病毒miRNA在宿主细胞存活中的作用

医学信息学解锁22（2021）100501病毒miRNAs通过靶向凋亡相关宿主基因赋予宿主细胞存活Md Sajedul Islama，b，Abul Bashar Mir Md Khademul Islama，*a孟加拉国达卡达卡大学遗传工程生物技术系b目前所属单位：孟加拉国巴里沙尔巴里沙尔大学生物化学和生物技术A R T I C L EI N FO保留字：miRNA病毒发病机制功能性富集免疫系统A B S T R A C TmiRNA是通过RNA沉默调节基因表达的小的非编码RNA。与真核生物一样，一些病毒也产生miRNA。虽然已经研究了宿主miRNA在预防病毒发病机制中的贡献，但对病毒miRNA如何赋予宿主内的存活知之甚少。在这里，我们假设病毒miRNAs通过与宿主靶基因结合来下调威胁细胞存活的特定途径，从而赋予致病性。为了鉴定这些途径，我们使用来自13种不同病毒的168种病毒miRNA的靶标进行了功能富集分析。我们通过miRNA介导的基因沉默鉴定了病毒靶向的特异性免疫系统和宿主防御途径。对公开可用的RNA-seq数据的分析和整合揭示，病毒通过经由miRNA诱导的机制关闭促凋亡基因来靶向宿主中的凋亡，从而确保细胞存活。总之，我们的研究结果揭示了病毒miRNA在下调宿主细胞凋亡机制中的重要功能。1. 介绍miRNA是存在于脊椎动物、植物、无脊椎动物以及多种病毒中的~22个核苷酸的小的非编码RNA [1]。miRNAs的主要功能是通过与特定信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-UTR）形成碱基对，在转录后调节基因的表达。病毒miRNA通过宿主免疫系统逃避[2]、建立病毒复制的微环境[3]、调节先天免疫系统、分化适应性免疫细胞[4]等，在病毒颗粒的存活和增殖中发挥着微妙的作用。像大多数动物和植物一样，一些病毒（主要是DNA病毒）也可以产生miRNA，这些miRNA赋予它们生存所需的不同选择性优势，包括宿主免疫系统逃避，宿主和病毒基因的调节[5]，病毒复制[6]，影响病毒潜伏期[4]和减少宿主抗病毒反应[5]。病毒miRNA最初在EB病毒（EBV）中发现[7]，随后在其他病毒家族如疱疹病毒、多瘤病毒、囊病毒、虹彩病毒、杆状病毒、腺病毒、逆转录病毒中发现[8，9]。目前，预计有20多种人类病毒产生 miRNAs，其中 这 约10-12 已经过确认实验性的人类病毒产生约135种miRNA [10]，这被认为有利于病毒在人体内的存活。这些病毒产生的miRNAs可以控制相应的病毒基因和一些人类基因的表达。已经分析了从这些病毒中发现的miRNA序列，并且在许多人类基因的3′-UTR区域发现了它们各自的靶位点[10]。已经假设miRNA通过促进逃避宿主防御机制而为病毒提供一些选择性优势。由于病毒需要在宿主细胞内复制，它们可以通过细胞凋亡或免疫机制启动机制来防止宿主细胞死亡。因此，我们假设病毒miR-NA通过下调凋亡相关基因来抑制凋亡，从而通过维持宿主细胞来延长病毒的存活。2. 材料和方法2.1. 病毒miRNAs及其靶基因的鉴定为了了解病毒miRNA在为病毒提供选择优势方面的功能，我们首先鉴定了产生miRNA的人类病毒。我们探索了miRbase [11]以提取FASTA序列* 通讯作者。达卡大学遗传工程和生物技术系，达卡，1000，孟加拉国。电子邮件地址：khademul@du.ac.bd（A.B.M.M.K.伊斯兰教）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100501接收日期：2020年8月25日;接收日期：2020年12月10日;接受日期：2020年12月11日2020年12月15日网上发售2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuM.S.伊斯兰教与A.B.M.M.K. 伊斯兰教医学信息学解锁22（2021）1005012-成熟的病毒miRNAs用于进一步的分析。我们选择了三种不同的目标识别工具。TargetScan通过搜索mRNA中保守区域的存在来预测miRNA序列的靶标，其中基因使用靶位点的累积加权得分进行排名[12]。RNAhybrid是一种软件，可以找到短RNA和长RNA的最小自由能杂交[13]，从而有效地识别靶mRNA。PITA测量预测推定的miRNA靶标的位点可及性[14]。使用TargetScan、RNAhy-brid和PITA，我们扫描了人类蛋白质编码基因的3′-UTR区域以寻找推定的miRNA靶标，并从UTRdb[15]和miRTarBase [16]数据库中直接获得了病毒miRNA的推定和实验验证的靶标。我们将从这些数据库中获得的靶基因与通过扫描UTR鉴定的靶基因相结合，以创建一组独特的病毒miRNA靶基因。2.2. 功能富集分析我们根据基因本体论联盟（GO）的生物过程（GOBP）、细胞位置（GOCL）和分子功能（GOMF）对基因进行了注释[17，18]。所涉及的途径来自京都基因和基因组百科全书（KEGG）[19]。在所有情况下，使用Ensembl基因（版本79：2015年3月）[20]。我们使用Gitools [21]（版本：1.8.4）进行富集分析，并生成目标GOBP、GOCL、GOMF和KEGG的相应p值和热图。Gitools是一个帮助分析和可视化基因组数据的框架。它以可浏览的热图格式表示数据，其中计算生物途径中存在特定基因的概率（例如此处使用的右P值）。2.3. 基因表达微阵列数据分析基因表达综合库（GEO）[22]是一个有策划的公共库，在国家生物信息中心（NCBI）的微阵列基因表达数据。RNA-seq数据集GSE 44769在平台Illumina基因组分析仪II X（GPL10999）包含EB病毒（EBV）细胞系在不同条件下的数据。将“无BART，EtOH“样品作为该数据集的对照，将“BART， 做X“是 作为中共 最适当 sample. 然后我们使用内部R脚本将绝对表达式转换为Log2表达式值。然后我们分析了实验条件和对照之间基因的差异表达。我们从KEGG数据库“细胞凋亡途径“术语中提取我们选择凋亡基因其被下调两倍或更多以用于进一步分析，并鉴定靶向它们的病毒miRNA。我们研究了这些显著下调的基因的功能，以更好地理解通过miRNA下调这些靶点为病毒提供的选择性优势。3. 结果3.1. 从13种人类病毒中，从各种数据库我们从miRbase和各种出版物中获得了人病毒的miRNA [4，5，7，10，23在这些病毒中，我们选择了13种其推定的miRNA已经发表的病毒（补充文件1）。这导致来自13种病毒的总共168种miRNAs。然后，我们使用miRBase获得了所有病毒miRNAs的序列，并进行了鉴定。使用RNAhybrid [13]和miRTarBase [16]数据库以及在线软件PITA [14]和TargetScan [12]对人类靶基因进行了验证。我们结合从这些数据库和工具中获得的靶基因，以潜在的综合方式生成一组靶基因这导致了近22，000个独特的基因被病毒miR-NA靶向。其中，EBV靶向约16，000个基因，HIV、HBV、HSV1、HSV2、KSHV和HCMV靶向约15，000个基因，BKV、JCV和MCV靶向约7000个基因。3.2. 功能富集分析鉴定病毒miRNA我们进行了富集分析，以确定病毒靶向的宿主细胞中的特定生物过程和途径。显著性的截止值设定为FDR校正的P值0.05（图1）。然后，我们研究了以前发表的实验证据，以指导进一步的分析。所选择的途径是：钙介导的信号传导、MAPK级联、Wnt信号传导途径和细胞凋亡（图2）。3.3. 细胞凋亡富集分析提供了84个病毒miRNAs富集分析表明，细胞凋亡是一个富集的生物学过程.在KEGG数据库术语“细胞凋亡途径”中观察到84个富集基因（校正p值<0.05），其被病毒miRNA靶向。富集型糖尿病相关基因检索并以颜色编码的热图表示（图1）。 3）。3.4. EB病毒细胞系的微阵列分析提供了与凋亡分析芯片数据（GSE 44769），我们发现75个凋亡基因的表达水平与对照组相比有差异。在这75个基因中，24个基因表达上调，其余51个基因表达下调。由于我们假设病毒miRNA会下调凋亡过程，因此我们选择了下调至少两倍的基因。当与对照组比较时，我们观察到49个这样的基因（图4）。将EBV miRNAs与其相应的靶基因杂交，揭示了靶向凋亡基因的几种miRNAs （补充文件2）（图2）。 5）。3.5. miRNA靶向的凋亡基因提供了对沉默宿主基因在病毒感染后最显著下调的基因（底部20%的所有表达基因，或Log2比率2.74）包括由EBV病毒miRNA靶向的20个凋亡基因（补充文件2）。<使用蛋白质数据库UniProt [28，29]来确定通过miRNA抑制的适合性益处（表1）。4. 讨论在分子生物学和细胞生物学领域，miRNAs引起了人们的广泛研究兴趣。最近的工作揭示了miRNAs在调节基因表达中的重要作用，因为它涉及各种细胞过程。脊椎动物、无脊椎动物[1]、植物[1]、病毒等产生miRNA来调节其基因的表达，从而控制其生理功能。目前已知的miRNA基因有9000多个，其中约700个是人的[30]。这些miRNA发挥各种作用，以确保生物体的适当稳态条件。一个这样的作用包括宿主-病原体关系。先前的实验工作已经确定，人miRNA靶向病毒基因[31，32]并作为抗病毒介质发挥作用以抑制病毒发病机制。通过沉默病毒的致病基因，人类miRNA确保预防病毒引起的任何有害事件。另一方面，越来越多的证据表明，一些病毒miRNAs也可以有效地靶向和调节宿主基因。为了逃避宿主的防御分子，病毒可能进一步进化为产生miRNAs来沉默宿主基因。沉默可以提供病毒M.S.伊斯兰教与A.B.M.M.K. 伊斯兰教医学信息学解锁22（2021）1005013Fig. 1.基因本体生物过程的丰富：（选定的）基因本体生物过程（GOBP）的表示丰富了从Gitools获得的与免疫系统相关的术语。统计学显著性（错误发现率，FDR校正的p值）以颜色编码量表表示。颜色朝向红色表示更重要，颜色朝向黄色表示更少学显著性和 灰色，表示无显著性（>0.05）。 (For中间，关于本图图例中对颜色的引用，请读者参阅本文的Web版本。）图二.途径的富集分析：（A）MAPK级联、（B）Wnt信号传导途径、（C）钙介导的信号传导、（D）从Gitools获得的细胞凋亡的生物过程的过度表达。色标和图例如图1所示。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版具有多种选择性优势，包括宿主防御逃避、病毒复制[5]和抗病毒应答减弱。病毒是否有效地靶向和控制宿主基因以促进其自身的生存是一个引人注目的问题，来自不同实验室的几项科学工作正在寻求解决。在进行富集分析后，我们观察到各种生理过程以高水平富集。我们发现病毒靶向免疫系统相关通路，Wnt通路，MAP激酶级联、凋亡等。我们预测，关闭这些通路可能会为它们在人类宿主中的生存提供Carl等人[10]研究了几种病毒和相关的miRNAs 假设病毒miRNAs通过调节宿主基因表达靶向宿主通路。他们从不同的数据库中寻找预测的miRNAs来寻找靶基因。他们已经获得了富集的GO生物过程，并预测了目标途径M.S.伊斯兰教与A.B.M.M.K. 伊斯兰教医学信息学解锁22（2021）1005014图三.病毒miRNA靶向的富集凋亡基因：从Gitools获得的与凋亡过程相关的富集基因。蓝色的命中表达病毒miRNA靶向的基因，灰色的命中是病毒miRNA不靶向的基因。垂直线表达病毒miRNA，水平线表达相应的靶基因。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）见图4。下调基因的表达水平：下调基因基于其表达水平以颜色编码标度表示。考虑下调至少两倍（Log 2比率<-0.5）的基因。下调的显著性水平取为Log 2比率的-1.5，表示为白色。Log 2比率小于-1.5的基因表示为绿色，值大于-1.5的基因表示为蓝色颜色. （有关此图例中颜色的解释，请读者参考本文的Web版本但缺乏与实验证据的联系。我们确定了病毒miRNA靶向的途径及其相应基因，并进一步验证了Vereide及其共同作者实验中Epstein-Barr病毒感染细胞中的错误调节[33]。我们的研究结果提供了证据表明，病毒miRNA靶向特定的人类基因和控制途径，如与病毒适应性相关的细胞凋亡细胞凋亡是一种自然的生理现象，当细胞达到成熟期或受到感染时，细胞发生程序性死亡。任何病原体[34 这一过程对于保持健康非常重要。一种有机体的动态平衡细胞凋亡可防止各种有害作用，如病毒发病机制和癌症的进展。由于我们已经发现病毒miRNAs靶向宿主基因以维持自身的生存，M.S.伊斯兰教与A.B.M.M.K. 伊斯兰教医学信息学解锁22（2021）1005015表-1从UniProt获得的最显著下调基因的功能序列基因符号编码蛋白质功能1BADBcl 2相关激动剂细胞死亡2AKT 3RAC-γ丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶促进细胞死亡。具有半胱氨酸型内肽酶激活剂活性，参与细胞凋亡过程。调节新陈代谢、细胞增殖、细胞存活、生长和血管生成。3IL 1A白细胞介素-1 α参与炎症反应反应能刺激滑膜细胞释放前列腺素和胶原酶。4RELA转录因子p65，RELA蛋白5AIFM1凋亡诱导因子1、线粒体参与NF-κ B异源二聚体的形成、核转位和活化。作为一种NADH氧化还原酶起作用并调节细胞凋亡。当从线粒体释放到细胞质和细胞核中时，在半胱天冬酶独立途径中作为促凋亡因子。6CAPN 1Calpain-1催化亚基催化有限的蛋白水解参与细胞骨架重塑和信号转导的底物。7PRKACAcAMP依赖蛋白激酶催化亚基α8PRKAR1BcAMP依赖性蛋白激酶I型β调节亚单位9PPP 3CC丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2B催化亚基γ亚型10TRADD肿瘤坏死因子1型受体相关DEATH结构域蛋白蛋白激酶A的亚基，调节葡萄糖代谢、细胞分裂等。PKA使其他蛋白质磷酸化，从而改变它们的活性。参与细胞内cAMP信号传导的cAMP依赖性蛋白激酶的调节亚基。钙依赖性、钙调素刺激的蛋白磷酸酶，在钙调神经磷酸酶中的钙调素激活中起作用。通过阻止泛素化作为肿瘤抑制因子过度凋亡和NFκ B活化。图五. 下调基因的表达强度：下调基因的表达强度：11Caspase-9参与细胞凋亡。基于它们的表达水平，用不同的颜色来表示标记的基因。考虑下调至少两倍（Log 2比率<-0.5）的基因。下调的显著性水平取为-1.5Log2比率，以白色表示。Log 2比率小于-1.5的基因表示为绿色，值大于-1.5的基因表示为绿色。-1.5表示为蓝色。（有关此图例中颜色的解释，请读者参考本文的Web版本预测病毒可能特异性地靶向和调节宿主细胞凋亡过程，以确保它们在宿主中的避难和延长存活细胞事实上，我们发现凋亡基因是病毒miRNA的主要靶基因之一，12BIDBH 3-相互作用结构域死亡激动剂13IL 1B白细胞介素-1 β14AKT 1RAC-α丝氨酸/诱导细胞凋亡。它是一种主要的蛋白水解产物，释放细胞色素c。它是一种促炎细胞因子，其诱导前列腺素合成、嗜中性粒细胞感染和活化、T细胞活化和细胞因子产生、B细胞活化和抗体产生以及成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生。在病毒感染的细胞中下调最明显。这些发现加强了病毒选择性靶向宿主细胞凋亡途径以维持自身生存的假设。有些病毒会对人类造成各种有害影响。EBV（也称为人类疱疹病毒-4（HHV-4））是一种名为传染性单核细胞增多症的常见疾病的病原体，可导致几种类型的癌症，包括霍奇金有证据表明EBV与自身免疫性疾病有关，它通过苏氨酸蛋白激酶磷酸化调节细胞存活，MAP3K5（凋亡信号相关激酶）。在NFκ B依赖性基因转录的调节中起重要作用，并正调节CREB 1（cAMP-反应元件结合）的活性（接下页）M.S.伊斯兰教与A.B.M.M.K. 伊斯兰教医学信息学解锁22（2021）1005016表-1（续）序列基因符号编码蛋白质功能蛋白质）。CREB 1的磷酸化诱导辅助蛋白的结合，所述辅助蛋白是促存活基因如BCL 2的转录所必需的，MCL1.通过miRNA表达。miRNAs是分子生物学、基因工程等领域的重要分子，作为基因和基因产物的调控因子，正受到越来越多的关注。我们研究中发现的病毒miRNAs和宿主靶点需要进一步的实验验证。我们预测，了解不多的病原体可以通过增加对miRNA-基因相互作用的了解来对抗。在这里，我们展示了miRNA通过抑制细胞凋亡在人类宿主内建立病毒中的作用，这确保了它们的长期避难所。这一发现可以进一步加强使用适当的实验15PRKAR2BcAMP依赖性蛋白激酶II型β调节亚单位通过结合锚定蛋白介导膜结合，如MAP2激酶。模型，以了解更多关于宿主-病原体相互作用和打击新出现的病原体。16BCL 2L 1Bcl-2样蛋白1通过抑制细胞凋亡抑制半胱天冬酶。通过与电压依赖性阴离子通道（VDAC）结合并阻止caspase激活剂CYC1从线粒体膜释放来阻断VDAC，从而调节细胞死亡。在有丝分裂期间也作为G2检查点和向胞质分裂进展5. 数据和材料支持本文结论的数据集包含在文章和补充文件中资金这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的17PIK 3R 2磷脂酰肌醇3-ki-核酸酶调节亚基β18ENDOG核酸内切酶G，线粒体使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸化以产生PIP3（磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸）。PIP3在激活涉及细胞生长、存活、增殖、运动和形态的信号级联中起关键作用。在特定的位置切割DNA。还具有RNase和RNase H活性。可以在线粒体过程DNA复制。利益冲突所有作者都声明他们没有利益冲突确认我们感谢美国伊利诺伊大学芝加哥分校生物化学和分子遗传学系的Elizaveta V. Benevolenskaya博士和Alexandra Elaine Rader对手稿的批判性阅读和校对。19IKBKGNFK B必需调节剂病毒活化IRF3的参与TLR3和IFIH1介导的抗病毒作用附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。20凋亡调节因子BAX天生的反应通过结合和抑制BCL 2、激活CASP 3和从线粒体释放细胞色素c来加速细胞凋亡。org/10.1016/j.imu.2020.100501。引用[1] Ding S-W，Voinnet O.由小RNA指导的抗病毒免疫。Cell 2007;130（3）：413-26.好吧[37]。尽管在人类中引起显著的不良反应，但关于EBV在宿主体内的发病机制的信息很少。我们的研究表明，EBV的发病机制涉及通过EBV miRNA沉默宿主基因。我们发现了几个凋亡相关基因，这些基因受到EBV miRNAs的显著控制。类似地，Pfeffer等人[38]研究了疱疹病毒家族病毒的miRNA，他们采用计算方法预测pre-miRNA，然后通过实验获得这些病毒产生的miRNA。这两项研究的数据强调了miRNA介导的基因沉默促进病毒发病的事实。我们研究了病毒miRNAs的主要靶基因--凋亡相关基因的功能，发现它们大多数是促凋亡基因。当这些基因被病毒miRNA沉默时，这些基因表达的减少导致宿主细胞的持续存活，并为病毒颗粒提供延长的避难所。BAD、CASP9和BID等基因与诱导在人类细胞凋亡中，所有这些都是病毒miRNAs高度靶向的。通过观察这些基因在引入病毒miRNAs后的实验验证的表达水平，我们预测病毒选择性地靶向积极控制细胞凋亡和减少细胞凋亡的基因。[2] Stern-Ginossar N，Elefant N，Zimmermann A，Wolf DG，Saleh N，Biton M，etal. Hostimmune system gene targeting by a viral miRNA. Science2007;317（5836）：376-81.[3] 作者：J. 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