主办方：埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0-262完整文章微生物生物聚合物的微杆菌WA81分批发酵Yehia Osman，Ahmed Abd Elrazak*，Wesam KhaterMansoura University，Faculty of Science，Botany Department， Mansoura 35111，EgyptA R T I CL EI N F OA B S T R A C T文章历史记录：接收日期：2016年1月21日接收日期：2016年4月26日2016年5月27日接受2016年6月4日在线发布关键词：微杆菌实验设计培养基优化生物反应器微生物生物聚合物微生物聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是生物可降解聚合物工业中使用最早和最广泛的聚合物对埃及地方细菌微杆菌（Microbacteriumsp.）使用实验工具的统计设计进行WA81生产率进行Plackett-Burman设计以筛选不同碳源和不同氮源的效果，每个碳源和氮源在单独的实验中。此外，随后的响应面法应用于实现最大的PHB生产率在摇瓶水平。在放大到台式 生 物 反 应 器 运 行 规 模 （ 5L ） 时 ， 使 用 所 产 生 的 培 养 基 ， 聚 合 物 的 量 显 著 增 加（1.42g/L），这表示先前优化的78倍增加在生物反应器运行期间，探索溶解氧（DO）的初始效应，并监测碳和氮的吸收水平总之，实验工具的统计设计使我们能够优化和设计生长培养基和条件，以提高埃及分离物Microbacteriumsp.WA81的PHB产量。© 2016曼苏拉大学.由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1.介绍包装、建筑材料和化妆品以及卫生产品等数百万种应用对塑料的需求增加，可能导致废物处理问题。这些传统的石油衍生塑料是由原油制成的，原油被认为是不可再生的资源。虽然废旧塑料可以回收利用，但塑料产生的固体废物量成为一个严重的问题，因为它的积累和降解阻力导致对环境的严重危害这些考虑有很大的影响集中在生物降解聚合物的工业规模生产。油基聚合物和生物可降解聚合物之间的主要区别是后者被土壤微生物生物降解的能力。生物聚合物含有碳和氮，其允许微生物生长，导致通过酶作用最终转化为二氧化碳和水蒸气[1，2]。多羟基链烷酸酯（polyhydroxy-alkanoates，PHAs）是一种生物高分子材料，当氮、磷等必需营养物质在碳过量的情况下只能以有限的浓度* 通讯作者。联系电话：+201000594232。电子邮件地址：ahmed_bt@mans.edu.eg（A. Abd Elrazak）。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2016.05.0012314- 808 X/© 2016曼苏拉大学。Elsevier B. V.制作和托管这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0251源头由于它们具有与各种合成热塑性塑料相似的性质，PHA可以在塑料工业中取代合成热塑性塑料[3]。它们在有氧条件下在水和二氧化碳中以及在厌氧条件下在甲烷中也完全降解。根据链中碳原子的数目，PHA分为两组：1）短链长度（SCL），其由3-这种差异主要是由于PHA链烷酶的底物特异性，其可以接受一定范围碳长度的3-羟基链烷酸[4]。SCL-PHA是具有高度结晶性的热塑性塑料，而MCL-PHA是具有低结晶度和低熔融温度的弹性或粘性材料[5]。最吸引人的SCL-PHA之一是聚羟基丁酸酯（PHB），它是结晶度高于50%的聚酯，其熔融温度为180 °C，玻璃化转变温度约为2 °C[6]。在兼性化能无机自养型氢氧化细菌Ralstonia eutropha中，以乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为代谢的中心中间体，以三个步骤进行PHB的合成，两个乙酰辅酶A分子在β-酮硫解酶（PhbA）催化下缩合为乙酰乙酰辅酶A，随后被立体特异性乙酰辅酶A还原酶（PhbB）还原为R-（-最后一步是将3-羟基丁酰-CoA聚合成PHB，伴随着CoA的释放，这是由PHB合酶（PhbC）催化的[7]。根据合成所需的培养条件细菌可分为两大类：第一类细菌，在过量碳源存在下，需要必需的营养限制，如磷、镁、氮或硫来合成PHB，包括真养产碱杆菌、扭脱原单胞菌和原单胞菌;第二类细菌，不需要营养限制环境来积累PHB聚合物，包括侧产碱杆菌突变株、棕色固氮菌和大肠杆菌重组株。在生产PHB时必须考虑这些特性[4]。生物塑料作为石油基塑料的替代解决方案的使用是有限的，因为它们的大规模生产成本高[8]。 为了克服这一问题，可以应用许多策略，包括应用较低成本的基质、改进栽培策略和开发更容易的下游加工方法[9]。聚羟基丁酸生产成本评估报告称，碳基质成本（高达50%）是总成本的主要贡献者。因此，开发廉价的碳源以提高聚羟基丁酸的含量和产率是非常重要的任何生物技术过程的生产成本都可以通过过程的优化而大大降低[10]。生物工艺优化是降低生物技术商业产品生产成本的主要因素之一。经典的优化过程总是使用“一次一个变量”的方法，产生不可靠的筛选因变量的统计设计之一是Plackett-Burman实验设计。这种设计提供了大量的筛选在少量实验（N + 1）中独立因子（N）的数量[12]。然后，通常必须应用随后的响应面方法（RSM）来检测每个研究因子的最佳浓度值[13]。RSM被发现在工艺优化中对大量工业产品有效，包括油漆和涂料、食品和饮料以及药品[14]。响应面模型能够捕捉到每个因素的主效应以及它们之间的交互作用。在本研究中，一个本地分离的细菌菌株，对筛选出的菌株进行了优化，以开发适合大规模生产的发酵工艺。进行培养基工程方法学以开发潜在的化学成分确定的生产培养基。将产生的培养基用于生物反应器运行以测试其用于大规模生产的可行性2.材料和方法2.1.菌株和培养条件在 所 有 发 酵 过 程 中 使 用 埃 及 当 地 分 离 物 微 杆 菌 属（Microbacteriumsp.）WA81，其通过16S rRNA基因序列鉴定并以登录号KM 191355保藏在GenBank数据库将培养物保持在4 °C的营养琼脂斜面上，每月传代培养。将菌株接种于无 机盐 培养 基中 ， 培养 基组 成为 ： （ NH4 ） 2SO42.0 g/L ，KH2PO42.0 g/L ， Na2HPO40.6 g/L ， MgSO4.7H2O 0.2 g/L ，CaCl2 22 0 mg/L，10 mL/L痕量金属溶液和0.1 g/L酵母提取物[13]。微量金属溶液由 1.3mg/LZnSO4.7H2O 、 0.2mg/LFeSO4.7H2O 、 0.6mg/L （ NH4 ）6Mo7O24.4H2O和0.6mg/LH3BO3组成。果糖用作碳源，浓度为40 g/L用于PHB生产培养基，10 g/L用于接种物培养。果糖通过过滤单独灭菌，然后在接种前在室温下无菌复溶用2N NaOH/2N HCl将所得肉汤的pH调节至7.0。对于接种物开发，使用含有10 g/L果糖的无机盐培养基。将生物体在含有100 mL上述培养基的250 mL锥形瓶为了生产PHB，将1 L培养基（含有40 g/L果糖）用100 mL接种物接种，并在150 rpm和30 ℃的振荡条件下保持48 h。通过在10 ℃下以5000 rpm离心20 min收获细菌细胞，并将沉淀物用蒸馏水洗涤两次。然后将细胞在冷冻干燥器（HetoPowerDry LL3000）中干燥[15]。2.2.Plackett–Burman initial screening for carbon andnitrogen在两个单独的设计中研究了除了一个虚拟变量之外的九种不同的碳源和除了虚拟变量之外的十种不同的氮源。虚拟变量用于评估实验的标准误差。通过使用存在/不存在，在高（+）水平和低（-）水平下研究每个变量我我252埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0表3可变水平-2-1 0 +1 +2麦芽糖（g/L）010203040硫酸铵（g/L）01234果糖（g/L）010203040氯化铵（g/L）01234原则（表1和表2），其中低水平代表不存在调查变量。根据初步实验选择最大水平（数据未显示）。每个因素的主要影响使用方程确定。（一）.其中Y是计算的响应，β0是模型截距，βi是每个相应变量的回归系数，Xi是相应变量，k是变量数量[16]。使用Minitab 16软件，针对9种不同碳源筛选和10种不同氮源筛选制定了两个单独的设计，每个设计具有12个试验。实验在含有100 mL基础培养基的锥形瓶中以150 rpm进行72 h。根据OD600和PHB产量（mg/L）测定响应。EXiYi（一）2.3.中心组合设计实验优化最具潜力的碳源和氮源其中E（Xi）是测试变量的效应，Y+和Y −是计算的响应，而每个变量的显著性水平（p值）使用Student t检验（等式1）确定。（2）：在两个设计中通过认真执行CCD矩阵包括每个变量的五个水平，六个中心tXiESE（二）点和星形点来估计曲率。CCD还提供了每个因素的主要影响的指示，其中（SE），变量的标准误差，计算为效应方差的平方根。任何P值0.1的变量在90%置信水平下均视为显著。反应和信号之间的关系他们之间的互动。生成二阶多项式模型，用于预测用于PHB生产的最佳生产介质组成（方程10）。4）：2水平析因设计中的显著变量是基于第一阶多项式阶（Eq.3），因为通过该筛选设计不能计算相互作用XXiiijXij（四）0ii你好，1，2，你好。，k（三）其中βi是每个因子的回归系数，βii是平方效应的回归系数，βij是交互作用的回归系数。使用Design-Expert 8.0 统 计 软 件 包 （ StatEase ， Inc ，Minneapolis，MN，USA）进行方差分析（ANOVA）。产酶培养基的主要成分为麦芽糖、硫酸铵、果糖和氯化铵。用于生成CCD矩阵的值如表3所示。在含有100 mL根据设计矩阵制备的测试培养基组合（每种的初始pH为6.5）的250 mL锥形瓶中进行31个实验（表8）将烧瓶在31.5 °C和150 rpm下在振荡培养箱中孵育。 光密度（OD600）和PHB（mg/L）为响应指标。在接种72小时后收获所有烧瓶。生成3D响应曲面图以了解测试变量之间的相互作用，并用于揭示主要影响目标响应的每种培养基组分的最佳浓度为了检查由生成的表1可变单元最低电平（−）最高水平（+）山梨醇g/L010乳糖g/L010麦芽糖g/L010蔗糖g/L010果糖g/L010阿拉伯糖g/L010右旋糖g/L010甘油g/L010乙酸钠g/L010虚设–蒸馏水去离子水表2可变单元最低电平（−）最高水平（+）尿素g/L01乙酸铵g/L01苏氨酸g/L01硫酸铵g/L01甘氨酸g/L01氯化铵g/L01硝酸铵g/L01脯氨酸g/L01精氨酸g/L01半胱氨酸g/L01虚设蒸馏水去离子水埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0253数学模型，通过应用建议的最佳培养基进行验证实验2.4.C/N比测试了26种不同的碳/氮值，以确定最佳C/N比，以达到最大生长和生物聚合物产量。绘制比值与每个响应之间的关系，估计最佳拟合线，并计算每个响应的P值，以测试C/N值对生长的影响 和PHB生产率。2.5.生物反应器中的批生长使用Eppendorf-NewBruns- Wick 5LRushton涡轮搅拌罐生物反应器（STR）以3L的工作体积进行分批运行灭菌后，根据制造商将种子培养物通过一环48小时龄的新鲜活化的细菌平板接种，并在31.5 °C下在150 rpm的振荡培养箱中保持48小时，直到种子培养物光密度（OD600）达到0.5。在31.5 °C、pH 6.5和200 rpm搅拌下进行分批培养。通过pH-mV控制器M 7832 N自动添加酸或碱（4 N）来维持培养物pH以规律的时间间隔取出样品以分析生长（600 nm处的光密度）和PHB浓度（mg/L）并进行无菌试验。将通过以10，000 rpm离心培养液10 min获得的上清液用于残留底物分析。 通过二硝基水杨酸（DNS）法[17]估计残留糖，而根据凯氏定氮法[18]测定残留氨氮。在整个批次运行中禁用气流。根据先前进行的CCD实验（第2.3节），发现麦芽糖、硫酸铵、果糖和氯化铵的建议生产培养基分别为6.06 g/L、1.09 g/L、12.12 g/L和4 g/L。将种子培养物制备为300 mL培养基，除基本培养基组分和微量金属溶液由0.2 mg/L FeSO4.7H2O、0.3 mg/L（NH4）6Mo7O24.4H2O和0.3 mg/L H3BO3组成[19]。3.结果和讨论3.1.Plackett–Burman initial screening for carbon andnitrogen使用两个单独的Plackett-Burman筛选实验优化微杆菌WA 81生长（表示为光密度（600 nm））及其PHB产生（表示为mg/L），所用的基本培养基是补充有任何碳源和氮源的化学成分确定的基本培养基，培养条件为pH 6.5、31.5 ℃和150rpm，培养72 h。这两种统计实验设计都旨在确定最有潜力的碳源和氮源，不仅是这些源的确切最佳组合，而且还为整个过程开发了一个可预测的数学模型。从表4（筛选不同碳源的影响）中，获得的数据表明，在运行3（OD600= 0.24）和12（PHB浓度= 0.095 mg/L）获得最低响应，在运行4（OD600= 0.65）和5（PHB浓度= 0.095 mg/L）获得最高响应。= 2.01mg/L）对细菌生长和聚羟基丁酸的积累有抑制作用。从表5（筛选不同氮源的影响），对于细菌生长（OD600）和PHB积累（mg/L），最高响应为1.9（运行10）和6.05 mg/L（运行1），而最低响应为0.91（运行3）和1.56 mg/L（运行10）。响应的统计分析（Minitab 16环境）确定了在90%置信水平和α = 0.1时影响生长和PHB产量的最显著因素认为P值等于或小于α具有显著性（表6和表7中的粗体值）。果糖和阿拉伯糖显示出对生长的统计学显著影响（P值= 0.042和0.066），而麦芽糖对PHB生产的统计学显著性最高（P值=0.079）（表6）。对于氮源，发现5种氮源表4运行山梨醇乳糖麦芽糖蔗糖变量果糖阿拉伯糖右旋糖甘油该死乙酸虚设响应OD600PHB(mg/升）1−−−−−−−−−−0.570.682−++−+−−−++0.520.5083++−+−−−+++0.240.24−−+++−++−+0.651.475+++−++−+−−0.522.016+−++−+−−−+0.481.067−−−+++−++−0.511.068−+−−−+++−+0.580.419++−++−+−−−0.521.4810+−+−−−+++−0.250.8811−+++−++−+−0.570.9312+−−−+++−++0.450.095254埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0表5运行尿素嗯。乙酸苏氨酸嗯。硫酸甘氨酸变量嗯。氯化嗯。硝酸脯氨酸精氨酸半胱氨酸虚设响应OD600PHB(mg/升）1−+++−++−+−−1.78 6.052+−+−−−+++−+1.47 1.963−−−−−−−−−−−0.91 2.614−++−+−−−+++1.1 3.75−−+++−++−+−1.07 2.26++−+−−−+++−1.1 2.17+−−−+++−++−1.31 3.58+−++−+−−−++1.1 2.079−+−−−+++−++1.07 2.210+++−++−+−−−1.9 1.5611−−−+++−++−+1.74 6.212++−++−+−−−+一点二四三点二十九发现变量对生长具有统计学显著影响，包括氯化铵、精氨酸、苏氨酸、甘氨酸和脯氨酸，P值分别为0.014、0.012、0.046，0.059和0.062。此外，精氨酸、硫酸铵、氯化铵和甘氨酸显示出对PHB生产的统计学显著影响，P值分别为0.012、0.027、0.033和0.079测试变量和计算响应之间的关系可以数学建模，如等式（5）和（6）所示。根据碳源对PHB浓度（mg/L）的响应如下：Y$0.9 $0.24麦芽糖$0.28< $醋酸钠（5）表6可变效果光密度（OD600）系数T值p值效果PHB系数(mg/升）t值p值山梨醇−0.15-0.079-9.420.0110.1090.0540.280.8乳糖0.0070.0030.470.6870.0490.0240.130.91麦芽糖0.0180.0091.080.3920.4910.242.110.079蔗糖0.0150.0070.920.4530.270.131.170.28果糖0.0780.0394.700.0420.410.201.750.13阿拉伯糖0.0610.033.680.0660.060.030.150.89右旋糖0.0290.0141.740.224-0.04-0.021-0.110.92甘油-0.059-0.029-3.550.0710.210.1060.920.39乙酸钠-0.129-0.064-7.720.016-0.57-0.28-2.460.049表7-显示每个变量对生长（OD 600）和PHB产生（mg/L）的影响、回归系数、T值和p值的实验设计的统计分析。可变效果光密度（OD600）系数T值p值效果PHB系数(mg/升）t值p值尿素0.0760.0381.920.19-1.42-0.71-8.100.015嗯。乙酸0.10.052.530.120.0610.030.260.84苏氨酸0.170.0894.490.046-0.38-0.19-2.210.15嗯。硫酸0.040.0211.090.391.050.52 60.027甘氨酸0.150.0783.920.0590.580.293.30.079嗯。氯化0.330.168.360.0140.950.475.40.033嗯。硝酸0.0110.0050.210.860.160.080.910.45脯氨酸0.150.0763.820.062-0.83-0.41-4.760.041精氨酸0.20.15.140.0361.60.89.110.012半胱氨酸-0.37-0.18-9.520.011-0.97-0.48-5.550.031埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0255而根据氮源对PHB浓度（mg/L）的响应将是：Y≤3.12≤ 0.71尿素≤ 0.52硫酸铵 0.29甘氨酸钾0.47氯化铵对这些图的正态图的分析表明，果糖和麦芽糖是细菌生长和生物聚合物生产的最重要的碳该本地分离株的偏好与Singh et al.[20]Aslam et al.[21]两者都有报道。 0.41脯氨酸 0.8精氨酸 0.48半胱氨酸（六）麦芽糖是提高枯草芽孢杆菌NG 220和产气肠杆菌产PHB的最佳碳源，标准化效应的正态图见图1和图2。(1a和b）和（2a和b），其中线右侧的变量具有正效应，而左侧的变量具有负效应。分别与此相反，其他几种细菌对不同的糖表现出不同的倾向，以获得最高的PHB产量例如，最高的PHB生产率是通过以下方式实现的：a）、999590807060504030201051-10.0-7.5-5.0-2.50.02.55.0标准化效应b）、999590807060504030201051三、二-10123标准化效应图1(a)以果糖和阿拉伯糖为最可能的碳源时的光密度;（b）以麦芽糖为最可能的碳源时的PHB浓度（mg/L）。果糖阿拉伯糖葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖甘油三水合醋酸山梨醇麦芽糖果糖蔗糖甘油三水合醋酸百分256埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0a）、999590807060504030201051-10b）、999590807060504030201051-10-50510标准化效应-50510标准化效应图图2(a)以氯化铵和精氨酸为最佳氮源时的光密度;（b）以精氨酸和硫酸铵为最佳氮源时的PHB浓度（mg/L）。R. eutropha [13]、巨大芽孢杆菌[22]和芽孢杆菌属（Bacillussp.）JMa5 [23]，当在发酵期间分别使用果糖、葡萄糖和蔗糖时。这些数据强调需要分别优化每种生物体的发酵条件氮源是微生物细胞积累生物聚合物的最重要因素之一，并作为维生素、氨基酸、生长因子等的前体。在一些微生物菌株中，PHA积累可与生物量生产平行出现。这种以A而闻名。Latus、甲基杆菌属ZP 24 [24]、蕈状芽孢杆菌RLJB-017 [25]和重组E. coli [26]。Microbacteriumsp. WA 81也不例外;随着细胞生长的进行，它确实积累了PHB，并且获得的聚合物的最终量取决于产生的最大生物量采用Plackett-Burman试验设计，对10种不同氮源进行WA81，表明氯化铵和精氨酸是促进细胞生长的最显著的源Amm.Chloride精氨酸苏氨酸甘氨酸脯氨酸醋酸盐尿素Amm.Sulphate半胱氨精氨酸Amm.SulphateAmm.Chloride甘氨酸Amm.Nitrate苏氨酸脯氨酸半胱氨酸尿素埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0-262257表8运行麦芽糖硫酸铵变量果糖氯化铵OD600响应聚羟基丁酸（mg/L）100002.890.14200202.0360.76300003.0870.14411−112.3660.306502002.991.436−1−11−11.4370.75700002.890.148000−21.855.37900022.442.931000003.870.141111112.0740.69121−11−11.4190.138131−1112.621.114−1−1−112.955.5115−11112.921.4816−1−1112.3311.5617−20002.52.041800003.0870.14190−2003.1680.4620−111−11.9381.9921111−13.0621.832200002.890.14231−1−112.9110.462400−202.2630.016251−1−1−11.780.3426−1−1−1−11.4920.262711−1−12.190.6228−11−112.2172.0529200021.2530−11−1−11.71.663100002.890.14粗体值代表最高的产量。微生物生长，精氨酸和硫酸铵显示出是最好的氮源用于生产PHB（图1）。 2a和b）。Beaulieu等人[27]报道了类似的结果，其中氨或铵盐对于最大化生物质浓度以及因此的PHB累积是必不可少的。研究了氨基酸作为氮源对微生物生物量积累和微生物生物聚合物生产的影响。Hamieh等人报道了嗜酸乳杆菌的PHB产量随着甘氨酸水平的升高而增加[28]。Mercan等报道了两株Rhizobium sp.; 在含有L-半胱氨酸和L-甘氨酸的培养基中观察到最高水平的PHB积累[29]。利用COBRA工具箱进行代谢建模和模拟，发现L-精氨酸是重组E. coli K-12 MG 1655中的表达，与Heshiki [30]报道的结果一致。总之，铵离子对于生物质浓度最大化和PHB积累的重要性在文献中广泛流传[27]。A. 氯化铵和硫酸铵浓度分别为1.5 g/L和1.4 g/L时，产率相对敏感，浓度变化[31]。此外，在有氧和黑暗条件下生长的耐盐光合细菌球形红细菌在硫酸铵存在下显示出最高的PHB积累[32]。营养限制对于实现最高的PHB生产是必要的，并且通常，氨用作微生物生长和PHA生产解偶联的关键调节剂[33]。综上所述，果糖、氯化铵、麦芽糖和精氨酸是影响细菌生长和微生物生物聚合物积累的最重要因素。为降低生产成本，以硫酸铵代替精氨酸作为潜在的氮源生产聚羟基选择这些3.2.中心组合设计实验优化最具潜力的碳源和氮源为了确定最佳培养基组成，如先前在第2.3节中所述进行CCD矩阵。设计的矩阵和响应总结见表8。由表9可知，氯化铵的主效应和果糖的二次效应对细菌生长有显著影响，而麦芽糖、氯化铵的主效应和果糖的二次258埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0表9可变平方和光密度（OD600）F值响应P值总和概率> F平方PHB（mg/L）F值P值概率> FA：麦芽糖0.0540.390.543.376.240.02B：硫酸0.241.750.21.683.110.09C：果糖0.0400.290.593.546.550.021D：氯化铵1.178.410.0110.420.780.39AB0.0420.300.580.0160.0290.86AC0.151.090.310.30.560.46AD0.0780.560.460.571.060.32BC0.281.980.180.250.460.5BD0.674.770.0453.937.280.016CD0.0140.0980.750.110.20.65一个21.389.870.006710.0818.670.0006B26.768e-0030.0480.825.239.690.0071C21.7112.250.00320.110.200.661D21.7212.330.003119.0635.31<0.0001粗体值表示最重要的因子。硫酸盐、果糖和硫酸铵的二次效应对聚羟基丁酸的积累有显著影响。而硫酸铵和氯化铵的交互作用、麦芽糖和氯化铵的二次效应对细菌生长和PHB产量均有显著影响。变量之间的相互作用可以在数学上建模（根据编码单元）如下（等式2）。7）：聚对苯二甲酸乙二酯1.96$0.37 A $0.26 B $0.38<$C0.5利用所建立的数学模型，对聚羟基丁酸的最佳生产条件进行了预测。根据模型预测，采用不同浓度的麦芽糖、硫酸铵、果糖和氯化铵的不同组合，可以获得最大的PHB产量和实验结果表明，当麦芽糖、硫酸铵、果糖和氯化铵的浓度分别为6.06 g/L、1.09 g/L、12.12 g/L和4 g/L时，聚羟基丁酸的产量最高预测值为6 mg/L的PHB，但获得的实际浓度略低于预期值（实际值为5.4 mg/L）。在确定增强细菌生物量和生物聚合物积累的最显著的碳和氮源之后，进行CCD矩阵以确定用于优化生产率的精确值并揭示测试变量之间的相互作用各因子的主效应、因子间的交互作用和二次效应的方差分析结果见表8。每个响应变量的模型F值和模型P值均表明模型显著，由于光密度（4.6%）和PHB（0.21%）产生的噪声，模型F值较大的可能性非常低。在90%的置信水平下，任何P值小于0.1的因素都可以被认为是统计学意义P值越小，相应变量的显著性越高[34]。表8中所示的每个变量的P值清楚地表明氯化铵的主效应是影响生长的最显著因素，而麦芽糖、果糖和硫酸铵的主效应被发现对PHB产率浓度具有显著影响。氯化铵和硫酸铵之间的双向交互作用对菌株的生长和PHB的产生都有显著的影响。此外，麦芽糖和氯化铵的二次效应对菌体生长和PHB产量有显著影响，而硫酸铵的二次效应仅对PHB浓度有显著影响与单因素实验不同，统计设计的实验能够测试因素之间的交互作用的效果 除了评估变量的二次效应的平方项之外。硫酸铵和氯化铵之间的显着相互作用的关系的PHB浓度可以归因于足够的NH3浓度，允许大部分的NADPH用于氨基酸的生物合成，并激活细胞生长。NADPH用作乙酰乙酰辅酶A还原酶的辅酶，用于在氮限制条件下将乙酰乙酰辅酶A转化为（R）-3-羟基丁酰辅酶A从这些结果可以得出结论，通过提供NADPH过量的条件可以增强PHB的产生。在化学成分确定的培养基中添加复合氮源、油酸或氨基酸可显著提高重组E.由于乙酰辅酶A的可用性增加，大肠杆菌[35]。这些实验结果得到了乙酰辅酶A和NADPH对重组大肠杆菌胞内代谢流分布影响的研究的支持。杆菌代谢通量分析的结果表明，为了达到最大的PHB产量，大约一半的碳通量应被引导到戊糖磷酸（PP）途径，埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0259并且应该关闭到TCA循环的通量。这两种途径影响多聚（3HB）合成的两种底物NADPH和乙酰辅酶A的可用性[36]。根据生成的数学模型，最大产量的因素的最佳组合估计为6.06 g/L，麦芽糖、硫酸铵、果糖和氯化铵分别为1.09 g/L、12.12 g/L和4 g/L在这些最佳条件下达到的最大生产率为5.4在摇瓶水平下每升10mg的PHB。3.3.C/N比使用化学成分确定的培养基的优点之一是可以容易地测试C/N对PHB生产的影响。C/N值从所进行的CCD实验理论上计算。该设计包含31个不同的试验，26个不同的C/N值。绘制比值和每个响应之间的关系（图3a和b），估计最佳拟合线，并计算每个响应的P值，以测试C/N值对分离株生长和生产力的影响。高C/N比对菌株的生长和生产力有负面影响。较低的C/N值是优选的，这表明较高的氮需要更好的生长和PHB生产。C/N比对细菌生长和PHB产生的影响的P值分别为0.048和0.024。 这些结果表明，C/N的影响在99.97%和99.96%的置信水平下可能是显著的，这具有统计学意义。当C/N比为8.2/1时，PHB的产量最高（5.5mg/L）。这些结果表明，C/N比为8/1时，聚合物的积累量明显减少，而C/N比为8/1时，聚合物的积累量最大。在生物体中，碳（C）需求通常大于氮（N）需求。这些元素的平衡（C/N）决定了细菌如何使用有机材料[37]。为了提高聚羟基丁酸的生产，不同的C/N比产生的不同组合在进行CCD试验进行了比较，以确定最佳的比例。当C/N比为8.2/1时，PHB的产率最高（5.5mg/L）。这一结果表明，8/1的C/N比是最佳的聚羟基丁酸的积累，这与魏等报道的结果一致。关于台湾贪铜菌[38]。将C/N比从（5.7/1至52/1）增加导致分离菌株内的PHB积累显著减少;这可能是由于相对高浓度的碳，先前报道其在相对高浓度下抑制菌株台湾贪铜菌184的PHB生物合成[38]。此外，高C/N和低C/N比可能影响微生物的生理条件，包括细胞增殖和PHB聚合[37]。这些数据表明，虽然碳源的绝对浓度是重要的，但C/N比也有临界值，因为在很高或很低的碳源和氮源浓度抑制的PHB积累可归因于高浓度的硫酸铵或高C/N比[39]。3.4.生物反应器中的批生长在摇瓶水平优化培养基组成后，使用工作体积为3 L的图4a和b显示了微杆菌属物种WA 81在显影培养基上的生长曲线。经过约20 h的停滞期后，细菌生长迅速，56 h后OD600达到2.343，此时最大积累量为1.42 g/L。在相同的生长阶段，1.2 g/L的氮被消耗，而约13.5 g/L的补充糖被代谢。然后，细菌继续缓慢生长，通过喂养剩余的糖和积累的量减少的聚羟基丁酸。在大多数微生物中，PHB是一种食物储备，当外部碳源耗尽时，它会降解以提供碳和能量[31，40]。溶解氧是生长期PHB积累的最可能原因之一。 这种控制的关键特征是乙酰辅酶A的命运，乙酰辅酶A可以通过三羧酸（TCA）循环被氧化或可以用作PHB合成的底物。在氧限制下，当NADH/NAD比率增加时，柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶被NADH抑制，结果乙酰辅酶A不再以相同的速率进入TCA循环。相反，它通过3-酮硫解酶（PHB生物合成的第一种酶因此，在这种条件下，通过TCA循环的碳通量大大降低[41]。测试了不同空气流速对微杆菌属菌株WA 81的影响，发现向容器中鼓泡空气导致除了生物膜的形成之外，该菌株的生长和其降解PHB的能力的显著抑制。因此，在完全不存在空气的情况下进行分批生物反应器运行。在高氧存在下对PHB积累的抑制可能是由于所产生的高剪切力，这被证明通过许多微生物抑制了PHB的生物合成[42，43]。4.结论在本研究中，使用DOE工具，将可生物降解的聚合物聚羟基丁酸 （PHB ） 用于提 高其 从当地 埃及 分离 的微 杆菌 属（Microbacterium由于碳源和氮源对菌体积累的重要性，本研究通过两个单独的PBD实验筛选不同的碳源，发现麦芽糖和精氨酸对菌体积累的影响最大，果糖和氯化铵对菌体生长的影响最大。应用随后的CCD来检测每种来源的最佳浓度和C/N比以产生化学成分确定的培养基，并如下组合6.06麦芽糖、硫酸铵、果糖分别为1.09 g/L、12.12 g/L和4 g/L和 铵 氯化 分别的260埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0图3当C/N为8.2/1时，PHB的产量最高优化的培养基最终用于在pH恒定条件下在生物反应器（5L）中测试生长和PHB积累，以研究所研究的分离物对生长和PHB产生的改善在分批培养中，PHB的生成量显著增加发酵液的最佳浓度为1.5g/L，发酵液的产量提高了78倍甚至在优化生物反应器水平的培养条件之前获得该值，这表明优化生物反应器条件可以导致增加的PHB生产率，使我们的分离物成为用于工业规模生产这种有价值的生物聚合物的潜在高产者。埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0261图4在优化的培养基组分上，在受控条件下对WA81进行了优化(a)所研究的分离物的生长和生产力;（b）分离物对糖和氮的利用。R E F E R E N C E S[1] 弗罗曼岛生物降解聚合物。材料2009;2：307-44.[2] Farrin J.来自自然资源的可生物降解塑料。Rochester，NY：Institute of Technology，2005.[3] Madison LL，Huisman GW. 聚（3-羟基链烷酸酯）的代谢工 程 ： 从 DNA 到 塑 料 。 微 生 物 学 分 子 生 物 学 评 论1999;63：21-53。[4] Khanna S，Srivastava AK.微生物聚羟基脂肪酸酯的研究进展。工艺生物化学2005;40：607[5] Kim DY，Kim HW，Chung MG，Rhee YH. 细菌中长链聚羟基烷酸酯的生物合成、改性与生物降解。微生物学杂志2007;45：87262埃及基础与应用科学杂志3（2016）25 0[6] TsugeT.在聚羟基链烷酸酯的微生物生产中代谢改进和廉价碳源的使用。生物科学与生物工程杂志2002;94：57984.[7] Pötter M，Steinbüchel A.聚羟基脂肪酸酯颗粒的生物成因和结构。原核生物中的包涵体Berlin：Springer-Verlag. p.109比36[8] Choi J，Lee SY.影响细菌发酵生产聚羟基烷酸酯经济性的因素。应用微生物学和生物技术1999;51：13-21.[9] Grothe E，Chisti Y.侧产碱杆菌生产聚β-羟基丁酸热塑性塑料：补料分批培养的行为。生物过程工程2000;22：441-9.[10] 放大图片作者：Ramadas NV，Soccol C，Pandey A.球形芽孢杆菌NCIM 5149深层发酵生产聚羟基丁酸酯的中心组合设计应用微生物学和生物技术2010;162（4）：996-1007。[11] 吴晓刚，王晓刚. 海洋巨大芽孢杆菌MSBN 04固态发酵生产聚羟基丁酸的优化Int JBiol Macromol2013;60：253-61.[12] Plackett RL，Burman JP.最佳多因子试验设计。Biometrika 1946;33：305[13] Khanna S，Srivastava 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