境温度避光搅拌1小时。过滤反应混合物,滤液立即上硅胶柱,用无水Et2O洗脱.收集呈亮黄色条带的产物。向N-乙酰基-对-醌亚胺(NAPQI)级分中加入无水乙腈(8 mL),真空除去Et2O。在上述反应中使用的Ag2O如下制备:将AgNO3(2.25g)溶解在H2O(15mL)中,然后在剧烈搅拌下加入KOH(0.95g)在H2O(10mL)中的溶液。将棕色沉淀过滤并用H2O(3 × 10 - 4)10mL),然后加入MeOH(3 X IOmL)。将产物在真空下在50 ° C下干燥约10分钟。使用前3小时。将牛血清白蛋白(BSA)的储备溶液在50 mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)缓冲液(pH 8.5)中预稀释至2 mg mL-1,然后将25µ L用50 mM TEAB。将三(2-羧乙基)膦盐酸盐(2μ L,500 mM)加入到每种溶液中,并孵育30分钟。在60℃下振荡30分钟,然后使其冷却至室温。加入NAPQI/13C6 NAPQI的乙腈(40µ L)溶液或乙腈(40µ L)溶液,然后将样品在环境温度下避光孵育1 h。然后加入碘乙酰胺(3µL,500 mM),孵育样品在黑暗中30分钟通过离心除去溶剂。蒸发并将残余物重悬于H2 O(100µ L)中,并在20 ℃下储存直至分析时使用与Agilent 6520四极杆飞行时间质谱仪偶联的Agilent 1100液相色谱系统肽在Agi-借给ZORBAX Exlipse XDB C18逆转相柱(150 4.6 mm,5 µm),采用梯度洗脱,溶剂流速为0.3 mL min-1如下[时间(min),%B]:[0,0,[1,0],[40,70],[42,100],[48,100],[0,49],55,0]。质谱在 100-2500 的 m/z 使 用 具 有 1000 计 数 的 较 低 强 度 过 滤 器 的MSConvert将Agilent引用[1]Bueschl C,Kluger B,Berthiller F,Lirk G,Winkler S,Krska R,等.Bioinformatics2012;28:736-8.[2]Hoi KK,Daborn PJ,Battlay P,Robin C,Batterham P,O ' H a i r R A J , e ta l . A n a l C h e m 2 0 1 4 ; 8 6 : 3 5 2 5 - 3 2 .[3]Leeming MG,Isaac AP,Pope BJ,Cranswick N,Wright CE,Ziogas J,et al.Anal Chem2015;87:4104-9.[4]Mutlib AE. 化学研究毒理学2008;21:1672-89。[5]Schellekens RCA,Stellaard F,Woerdenbag HJ,Frijlink HW,Kosterink JGW.英国临床药理学杂志2011;72:879-97。[6]Leeming MG,Cranswick N,Wright CE,Ziogas J,O'BrienTJ,DonaldWA,etal.IntJMassSpectrom2019;444:116187.[7]LeemingMG,Donald WA,Anal Chem 2017;89:5748[8]Li S,Leeming M,Chan B,O'Hair RAJ. Aust J Chem2020;73:180-8.[9]孟X-L,罗森塔尔R,鲁宾DB.Psychol Bull 1992;111:172.[10]CapelladesJ,Navarro M,Samino S,Garcia-Ramirez M,Hernandez C,Simo R,et al. 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