副干酪乳杆菌LN-1盐胁迫反应蛋白的鉴定

© 2014 Rina Wu，Xin Xu，Lingshuai Meng，Tingting Zou，Xiaoyang Tang，Junrui Wu，Xiqing Yue.由爱思唯尔公司出版信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.com上在线获取ScienceDirectIERI Procedia 8（2014）60 - 652014年农业与生物系统工程SDS-PAGE鉴定副干酪乳杆菌LN-1盐胁迫反应蛋白吴丽娜1，徐欣1，孟凌帅1，邹婷婷1，唐晓阳1，吴俊瑞1，2 *，岳希清1 *1沈阳农业大学食品科学学院，沈阳110866; 中国2工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物技术学院食品安全与营养协同创新中心，无锡214122 中国摘要乳酸菌在发酵工业中的应用越来越广泛，不仅是因为乳酸菌能够形成食品的质构和关键风味，而且还因为乳酸菌对人类健康的贡献。在工业生产过程中，乳酸菌会面临各种环境胁迫，其中就包括盐胁迫.采用SDS-PAGE电泳技术，从蛋白质水平研究了从中国传统发酵食品榨菜中分离到的一株潜在益生菌副干酪乳杆菌LN-1对盐胁迫的响应。结果表明，在6.5%和8.0%NaCl胁迫下，该菌株均能表达一个小分子热激蛋白，可能与该菌株的渗透胁迫耐受性有关。利用RT-PCR检测了盐胁迫下菌株hsp 60和hsp 70© 2014作者。由爱思唯尔公司出版 这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：盐胁迫; SDS-PAGE; sHSP* 通讯作者。联系电话：电话：024-88490700传真：024-88487162电子邮箱：junruiwu@126.com，yxqsyau@126.com。2212-6678 © 2014作者由爱思唯尔公司出版 这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。信息工程研究所负责的选择和同行评审Rina Wu等人/ IERI Procedia 8（2014）60611. 介绍乳酸菌作为发酵剂广泛应用于发酵工业中，形成食品的质构和风味。乳酸菌产生的乳酸对腐败菌的生长也有一定的抑制作用。此外，由于LAB对人类健康的贡献，LAB的重要性质被认为是安全的启动剂（Stiles等人，1996年）。因此，人们对实验室的兴趣正在上升。在工业生产过程中，乳酸菌经常面临着不同的环境胁迫，如热、冷、酸、盐胁迫等，影响乳酸菌的代谢。在以往对乳酸菌的研究中，热休克蛋白（HSPs）是乳酸菌对环境胁迫的反应蛋白。进一步的研究表明，HSP具有保护其他蛋白质免受环境应激损伤的能力，并且在从应激恢复期间有助于细胞功能的正常化（Nover等人，1997年）。热休克蛋白（HSPs）属于分子伴侣，包括Hsp60（GroEL）、Hsp70（DnaK）、Hsp100等，是一类功能相关的蛋白质，参与蛋白质的折叠和周转。最近，已经在LAB中鉴定了GroEL和DnaK的蛋白和基因，其表达在应激条件下被诱导。在瑞士乳杆菌PR 4中，GroEL和DnaK被鉴定为热应激（Di Cagno等人，2006年）。在pH 5.0的化学成分确定的培养基中培养的乳酸乳球菌MG 1363中也发现GroEL和DnaK不受调节（Budin-Verneuil等人，2005年）。而Kilstrup等（1997）也鉴定了L.乳酸菌MG1363在盐胁迫下的生长情况。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，从蛋白质水平上研究了一株潜在的益生菌副干酪乳杆菌（Lactobacillu paracasei）LN-1对这将有助于更好地了解盐胁迫对食品加工过程中乳酸菌的影响。2. 材料和方法2.1. 细菌生长条件本研究所用菌株为L.分离自中国辽宁省传统自制的酸菜的副干酪LN-1（Wu等，2014年）。对于盐胁迫响应分析，1.0%（v/v）的L.将pracasei LN-1培养到含有MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）和MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）（MRS-M）的100 mL新鲜De Man、Rogosa和Sharpe肉汤（含0%、3.0%、6.5%、8.0%NaCl（w/v））中，并孵育直至620 nm处的密度达到0.8（对数中期，约3.2× 108CFU/mL）。然后通过在4 °C下以4，000 ×g离心5 min收集适当的培养物用于蛋白质提取。2.2. 蛋白质提取使用具有一些改进的超声处理方法提取蛋白质（Gonzalez-Marquez等人，1997年）。将培养物样品悬浮于含有8M尿素、60mM DTT、4%CHAPS和ImM PMSF的裂解缓冲液中。超声时间30 s，脉冲宽度30 s，功率25 W，超声时间5 min。冰水是用来保持低温的。以10，000 ×g离心30 min收集细胞蛋白。将上清液中的可溶性蛋白置于-80 ° C下采用Bradford试验检测蛋白浓度（Bradford 1976）。如Laemmli（1970）所述，在研究中使用Mini Protean 3 Cell电泳仪。62Rina Wu等人/ IERI Procedia 8（2014）602.3. SDS-PAGESDS-PAGE由5%的堆积胶和12.5%的分离胶组成。用5 μ L 6×溴酚蓝将样品体积控制在每份样品中20 μ g蛋白质。在80V的恒定电流下通过堆积凝胶和120V的恒定电流下通过解析凝胶进行电泳。R250用于染色凝胶。2.4. 凝胶分析和蛋白质鉴定通过PDQuest 6.0（Bio-Rad，USA）扫描和分析凝胶。根据Wu等人（2009），切除差异表达的蛋白质，并进行肽胰蛋白酶性能。将凝胶片放入4700蛋白质组学分析仪（ABI，USA）中进行蛋白质鉴定分析。GPS ExplorerTM v3.5软件（ABI，USA）用于测定针对硬壁菌门蛋白质的NCBInr数据库的质谱数据。2.5. 实时PCR在研究中使用EZNATM细菌RNA试剂盒（Omega Bio-tek，USA）从细胞中提取总RNA，并将不含RNA酶的DNA酶-I（Omega Bio-tek，Inc）添加到最终RNA中以消化基因组DNA。此外，使用PrimeScriptTM RT试剂盒（TaKaRa，日本）通过100ng总RNA逆转录cDNA。10 μl反应体系包括0.5μlRT酶混合液、1×缓冲液和50 pmol随机引物。然后，进行RT-PCR。在50μl提取混合物中使用1 μ lcDNA模板，0.6×SYBR Green-I染料（Generay Biotech，China），1×缓冲液，0.3 μ l rTaq聚合酶，0.5μ M每种引物，0.2加入mM dNTP混合物。该程序包含40个扩增循环，包括94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。在PCR扩增中，GAPDH用作内部对照。根据L.在NCBI上的paracasei如下，hsp 60（上：上：5 ′-CCTGACATTGAGAACCAAAATA-3′，下：5′-TTGGAAGCCCATACCTACGACT-3 ′ ） 和 hsp 70 （ 5 ′-TGACGATATGCACAACTATAGC-3 ′ ， 下 ： 5 ′-GCATCCGATCAACAAGCGAGAG-3 ′）。熔化仔细监测每个PCR的曲线以避免非特异性扩增。通过使用比较Ct方法转换基因表达量化。3. 结果和讨论3.1. SDS-PAGE分析L.在MRS-M中，用0%、3.0%、6.5%、8.0%NaCl从中期指数期细胞中提取副干酪LN-1，并通过SDS-PAGE解析（图1）。L.副干酪LN- 1在含3.0%、6.5%、8.0%NaCl的MRS-M培养基中生长受到不同程度的抑制，但在含3.0%、6.5%、8.0%NaCl的MRS-M培养基中仍能生长。氯化钠。比较蛋白质图谱，可以观察到高度的视觉和数值相似性。结果表明，SDS-PAGE适合于乳酸菌蛋白质的分离。此外，SDS-PAGE也已用于鉴定复杂资源中涉及的LAB（Kersters et al.，1980年）。3.2. 不同蛋白质鉴定Rina Wu等人/ IERI Procedia 8（2014）6063进一步比较发现，在L.副干酪LN-1在含6.5%和8.0%NaCl的MRS-M中生长，而在含0%和3.0%NaCl的凝胶中不出现。这些小蛋白质难以使用标准生物化学技术检测（Hemm et al.，2010年）。通过质谱鉴定，发现盐胁迫诱导了小分子热休克蛋白（sHSP）的表达。副干酪LN-1。此外，该蛋白可以被高于3.0%的NaCl诱导。Fig. 1.对数生长中期蛋白质的SDS-PAGE分析。副干酪LN-1在含0%（1）、3.0%（2）、6.5%（3）和8.0%（4）NaCl的MRS-M中培养。sHSPs是热休克蛋白中重要的小分子成员之一。sHSP通常在12-30 kDa之间。sHSP广泛分布于细菌和动物中，除了一些细菌物种，例如生殖支原体（Narberhaus 2002）。sHSP对于细菌对环境应激的反应也是至关重要的，因为其能够充当ATP非依赖性伴侣。伴侣蛋白可以抑制变性蛋白在应激下的聚合，并在最佳条件下促进变性蛋白的重折叠，以维持蛋白的正常结构和功能（Ehrnsperger etal.，1997年）。因此，许多研究现在集中在LAB和其他细菌中涉及的sHSPs的表达和修饰上。O’Sullivan et al. previously reported that 1999年）。此外，在S.在嗜热菌中，编码shsp的pAGS4E已被证明能够保护细胞免受高酸，如pH3.5的影响（EI Demerdash等人，2003年）。近年来，基因组分析在乳酸菌的研究中得到了广泛的应用。基于对短双歧杆菌UCC 2003的基因组测序分析的研究，发现了单一的sHSP编码基因hsp20。热应激和渗透压休克可以上调hsp20的转录（Ventura et al.，2007年）。因此，本研究结果提示，在L.副干酪LN-1可能与菌株获得的渗透功能有关。进一步的研究正在我们的实验室进行值得注意的是已知sHSP蛋白参与细菌对盐胁迫的抗性3.3. 基因表达本研究进一步研究了热休克蛋白60和70在L.在盐胁迫期间使用实时PCR检测副干酪素（图1）。2）的情况。64Rina Wu等人/ IERI Procedia 8（2014）60图二、实时荧光定量PCR分析L. 在0%、3.0%、6.5%和8.0%NaCl的MRS-M培养基中生长。热休克蛋白60和70的转录谱具有不同的表达模式。hsp 70在8.0%NaCl浓度下表达量最高，与蛋白表达水平相匹配;hsp 60在3.0%NaCl浓度下表达量急剧增加，6.5%和8.0%NaCl浓度下表达量下降。它可能与早期翻译和运输储存的mRNA在指数阶段。需要进一步研究确认本研究得到了国家自然科学基金的资助辽宁省教育厅科研基金（批准号：31000805、31370502）国家高技术研究发展计划（批准号：L2012249）国家“863”计划（批准号：2011AA100902）、辽宁省高校优秀人才计划（批准号：LJQ2011071）、沈阳农业大学天柱山人才计划。引用[1] 斯泰尔斯我。乳酸菌的生物保存Antonie van Leeuwenhoek 1996; 70：331-345.[2] Nover L，Scharf KD.热应激蛋白和转录因子。Cell Mol Life Sci 1997; 53：80-103.[3] 刘晓波，李晓波. 瑞士乳杆菌PR4在奶酪乳清中繁殖过程中对温度梯度降低的热应激的响应。应用环境微生物学2006; 72：4503[4] [10]杨文辉，杨文辉. 乳酸乳球菌MG1363耐酸性反应的蛋白质组学表征。蛋白质组学2005; 5：4794[5] Kilstrup M.，Jacobsen S，Hammer K，Vogensen FK.盐胁迫对乳酸乳球菌热休克蛋白DnaK、GroEL和GroES的诱导，应用环境微生物学1997; 63：1826[6] 吴荣，吴宗新，吴继瑞，孟军。盐胁迫诱导副干酪乳杆菌蛋白质表达的蛋白质组学分析。AnnMicorobiol 2014;已接受，DOI：10.1007/s13213-013-0776-9。[7] [10]杨文，李文. 嗜热链球菌PB18在酸性环境中过表达的一个16 kDa蛋白家族微生物学1997;143：1587[8] Bradford MM.一种利用蛋白质-染料结合原理定量微克量蛋白质的快速灵敏方法。分析生物化学1976; 72：248-254.[9] Laemmli UK.噬菌体T4头部装配过程中结构蛋白的裂解。Nature 1970; 227：680-685.Rina Wu等人/ IERI Procedia 8（2014）6065[10]吴 荣 ， 王 WW ， 余 德 霖 ， 张 伟 英 ， 李 英 ， 孙 忠 ， 吴 金 荣 ， 孟 华 ， 张 惠 萍 . 干 酪 乳 杆 菌（Lactobacillus caseiZhang）的蛋白质组学分析。MCP 2009; 8：2321-2338.[11]Kersters K，De Ley J.通过蛋白质电泳对细菌进行分类和鉴定。微生物学分类和鉴定。GoodfellowM，Board RG（Eds.），学术出版社，伦敦，英国，273[12] [10]李晓，李晓.小分子应激反应蛋白大肠杆菌：经典蛋白质组学研究遗漏的蛋白质J Bacteriol 2010; 192：46[13]纳伯豪斯湾晶体型热休克蛋白：多分子伴侣网络中的社会化微分子。微生物学分子生物学评论2002; 66：64[14]Ehrnsperger M，Graber S，Gaestel M，Buchner J.在热休克过程中非天然蛋白与Hsp25的结合产生了用于再活化的折叠中间体的储存库。EMBO J 1997; 16：221[15]放大图片作者：O'Sullivan T，van Sinderen D，Fitzgerald G. 嗜热链球菌ND 1 -6的6.5kb质粒pCI65 st的结构和功能分析微生物学1999; 145：127[16]放大图片作者：Michael K.编码小分子热休克蛋白的shsp基因作为乳酸菌食品级选择标记的应用。应用环境微生物学2003; 69：4408- 4412。[17]张志忠，张志忠.编码短双歧杆菌UCC2003小分子热休克蛋白的热休克蛋白20的分子特征应用环境微生物学2007; 73：4695-4703。