COVID-19疫情下基于医学信息学方法的新型抗病毒药物研究

医学信息学解锁26（2021）100758利用电子药效团建模、分子对接、分子动力学和量子力学研究Abdulrahim A. Alzain，PhD 1，*，Fatima A. Elbadwi1苏丹吉萨大学药学院药物化学系A R T I C L EI N FO保留字：SARS-CoV-2TMPRSS2同源模建电子药效团定位和筛选对接分子动力学A B S T R A C TSARS冠状病毒2（SARS-CoV-2）已在世界各地迅速传播，并继续对全球健康产生巨大影响，导致一种名为冠状病毒感染-19（COVID-19）的传染性呼吸道疾病。TMPRSS 2是一种新兴的分子靶点，在SARS-CoV-2感染的早期阶段发挥作用;因此，抑制其活性可能是COVID-19的靶点。本研究旨在使用许多计算方法来提供可以优化为临床候选药物的化合物。由于没有实验来源的蛋白质信息，首先我们开发了TMPRSS2模型。然后，我们从TMPRSS 2活性位点生成药效团模型，并使用所开发的模型从Enamine数据库中筛选一百万个分子。然后使用基于电子药效团的筛选、分子对接、自由能估计和分子动力学模拟对所创建的模型进行筛选。并进行了ADMET预测和密度泛函理论计算。三个潜在的分子（Z126202570、Z46489368和Z422255982）表现出与靶标有希望的稳定结合相互作用。总之，这些发现使这些化合物作为新型抗COVID 19药物的进一步体外和临床评估成为可能。1. 介绍当前的COVID-19冠状病毒病大流行是与SARS-CoV-2疾病相关的全球健康问题[1，2]。截至2021年8月7日，该流行病已增加到超过2亿人患病，超过400万人死亡[3]。这种流行病对国家医疗保健系统产生了负面影响，并给全球经济带来了沉重打击，因此需要开发有效的治疗方法来阻止其传播并控制其严重程度[4]。冠状病毒可以影响动物和人类，产生广泛的疾病[5]。MERS冠状病毒，SARS冠状病毒和2019年12月起源于武汉的2019冠状病毒是迄今为止发现的三种传染性病毒性人类冠状病毒（hCoV）[6，7]。然而，根据世卫组织的统计数据，SAR-CoV-2在人群中传播的发生率远远超过了SARS冠状病毒和MERS冠状病毒[8]。从病毒表面延伸的跨膜刺突糖蛋白（S蛋白），使冠状病毒具有冠状（外观[9]。α、β、γ和δ是迄今为止冠状病毒的四种类型[10]。蝙蝠被认为是SARS-CoV-2的来源，SARS-CoV-2是一种β冠状病毒，可以在不引起疾病的情况下传播。感染因子是一种病毒，具有4种糖蛋白：刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白[11，12]。病毒COVID-19疾病的进展[13]。对于病毒增殖，所有冠状病毒都具有在下游ORF 1区域编码蛋白质的独特基因。刺突糖蛋白控制病毒粘附和进入[14]。病毒各种病毒，包括SARS冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒和MERS冠状病毒，利用宿主细胞蛋白酶来激活它们的免疫原性。膜糖蛋白，根据先前[18跨膜蛋白酶/丝氨酸亚家族构件2切割和激活 的SARS-CoV-2刺突蛋白，对膜融合和宿主细胞穿透至关重要[21-23 ]。值得一提的是，当日冕 尖峰 蛋白 结合 到 的 ACE2 受体， 的 宿主细胞的* 通讯作者。 21111 Barakat Street，Medani，Gebra，苏丹。电子邮件地址：abdulrahim. uofg.edu.sd，awh3134@hotmail.com（A.A.Alzain）。1 作者贡献同样大。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100758接收日期：2021年8月27日;接收日期：2021年9月22日;接受日期：2021年10月11日2021年10月14日网上发售2352-9148/©2021的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊首页：www.elsevier.com/locate/imuA.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007582=±Fig. 1. 研究工作流程。周围的丝氨酸蛋白酶TMPRSS-2受体通过引发刺突蛋白的S-2结构域促进病毒由于TMPRSS 2 mRNA在多种组织中丰富，包括前列腺、肾、小肠、肺和胃等，它与疾病的进展和严重程度有关[1，18，27，因此，TMPRSS 2加工是激活SARS-CoV-2 S蛋白由于TMPRSS 2的极端作用，它可能是对抗COVID-19感染的有希望的治疗靶标[30，31]。全球几个研究小组正在进行密集的尝试，以寻找新的药物，但这可能需要相当长的时间，因为目前的药物必须通过长期的临床前和临床安全性测试[32]。基于结构的药物发现是目前应用最多、最新的药物发现方法之一研究药物作用的技术当实验-如果心理方法失败或关于靶点的数据不足，同源性建模是一种成功的计算机策略，用于开发靶蛋白的三级结构，以估计对接研究的结构信息[34] 。 药 物 化 学 家 可 以 合 成 的 化 合 物 的 数 量 可 以 通 过 使 用 phar-macophore模型创建而大大减少。因此，可以减少药物研发时间和成本[35]。它提供了在广泛的结构不同的化合物的活性估计，也可以帮助发现新的分子与增强的活性[36，37]。药效团模型显示了关键的化学特征，负责在一个逻辑的方式活动。 近年来，药效团建模一直是新药开发最基本和最有前途的方法之一[38]。在本研究中，我们的目标是通过以下途径找到新的TMPRSS2抑制剂：使用计算机模拟方法，即同源建模来构建TMPRSS 2蛋白模型，药效团作图和筛选，对接来计算它们的结合亲和力和它们的自由结合能。分子动力学和密度泛函理论计算也进行了验证的结果。2. 方法所有计算机模拟研究均由Maestro v 12.8（Schro- dinger 2020）进行，如图所示。1.一、2.1. 同源建模搜索和模型制备TMPRSS2序列从UniProt（登录号：015393）下载[39]。 使用BLAST服务器[40]为了找到TMPRSS2建模的最佳模板基于42.21%的序列同一性和47%的序列相似性，人血浆激肽释放酶是同源性建模的最佳模板。因此，从蛋白质数据库获得人血浆激肽释放酶3D结构（PDB ID：5TJX）[41]并用作Prime中的模板。Schrodinger suite [42].使用单模板比对（STA）进行比对，并使用蛋白质 预 测 向 导 的 基 于 知 识 的 方 法 ， 使 用 薛 定 谔 素 数 （ Prime ofSchrodinger）构建模型。然后，使用蛋白质制备向导工具[43]，对蛋白质结构模型进行预处理，以纠正结构中所有键的顺序，并通过Epik，在指定的pH范围内确认适当的配体电离和互变异构状态。氢原子被添加到结构中;键被打破到金属上，并纠正金属和相邻原子上的形式电荷，将键视为离子键，这是与力场一起使用所需的，力场将金属化合物视为离子而不是共价键。然后在金属和它的配体之间添加零级键，这样它仍然被认为是同一分子的一部分。它还发现了彼此之间在3.2埃范围内的硫原子，并在它们之间添加了键。此外，通过在PH 7中使用PROPKA优化氢键顺序来改进模型，并在OPLS3e力场中进行约束最小化以降低侧链能量。用薛定谔用于进一步验证，以估计优化同源性模型的模型有效性[44]。2.2. 活性部位预测使用SiteMap工具预测TMPRSS2蛋白的受体位点。该软件使用蛋白质表面上的网格点，这些网格点可能适合配体与受体结合，以提供关于结合位点质量的数据。该过程的最后一部分是评估，其中包括通过计算不同的产品特点：提供位点对溶剂的可利用性的不同测量的两个特征是暴露和封闭、供体/受体特征、H供体/受体区域;接触、位点分数和位点吸收和结合小分子的能力（可药用性）。2.3. 配体库制备和网格生成下载来自Enamine数据库[45]的百万种化合物的化学结构，并使用LigPrep [43]制备。LigPrep确保优化化合物结构，排除结构上不理想的配体，并为输入配体开发具有最佳手性的低能三维结构。简而言之，在pH 7.0 - 2.0下定义配体的电离状态，并使用Epik除去盐。对于每个配体，允许产生最多32种构象。通过OPLS3e使每个配体的能量最小化网格生成面板用于创建网格。 网格是在活性位点的质心处构建的一致性的要点A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007583=2.4. E-药效团生成图二. A. 蛋白质结构，B. 拉玛钱德朗图。并在NPT下使用Desmond的默认方法进行松弛。模拟时间为50纳秒，温度（300 K）和压力使 用 Schrodinger 的 Phase 模 块 中 的 Generate pharmacophore fromReceptor Cavity选项[46]，使用SiteMap预测的活性位点氨基酸的受体质心开发了能量优化的药效团假设。在生成e-药效团之前，Phase首先使用Glide XP工具将已结合的配体停靠在研究蛋白质的结合口袋内，并选择排名最高的姿势用于自动药效团生成，同时考虑以下六种化学特征：芳环（R）、氢键受体（A）、疏水基团（H）、氢键供体（D）、负离子特征（N）和正离子特征（P）。2.5. 基于电子药效团的数据库筛选对于针对TMPRSS 2的e-药效团筛选，利用烯胺数据库的制备构象。这些化合物必须在所创建的电子药效团模型上匹配至少五个特征，以获得具有适当化学特征的TMPRSS2抑制剂。2.6. 生成的化合物与MM-GBSA分子对接使得有可能预测所产生的化合物对靶标的强度和亲和力，并且还可以确定所产生的化合物对靶标的亲和力该化合物交互.通过HTVS滑移模式将所得构象对接到TMPRSS 2活性位点[42]，然后将排名靠前的构象进行SP滑移模式，并进一步进行XP模式。将结果与批准的TMPRSS2抑制剂氨溴索乙酰胆碱酯和萘莫司他甲磺酸盐进行比较。通过使用Prime-MMGBSA函数的默认设置[42]，还对排名最高的XP对接姿势进行了MM-GBSA估计，并与已知的TMPRSS 2抑制剂ambroX ol acefyllinate和nafamostat mesylate进行了比较2.7. 分子动力学用分子动力学方法研究了顶层化合物与TMPRSS 2复合物的结合稳定性。它有助于评估蛋白质和配体之间的相互作用模式以及时间依赖性蛋白质-配体相互作用关联和复杂系统的构象动力学。使用AcademicDesmond v6.5由D.E. Shawn Research [47]，将蛋白质-配体复合物最小化表1TMPRSS2蛋白的五个预测活性位点的特性（1.01325巴）在整个过程中通过Nose-Hoover恒温器和Martyna-Tobias-Klein恒压器保持恒定。 在MD模拟中使用OPLS3e力场。在模拟期间，收集了每个系统的5208帧。最后进行了交互作用分析。2.8. 密度泛函理论使用Jaguar [47]，使用优化面板对顶部分子进行密度泛函理论计算。在工作空间中包括结构之后，理论被调整为DFT，其允许采用各种泛函来描述开壳层或闭壳层系统的交换和相关。在6- 31 G ** 水平上，采用泛函B3 LYP方法进行几何优化。几何形状优化了100次。SCF计算的准确性是快速的，其使用具有松散截止的混合伪谱网格（iacc 3）。泊松玻尔兹曼解算器是 用于计算水体中的能量以模拟生理环境。分析了分子的静电性质3. 结果3.1. 同源模建TMPRSS 2-刺突结构目前不可用，其具有234个氨基酸的三维结构利用人血浆激肽释放酶作为模板建模，以更好地解释底物与TMPRSS 2受体的结合机制。使用TMPRSS2序列，血浆激肽释放酶模板具有最高水平的相似性和同一性。对TMPRSS2模型进行模型细化和能量最小化（图2A）。Ramachandran图（图2B）显示了预测模型的质量，因为大多数残留物都在有利和允许的区域。3.2. 活性部位预测结合位点及其物理化学特性的表征不仅在新化合物的产生中是必不可少的，而且在具有已知结合特征的分子的鉴定和优化中也是必不可少的。源自PDB数据库的模板结构不含任何共结晶配体。结果，使用SiteMap获得结合位点（表1和图2）。 3）。站点1被选为标题SiteScore大小Dscore体积暴露接触恐惧症亲油唐/ACC位点11.0161101.067262.7380.6220.8850.730.8291.705位点20.951270.95543.9040.461.3834.9460.2940.99位点30.875710.86169.7850.5870.9540.6581.0481.375位点40.866660.857282.2890.7070.8110.4950.9731.179位点50.727410.51895.3540.6671.0220.0921.5170.362A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007584-----图3.第三章。TMPRSS2的选定活性位点。（图 4）.使用TMPRSS 2的经验证的电子药效团模型从烯胺数据库中筛选超过400万个制备的分子。来自数据库中存在的化合物和构象异构体的总数。31340个化合物符合筛选的假设。随后，这些命中通过三层Glide对接方法进行基于对接的配体筛选。图四、 生成的 TM PRSS 2活 性位 点 的 e-药效团模型。由于高位点得分和D得分，结合位点包括残基HIS 296、GLU 299、LYC 300、TYR 337、LYS 340、THR 341、LYN 342、ASN 343、ASP345、GLU 389、ASN 418、LEU 419、ILE 420、MET 424、ASP435 、 CYS 437 、 GLN 438 、 SER 441 、 SER 460 、 TRP461 、 GLY462、SER463、GLY464、CYC465、VAL473。催化残基HIS 296、ASP 345和SER 441也位于tmprss 2模型的末端丝氨酸结构域中3.3. E-药效团模型及基于药效团的数据库筛选根据所选活性位点的氨基酸残基，提出了一个由一个供体（D）、一个疏水区（H）和五个芳香环（R）组成的3.4. 生成的化合物与MM-GBSA在计算化学中，对接现在已经成为一种常用的方法，用于估计分子对其目标的亲和力。从相筛选中获得的31059个化合物被缩小到只有10个对接得分为9.68的顶级分子，8.017 kcal/mol，通过Glide HTVS、SP和XP的连续对接，以确定其与TMPRSS 2的结合相互作用和亲和力，与参比品萘莫司他和ambroX ol的对接评分5.42和6.46 kcal/mol相比，如表2所示。此外，对前10种化合物进行了MMGBSA结合自由能计算研究。它们的结合能优于参比化合物，范围为63.55 - 89 - 75 kcal/mol。选择前3个分子的相互作用用于进一步分析（图5）。Z126202570分子与TMPRSS 2的活性口袋形成四个氢键、一个π-阳离子相互作用、一个π-π相互作用和疏水相互作用。参与氢键形成的氨基酸是GLU 299、GLY464、ASP 435和PO 4501。在分子与HIS 296残基之间观察到一种π-阳离子相互作用，并且在分子与TRP 461之间观察到一种π-π相互作用。与CYS437、CYC465、TRP461、TYR337、VAL473、ILE420、LEU419、MET 424和TYR33残基形成疏水相互作用。TMPRSS 2和Z46489368的活性口袋氨基酸之间的结合亲和力通过两个氢键、一个π-π相互作用和疏水相互作用来维持。SER 460和PO 4501形成氢键，与TRP 461形成单π-π相互作用，与CYS 437，CYC 465，A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007585表2最好的十种化合物与TMPRSS 2的对接得分、MM-GBSA结果、相互作用和适合度得分名称对接评分MM -GBSAdG结合适合度π-π相互作用π-阳离子相互作用氢键相互作用疏水相互作用萘莫司他-5.424-59.76ASP435、PO4501CYS437、TRP461、VAL473、CYS465、ALA466、PRO301AmbroXol-6.464-55.48Z126202570-9.68-89.75 0.643 TRP461 HIS296 SER460，PO4501，SER441CYS437、CYC465、TRP461、TYR337、VAL473、ILE420、LEU419、MET 424、TYR33Z46489368-8.996-77.83 1.039 TRP461LEU419，MET 424。Z422255982-8.781-74.48 0.947 TRP 461 HIS 296 SER 460，LYS300，PO 4501CYS437、CYC465、TRP461、TYR337。Z168796704-8.548-73.53 0.648 TRP 461 HIS 296 PO 4501。CYS437、CYC465、TRP461、TYR337。Z94732345-8.489-63.55 1.298 TRP461PO 4501CYS437、CYC465、TRP461、LEU419、MET 424。Z67551341-8.287-83.75 1.165 TRP461 HIS296 SER460，SER436 CYS437，CYC465，TRP461Z166819168-8.054-82.49 1.297 TRP 461 HIS 296 SER 436，LYS300，GLY464CYS437、CYC465、LEU419、MET 424、ILE420、PRO301Z1462300333-8.043-80.25 1.083 TRP461ILE 420、LEU 419、MET 424Z109718002-8.024-74.95 1.146 TRP461ILE 420、LEU 419、MET 424Z168797262-8.017-52.13 1.527 TRP461 TRP461LEU419、MET 424图五. 最好的三种化合物与TMPRSS 2的二维和三维相互作用。TRP461、VAL473、ILE420、LEU419和MET 424残基。TMPRSS 2活性口袋与Z422255982之间形成了许多相互作用。在这些相互作用中，三个氢键与SER 460、LYS 300和PO 4501残基，一个是与TRP 461的π-π相互作用，一个是与HIS 296残基的π-阳离子相互作用，其余是与CYS437、CYC 465、TRP 461和TYR 337残基的疏水相互作用。3.5. 分子动力学对接方法通常快速且不精确，但它们缺乏蛋白质灵活性，这可能损害所得配体-蛋白质复合物的精确度。因此，更精确的分子动力学建模方法可以提供更好的对接补充。在这里，我们检查了各种分子模拟结果，包括RMSD，A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007586≤表3三种化合物的RMSD和RMSF值的平均值名称RMSD（）RMSF（）Cα配体TMPRSS 2及其抑制剂的RMSF和RMSD（2.35 μ g）平均值表明我们预测的模型和这些有希望的抑制剂的亲和力有多可靠。如在图8A中可以看出，Z126202570与GLY391（23%）、GLU299（7%）、GLN 438（5%）、GLU 389（5%）、CYS297（3%）通过以下相互作用：邮编：Z126202570Z46489368Z422255982RMSF和PLC。2.35±0.252.35±0.252.35±0.242.32±0.421.60±0.451.91±0.421.04±0.661.04±0.671.04±0.661.18±0.481.29±0.450.83±0.50在整个刺激过程中，氢键的接触时间更短。GLU 389（20%）、LYS300（15%）、CYS297（15%）、HIS 296（10%）、GLY391（10%）也可形成水桥。疏水性-与VAL 280（15%）、LYS340（10%）和VAL 298（5%）形成相互作用最后，GLU 299和GLU 399主要与3 H，4 H-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮部分的N14形成两种离子相互作用。Z46489368 与 SER 460 （ 40% ） 、 SER 441 （ 20% ） 、 GLY 462（20%）和GLU 389（5%）形成H键，在整个刺激时间期间具有更多的接触时间（图8B）。HIS296（30%）、MET 424（15%）、SER 436（15%）、GLN 438（10%）(25%）和ASP 440（10%）。最后，与TRP461形成疏水相互作用（70%）。而在Z422255982-TMPRSS 2复合物中（图8C），仅形成两种类型的相互作用。GLU 299在80% 的刺激时间内保 持强氢键相互作用。HIS296、CYS297和LYS340显示弱的水桥相互作用3.6. 密度泛函理论的 分子 轨道 提供 细节 对 电 和光学RMSD代表了模拟过程中TMPRSS-抑制剂复合物的动态稳定性和Cα骨架的构象变化。TMPRSS 2蛋白和TMPRSS 2-抑制剂复合物的平均RMSD值示于表3和图2中。 六、TMPRSS 2及其抑制剂的Cα骨架RMSD组织模式配合物没有显示出显著的变化，表明它们的稳定性。使用RMSF来评估配体和蛋白质的柔性。在整个模拟过程中，Cα原子的坐标都在波动从它们的典型位置，例如，Z126202570为0.66 - 1.04 μ m。TMPRSS2蛋白和配体的平均RMSF值示于表3和图2中。7.第一次会议。下特性，以及量子化学，并用于理解不同类型的共轭系统过程。化合物的反应性还与分子轨道能量和轨道能量有关。根据分子轨道理论。B3LYP/6-311**基组用于计算MO的图形表示和前三种化合物的溶剂化能，如表4和图4所示。9.第九条。Z126202570的HOMO轨道位于与SER 460相互作用的N8、与SER441相互作用的芳香环和O 1以及与PO 4501相互作用的O 10上。3H，4 H-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基见图6。PL-RMSD。A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007587-见图7。 蛋白质和配体RMSF。表4见图8。 三种化合物与TMPRSS 2的相互作用图。用LYS300和N10与PO4501相互作用。参比化合物和三个最佳化合物的量子化学性质分布在咪唑并[1，2-a]吡啶-1-鎓上，其中N33与HIS 296和TRP 461相互作用。药物HOMO kcal/ molLUMO千卡/摩尔HLG kcal/mol溶剂化能kcal/mol分子静电势（MEP）是理解静电分配势和可视化反应过程的重要手段。浙ICP备120202570号-0.075-0.141-55.86浙ICP备05000000号-1浙ICP备05000000号-1一个部分和与GLU 299和HIS 296相互作用的哌啶部分的N14上。在Z46489368的情况下，HOMO轨道分布在与TRP 461相互作用的1，4-二甲苯部分、2，5-二甲基吡啶部分和连接这两个部分的LUMO轨道位于2，5-二甲基吡啶部分。而在Z422255982中，HOMO轨道呈现在O2上，O2与O2相互作用，在涉及亲电和亲核相互作用的化学反应中的活性位点。ESP表面图为了解活性部位提供了一种重要的可视化方法顶部的MEP地图在B3 LYP/6-311** 水平上计算了三个化合物潜在的亲核和亲电相互作用的网站，并表示在图。 10个。Z126202570的MEP图谱范围为1.087 - 155.8 kcal/mol。最高阴性（红色）区域分布在与PO 4501相互作用的3 H，4 H-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮部分的O31和丙-2-酮部分的O 10上。而最高阳性（紫色）A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）1007588--图9.第九条。用TM PRSS2 对三种 化合物进行了HOMO和LUMO表征。见图10。 三种化合物的MESP图与TMPRSS 2。区域位于与GLU 299和HIS 296相互作用的哌啶部分的N14上。Z46489368的MEP图谱范围为53.9 - 64.8 kcal/mol。红色区域分布在与TRP 461相互作用的2，5-二甲基吡啶部分和N-（2-甲基丙-2-烯-1-基）乙酰胺部分的O20上。而紫色区域呈现在乙基（甲基）胺部分。Z422255982的MEP图范围为4.5至125.4。红色区域位于与LYS300相互作用的酚盐部分的O2上而紫色区域在与HIS 296和TRP 461相互作用的咪唑并[1，2-a]吡啶-1-鎓部分的N33上发现。A.A. Alzain和F.A. 埃尔巴德维医学信息学解锁26（2021）10075894. 结论TMPRSS 2蛋白由于其蛋白水解活性而成为SARS-CoV-2病毒复制的重要靶标。在目前的研究中，已经建立了一个很好的TMPRSS 2同源模型。开发了E-药效团模型，并针对来自烯胺数据库的一百万个化合物进行筛选，随后进行分子对接和MM-GBSA结合能计算以验证其与靶标的亲和力。的 前三个分子（Z126202570、Z46489368和Z422255982）也进行了分子动力学模拟，以证实从对接分析以及密度泛函理论计算获得的相互作用的稳定性。这些结果表明，这些化合物可能是针对TMPRSS 2的潜在命中物，并且如果实验证实，则可以用作未来的抗新冠病毒剂。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认我们感谢薛定谔的Katia Dekimeche女士的支持和帮助。引用[1] Morens DM，Fauci AS.新出现的大流行性疾病：我们如何获得COVID-19。Cell2020;182：1077-92. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.021网站。[2] 王伟，徐勇，高荣，卢荣，韩克，吴刚，谭伟。SARS冠状病毒2型的检测不同类型的临床标本。JAMA，美国医学会杂志2020;323：1843-4。https://doi.org/10.1001/jama.2020.3786。[3] COVID-19地图-约翰霍普金斯冠状病毒资源中心，（n. d.）。https：//coronavirus.jhu.edu/map.html。[2021年8月7日]。存取。[4] Mckee DL，Sternberg A，Stange U，Laufer S，Naujokat C.针对SARS-CoV-2和COVID-19的候选药物。药理学研究2020;157：104859。10.1016/j.phrs.2020.104859https://doi.org/上发布。[5] Su S，Wong G，Shi W，LiuJ， Lai ACK，ZhouJ， Liu W，Bi Y，Gao GF.冠状病毒的流行病学、基因重组和发病机制。2016年微生物学趋势24：490-502。https://doi.org/10.1016/j.tim.2016.03.003网站。[6] Zhu N，Zhang D，Wang W，Li X，Yang B，SongJ， Zhao X，Huang B，ShiW，Lu R，Niu P，Zhan F，Ma X，Wang D，Xu W，Wu G，Gao GF，Tan W.新型冠状病毒2019年，中国的肺炎患者 新英格兰医学杂志2020;382：727-33。https://doi.org/10.1056/nejmoa2001017网站。[7] Zaki AM，van Boheemen S，Bestebroer TM，Osterhaus ADME，FouchierRAM.从沙特一名肺炎男子体内分离出新型冠状病毒。新英格兰医学杂志2012;367：1814-20。https://doi.org/10.1056/nejmoa1211721网站。[8] 盛文宏2019冠状病毒病（COVID-19）。 J Intern Med Taiwan 2020;31：61-6.https：//doi.org/10.6314/JIMT.202004_31（2）.01.[9] Tortorici MA，Veesler D.冠状病毒进入的结构洞察第一ED爱思唯尔公司2019.https://doi.org/10.1016/bs.aivir.2019.08.002网站。[10] 李春，杨英，任丽. 2019新型冠状病毒和来自其他物种的冠状病毒的遗传进化分析。感染遗传进化2020;82：1-3. https://doi.org//j.meegid.2020.104285。[11] De Wit E，Van Doremalen N，Falzarano D，Munster VJ. 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