工程20（2023）49研究葡萄糖和脂质代谢-文章CPAL作为心肌细胞代谢改变和焦亡的新介质调节小鼠李嘉民a，c，d，#，薛鸿儒a，#，徐宁a，#，龚丽玲a，李明a，李思佳a，黄迪a，张庆伟a，李鹏宇a，李庆绥a，俞航a，刘怡宁a，b，薛亚东a，陈海欣a，刘佳丽a，张万玉a，刘明斌a，张思宇a，郎仙芝a，赵兴淼a，杜伟杰a，c，d，蔡本芝b，c，d，王宁a，c，d，杨宝丰a，c，d，刘a中国心血管药物研究重点实验室（中华人民共和国教育部&b黑龙江省高等学校药物研究重点实验室临床药学研究所，哈尔滨医科大学附属第二医院药学部，哈尔滨150081c中国医学科学院寒区慢性非传染性疾病研究所（2019RU070），哈尔滨150081d哈尔滨医科大学黑龙江省医学科学院北方转化医学研究合作中心，哈尔滨150081阿提奇莱因福奥文章历史记录：接收日期：2022年2022年7月21日修订2022年8月4日接受2022年10月14日网上发售关键词：心肌梗死CPALNFjB炎症A B S T R A C T心肌梗死（myocardial infarction，MI）是最严重的缺血性心脏病，伴有心肌代谢紊乱和心肌细胞丢失。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）参与了多种病理状态，如癌症和心血管疾病（CVD），并正在成为这些疾病的一种新的生物标志物。本研究旨在探讨lncRNA在心肌梗死后心肌重构中的调控作用及其机制。我们发现，梗死后心脏表现出三磷酸腺苷（ATP）的减少和糖和脂质代谢基因分化簇36（CD 36），己糖激酶1（HK 1）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的改变，伴随着心肌细胞焦亡。然后，我们确定了一个以前未知的保守的lncRNA，AK009126（心肌细胞pyroptosis相关lncRNA，CPAL），这是显着上调心肌梗死小鼠的心肌边缘区。重要的是，腺相关病毒9（AAV 9）介导的内源性CPAL沉默通过其短发夹RNA（shRNA）部分abro-门控小鼠MI期间心肌代谢改变和心肌细胞焦亡从机制上讲，CPAL显示直接结合核因子κ B（NFj B），并作为NFj B的激活剂诱导心肌细胞中的NFjB磷酸化。我们还发现CPAL在转录水平上调caspase-1的表达，从而促进心肌细胞释放白细胞介素（IL）-18和IL-1b。总的来说，我们的研究结果揭示了保守的lncRNA CPAL作为一种新的调节心脏代谢异常和心肌细胞焦亡的心肌梗死设置，并建议CPAL作为一种新的治疗靶点，以保护心肌细胞免受梗死心脏的缺血性损伤©2022 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CC BY-NC-ND许可（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍心血管疾病（CVD）是一系列先天性或获得性心脏和血管疾病。目前，心血管疾病占诊所所有患者死亡的40%以上，是一种严重的疾病。*通讯作者。电 子 邮 件 地 址 ： wangning@ems.hrbmu.edu.cn （ N.Wang ） ，yangbf@ems.hrbmu. edu.cn（B. Yang）。#这些作者对这项工作做出了同样的这是全球人类死亡的主要原因，并在全球范围内引起经济负担和巨大的健康问题[1心肌梗死（MI）是最常见的CVD之一;它是由氧气和营养物供应减少引起的代谢灾难，其导致微环境稳态紊乱、大量细胞死亡、炎性细胞浸润、成纤维细胞活化等。MI的这些病理改变导致心脏收缩功能障碍、心脏重构、心肌纤维化，甚至心源性猝死[4]。长链非编码RNA（lncRNA）是一组长度超过200个核苷酸（nt）的非编码RNA[5];它们参与https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.08.0122095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engJ. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4950···×···在许多基本的病理生理过程和生物过程中，包括基因组印记、RNA选择性剪接和染色质修饰[6]。大量研究表明，lncRNA在各种心血管疾病（如肥大、心律失常和心脏纤维化）中存在差异表达谱敲除Triadin（Trdn）（一种心肌细胞特异性lncRNA）已显示会损害心脏钙处理系统并增加小鼠对心律失常的易感性[7]。此外，已经发现越来越多的lncRNA参与MI的病理过程[8例如，lncRNA锌指反义1（ZFAS 1）已显示可作为SR Ca 2 + ATP酶2a（SERCA 2a）抑制剂，并通过与MI小鼠中的SERCA 2a蛋白结合而导致收缩功能障碍[11]。 据报道，lncRNA Krüppel样因子3反义RNA 1（KLF 3-AS 1）在MI发生期间的心肌细胞焦亡过程中发挥潜在作用[12]。lncRNA在调节心肌细胞死亡和心肌重塑中的重要作用预示着其作为心肌梗死治疗新靶点的潜力。越来越多的证据表明，MI伴随着心脏能量代谢的改变和心肌细胞的大量特别地，能量和基底利用的损害（例如，葡萄糖和脂肪酸（FA））已被报道为MI背景下细胞死亡和心肌损伤的关键决定因素[13，14]。此外，持续上调非特异性炎症指标（例如，血浆和心肌中的高敏感性白细胞介素（IL）家族）与更差的结果相关。迄今为止，一些转录因子、细胞因子、酶和生长因子已被证明参与上述病理过程。核因子κ B（NFj B）是在许多病理生理过程中调节基因表达并操作细胞质复合物的核转位的关键转录因子[15]。据报道，喹唑啉-4，6-二胺（QNZ）通过葡萄糖转运蛋白4（GLUT 4）活化改善葡萄糖摄取，并通过抑制NF κ B活化抑制软骨细胞变性[16]。此外，本发明还提供了一种方法，NFj B作为上游信号影响心肌细胞心肌梗死发展过程中的焦亡[17]。证据表明，NFj B在MI期间调节血管内皮细胞和心肌细胞的功能中起关键作用[18，19]。本研究旨在探讨心肌细胞高温凋亡相关lncRNA（CPAL）在心肌细胞能量代谢紊乱和炎性心肌细胞死亡中的作用及其调控机制。在这里，我们首次报道了lncRNA CPAL在MI模型中上调，并诱导三磷酸腺苷（ATP）减少，糖和脂质代谢基因分化簇36（CD36），己糖激酶1（HK1）和GLUT 4的改变，以及心肌炎症，从而促进心肌细胞焦亡和心肌功能障碍。进一步发现NFj B与能量代谢和炎症反应有关心肌梗死时心肌细胞的突起NFj B被磷酸化，CPAL;磷酸化的NFj B（P-NFj B）然后从细胞质转运到细胞核中，在那里它促进半胱天冬酶原-1的转录和激活，并导致细胞凋亡。本研究提示CPAL可能是心肌梗死时心脏代谢功能障碍和心肌细胞凋亡的一个新的调节剂和治疗2. 材料和方法2.1. 动物雄性C57 BL/6小鼠，体重20哈尔滨医科大学（中国）.如前所述，将健康小鼠圈养在标准动物房条件下[20]。通过尾静脉注射将AAV 9-ZsGreen-shRNA-NC（AAV9-sh-NC）和AAV 9-ZsGreen-shRNA-CPAL（AAV 9-sh-CPAL）递送到小鼠中;然后，四周后，通过腹膜内注射用2，2，2-三溴乙醇（T48402; Sigma-Aldrich，USA）麻醉小鼠在第三和第四根肋骨之间打开胸腔，露出心脏。使用7-0尼龙缝线结扎左冠状动脉（LAD）周围;然后关闭胸部[21]。手术后24小时，收集心脏作进一步分析.雄性小鼠随机分为4组：假手术组、心肌梗死组、+AAV 9-sh-NC组和+AAV 9-sh-CPAL组。本研究经哈尔滨医科大学动物管理与使用委员会批准2.2. CPAL敲减病毒使 用 靶 序 列50-AAACATTAACGAATTAAGACC-30 和 与 ZsGreen（Hanbio，中国）缀合的CAG启动子构建携带用于沉默CPAL的shRNA的AAV 9载体。每只小鼠给予110 12vgm L-1（100μL）经尾静脉注射[22]。2.3. 超声心动使用2，2，2-三溴乙醇（T4802; Sigma-Aldrich）通过腹膜内注射麻醉小鼠。为了将体温维持在37 °C，将小鼠置于加温垫上。然后，如前所述，通过经胸超声心动图评价左心室功能[4]。2.4. 氯化三苯基四唑（TTC）染色将来自各组的小鼠心脏切除并在-80 °C下快速冷冻;然后将它们切成2mm厚 的切 片， 并在 37 °C 下 用磷 酸盐 溶液 中 的1%TTC（ Sigma-Aldrich，USA）染色20分钟。接下来，这些切片被排列并数码拍照。2.5. 细胞培养和用小干扰RNA（siRNA）从新生小鼠（1-3天龄）中分离心肌细胞。简而言之，用75%酒精清洗新生小鼠;然后，使用一对无菌镊子取出心脏。接下来，将心室肌切成小块。 离心所得细胞悬液，并将其重悬于含有100μgmL-1链霉素、100 U mL-1青霉素和10%胎牛血清的细胞培养基中。为了将成纤维细胞与心肌细胞分离，将悬浮液置于37 °C的培养瓶中1.5小时。未附着的细胞是心肌细胞;将这些细胞接种到细胞培养瓶中，并在37 °C下在含有5%二氧化碳（CO2）的潮湿空气中培养。48 h后，将贴附于培养板上的心肌细胞用于后续实验。[23].将细胞用/不用51 μgmL-1的SN 50（HY-P015; MCE，USA）和50 μg mL-1的乙酰基（Ac）-Tyr-1预处理。Val-Ala-Asp- 氯 甲 基 酮 （ Ac-YVAD-CMK ） （ 178603-78-6;Cayman，USA）孵育30 min，然后进行脂多糖（LPS）刺激（50lmol L-1，12 h）。CPAL特异性siRNA（si-CPAL）和乱序阴性对照RNA（si-NC）由GenePharma 商 业 合 成 。 CPAL 的 序 列 如 下 ： 正 义 50-GGUCUUAAUUCGUUAAUGUTT-30和反义50-AAGUUAAC-0. 将CPAL特异性siRNA包被，J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4951·如前所述[24]，用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）试剂转染到心肌细胞中，终浓度为100 nmol L-1。转染后48 h，细胞可用于后续实验。2.6. 苏木精-伊红（HE）染色将各组小鼠的心脏解剖并浸没，用4%多聚甲醛固定24小时，包埋在石蜡中，然后使用组织处理设备切成5μm厚的切片。这些切片用二甲苯脱蜡，然后用浓度递减的乙醇水化。然后根据制造商的方案用HE染色试剂盒（G1120; Solar-bio2.7. 透射电子显微镜将已经用0.25%胰蛋白酶在37 °C消化1分钟的心肌细胞和每组的心脏组织固定在2.5%戊二醛，1%OsO4后固定2h，用1%乙酸双氧铀封闭，然后用浓度递减的乙醇水合并包埋在环氧树脂中。电子染色后，在电子显微镜（JEM-1200; JEOL Ltd.，日本东京2.8. dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定如前所述，使用TUNEL检测试剂盒（Roche，Germany），根据制造商的方案，使用TUNEL染色来确定心肌细胞的DNA片段化2.9. Western blot总 蛋白 提取 基 于二 喹啉 甲酸 （ BCA ） 蛋白 试 剂盒 （ P0012;Beyotime，中国）[26]。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE; 10%-13%）分离蛋白质样品，转移到硝化纤维素膜上，并在含有5%牛奶的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭。然后将膜与抗核苷酸结合寡聚化片段样受体家族3（NLRP 3）（A12694; Abclonal，USA）、Gasdermin D/Gasdermin D N-末端（GSDMD/GSDMD-N）（ab209845; Abcam ， UK ） 、 IL-18 （ A1115; Abclonal ） 、 IL-1b（A16288;Abclonal）、胱天蛋白酶-1（ab 207802; Abcam）、磷酸化核因子κ B（ P-NFj B P65 ） （ Ser 536; #3033; CST ， USA ） 、 NFj B P65（#8242T; CST）、CD 36（74002 S; CST）、GLUT 4（AF 5386;Affinity Bio.sciences，USA）和HK 1（19662-1-AP; Proteintech，USA）在4°C下过夜。用含吐温-20的PBS（PBST）洗涤后，将膜与荧光缀合的抗兔IgG二抗在室温下孵育1小时（LI-COR，USA）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（中山金桥生物科技有限公司，有限公司、中国）用作内部控制。使用Odyssey红外成像系统（LI-COR）扫描和分析膜2.10. 酶联免疫吸附试验根据制造商的说明书，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清中IL-18（Elabscience，中国）、IL-1b（Elabscience）和ATP（MB-6783 A; Enzyme Mark Biological，中国）的水平2.11. 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）为了进行qRT-PCR测试，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从心肌组织和心肌细胞中提取RNA，如先前所述[27]。根据说明书，互补DNA（cDNA）合成反应混合物含有1 μg模板RNA和来自高容量cDNA逆转录试剂盒的试剂。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Toyobo Co.，有限公司、日本）。 用2-DDCt方法计算转录物的相对倍数变化，将其标准化为内源性GAPDH水平。引物（小鼠）序列由Invitrogen合成，见附录A表S12.12. 免疫组织化学分析根据标准程序将心脏组织固定、脱水、包埋和切片。接下来，将这些切片脱蜡、再水化并用过氧化氢封闭，然后与NLRP 3（BA 3677;BOSTER，中国）、胱天蛋白酶-1（ab 207802; Abcam）和P-NF κB（AF 2006; Affinity Biosciences，美国）抗体在4 °C下孵育过夜。用PBST 洗 涤 三 次 后 ， 将 第 二 抗 体 （ Zhongshanjinqiao BiologicalTechnology Co.，（香港）用于孵育切片。3，3-N-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（中山金桥生物技术有限公司，（香港）显色剂用于孵育切片，并且Mayer苏木精最终用于复染切片以染色细胞核。然后将切片在显微镜下拍照。ImageJ用于确定染色区域的大小[28]。2.13. 免疫荧光免疫荧光染色检测NLRP 3、caspase-1和P-NFj B在心肌细胞中的表达和定位。用于荧光染色的方法基于先前的描述[20]。使用以下一抗：NLRP3（BA3677;Boster）、胱天蛋白酶-1（ab207802;Abcam）和P-NFκB（AF2006;AffinityBiosciences）。2.14. 荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH）检测CPAL在心肌细胞中的表达和定位简言之，在细胞培养至60%-80%汇合后用PBS洗涤和固定后，将心肌细胞与Cy 3-缀合的CPAL探针以及18 S和U6探针在杂交缓冲液中孵育在用盐水柠檬酸钠（SSC）和PBS洗涤后，用4 '，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核。在共聚焦显微镜（Axio Scope A1，ZEISS，Germany）下分析免疫荧光。2.15. 染色质免疫沉淀（ChIP）测定根据说明书用芯片试剂盒（Invitrogen）进行实验。总之，用NFjBP65抗体和IgG抗体免疫沉淀的DNA，用聚合酶链反应（PCR）技术 检 测 。 Caspase-1-1 引 物 （ 正 向 引 物 ）50-AAAGAAGCCAAGAGCCAGGT-30和反 向 50-AGTGGACCAAGGAATGGTTG-30 ）侧翼的NFjB结合位点（和反向50-GGACCAGAA-J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4952GCAGAGGTGTG-30）侧接NFκ B结合位点（–15442.16. RNA相互作用蛋白免疫沉淀根据说明书[11]，使用MagnaRIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（17-701; Millipore，Germany）进行RIP测定。简言之，收获心脏组织并用RIP裂解缓冲液裂解。然后，将提取的总RNA与NFj B P65（622604; Biolegend，USA）抗体或对照抗体（IgG）混合并沉淀。接着，通过蛋白酶K处理纯化沉淀的RNA。最后，通过qRT-PCR检测RNA。2.17. 乳酸脱氢酶（LDH）释放试验根据制造商的说明书，使用LDH测定试剂盒（A020-2，NanjingJiancheng Biological，China）评估细胞中的LDH释放2.18. 统计分析使用Graphpad Prism 5.0软件（GraphPad Software，Inc.，美国 ） 。 使 用 t 检 验 进 行 两 组 之 间 的 比 较 。 采 用 单 因 素 方 差 分 析（ANOVA）对多组进行比较。 组数据为提出作为的平均值±平均值的标准误差（SEM），并且小于0.05的P值被认为具有统计学显著性。3. 结果3.1. 心肌梗死时心肌重构和心肌能量代谢的改变首先，为了揭示梗死心脏中与心脏损伤相关的多种病理变化，我们通过LAD结扎建立了在体MI模型。超声心动图和血流动力学测量结果显示，MI心脏的射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）均明显低于假手术组（图1（a））。小鼠心脏的HE染色显示出明显的结构异常，包括心肌细胞大小的变化和更大的细胞间隙，伴有炎性细胞浸润（图1（b））。电子显微镜图像显示MI心脏中心肌的基本结构异常，线粒体肿胀和核固缩（图1（c））。另外为了为了研究心肌能量代谢的改变，例如ATP、葡萄糖和FA的改变，在心肌缺血期间检测它们的水平。ATP作为心肌组织中能量的主要形式，在心肌梗死后可被利用。使用ELISA，我们发现在梗塞心脏的边缘区ATP水平降低（图1（d））。在MI组中，GLUT4、HK1和CD36在mRNA和蛋白质水平的表达明显下调（图1A和1B）。1（e）和（f））。这些结果表明，心肌梗死小鼠心脏损伤程度不同程度加重，可能与代谢改变和炎症反应有关。3.2. 在MI心脏越来越多的证据表明，焦亡在MI的炎症过程中起着关键作用[29，30]。在图1.一、MI小鼠的心脏损伤（a）假手术和MI小鼠（n= 5）的超声心动图、EF和FS测量**P 0.01，与假手术相比，平均值± SEM。（b）来源于假手术和MI心脏的横截面切片的HE染色（n = 3）。蓝色箭头表示较大的细胞间隙，黄色星号表示炎性细胞浸润。(c)假手术和MI心脏的代表性透射电子显微镜（TEM）显微照片;蓝色箭头表示核固缩，绿色箭头表示线粒体肿胀（n= 4）。（d）假手术和MI心脏组织匀浆中的ATP水平（n= 3;*P 0.05）。（e，f）MI手术后24 h各组左心室梗死边缘区GLUT 4、HK 1和CD 36在mRNA和蛋白水平的表达（*P 0.05，**P 0.01，与假手术组相比;n= 3至n= 4;平均值± SEM）。J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4953在典型的焦亡信号传导途径中，胱天蛋白酶原-1蛋白的寡聚化引导自身蛋白水解裂解成裂解的胱天蛋白酶-1，然后激活GSDMD的裂解并诱导GSDMD-N-末端片段的释放，这导致膜孔释放具有生物活性的IL-18和IL-1b[28]。为了进一步研究MI后炎性细胞死亡的程度，进行TUNEL染色分析以确定小鼠心脏中的DNA完整性;其显示MI小鼠心脏中有许多TUNEL阳性细胞（图2（a））。qRT-PCR结果显示MI组中NLRP 3、半胱天冬酶-1、IL- 18和IL-1b的表达在mRNA水平上显著增加（图2（b））。NLRP 3、切割的caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b、并且成熟IL-1b在MI小鼠心脏中也显著上调（图2（c））。小鼠心脏的免疫组织化学分析显示，MI组中NLRP 3和半胱天冬酶-1的表达也显著上调（图2（d））。此外，在MI小鼠血清中一致地观察到IL-18和IL-Ib的类似变化（图1B）。 2（e）），显示心肌细胞焦亡的诱导。LPS用于在心肌细胞中诱导炎症反应，以模拟MI后的心肌炎症。心肌细胞的TUNEL染色分析进一步证实LPS诱导了核染色体DNA断裂（附录A中的图S1（a））。电镜图像显示核固缩、线粒体肿胀和膜溶解图二、心肌细胞凋亡发生在MI心脏。（a）通过TUNEL染色代表性图像，显示假手术组和MI组中具有核染色体DNA片段化的细胞（绿色：TUNEL阳性细胞;蓝色：DAPI;n= 3）。（b）假手术和MI心脏中的相对mRNA水平（n=4至n= 8;*P 0.05，**P 0.01，与假手术相比，平均值± SEM）。（c）假手术组和MI组中NLRP 3、裂解的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b、成熟IL-1b和GAPDH的相对蛋白水平（*P 0.05，**P 0.01，与假手术组相比;n= 3至n= 9;平均值± SEM）。（d）假手术和MI心脏中的NLRP 3和半胱天冬酶-1水平，如通过免疫组织化学染色所示（黄色箭头表示阳性细胞; **P0.01，与假手术相比;平均值± SEM;n = 3）。(e)通过ELISA测定法检测假手术和MI小鼠血清中IL-18和IL-1b的浓度（**P 0.01，与假手术组相比;n= 4至n= 6;平均值± SEM）。J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4954×·在LPS处理的心肌细胞中（图1B）。附录A中的S1（b））。心肌细胞的qRT-PCR分析显示，在LPS处理组中，半胱天冬酶-1的表达在mRNA水平上显著增加，并且一致地证明了NLRP 3、IL-18和IL-1 b的类似变化（图1B）。附录A中的S1（c））。同时，在LPS处理的心肌细胞中，NLRP 3、切割的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b和成熟IL-1b蛋白水平的表达显著增加（图1B）。附录A中的S1（d））。免疫荧光测定显示，在LPS处理的心肌细胞中，NLRP 3和半胱天冬酶-1的表达显著增加（图1B）。附录A中的S1（e））。3.3. CPAL缺乏对心脏保护作用然后我们进一步探讨了lncRNA在MI后炎症过程中的关键作用。我们首先测量了可能与CVD相关的lncRNA的差异表达水平[10]，包括AK009126 （ CPAL ） 、 AK157022 、 AK086435 、 AK156356 、AK076765 、 AK035575 、 AK044386 、 AK141702 、 AK0158845 、ENSMUST00000148132、ENSMUST00000101162、ENSMUST00000137198和ENSMUST00000143898。假手术和MI心脏或炎性疾病。结果显示，CPAL在MI心脏和炎症过程中表现出最明显的失调（图1A和1B）。3（a）和（b））。FISH测定表明CPAL分布在心肌细胞的细胞核和细胞质中，并且在新生心肌细胞中LPS处理后增加（图3（c））。基于上述发现，我们进一步通过图1所示的实验程序探讨了CPAL的改变是否与心肌细胞代谢改变和焦亡有关。第3段（d）分段。 在体内研究中，通过尾静脉注射将AAV 9-sh-NC和AAV 9-sh-CPAL递送到小鼠中;然后，在AAV 9-sh-CPAL感染（1× 10- 12vg/mL，100μL）后四周，通过qRT-PCR在各种组织中验证CPAL的表达效率。结果表明，CPAL在心肌中被成功敲低（图1B）。附录A中的S2）。随后，我们通过结扎LAD冠状动脉24 h的方法建立2，3，5-TTC染色显示敲低CPAL减少MI损伤的小鼠心脏中的梗塞大小（图3（e））。超声心动图测量显示，MI小鼠的EF和FS在24小时时显著下降，但在AAV 9- sh-CPAL给药组中显著增加，表明CPAL缺失的心脏保护作用（图3（f））。假手术组小鼠心脏未见病理学病变。MI组中的所有小鼠在心脏中显示出轻度炎症灶，并且这些改变在CPAL敲低组中显著减轻（图3（g））。同时，观察CPAL对大鼠心肌细胞超微结构的影响，心肌细胞，进行电镜检查。 结果发现MI组心肌线粒体肿胀，核固缩。 CPAL缺失显著缓解了这些变化，表明CPAL缺失减少了炎症的发展，并保护心脏免受MI手术后的缺血性损伤（图11）。 3（h））。3.4. CPAL缺乏对心肌细胞代谢心肌梗死后心室重构是一个慢性、复杂的过程，其能量代谢受多种因素的调节在此我们首先探讨CPAL是否参与NFj B相关的心肌能量代谢过程.我们发现，当通过ELISA检测时，梗塞心脏的边缘区中的ATP水平降低;然而，这些有害的变化通过删除CPAL而明显减弱（图1）。 4（a））。此外，心肌缺血还存在糖脂代谢异常心肌梗死组HK1和CD36mRNA水平表达明显下调组，其通过CPAL缺失而被阻止（图1A和1B）。4（b）和（c））。同时，GLUT4、HK1和CD36在MI心脏中在蛋白水平上显著下调，这被阻止。通过CPAL删除，如图所示。4（d）-（f）.这些结果提示，CPAL缺乏有利于保护糖脂代谢，补充缺血心肌，从而减轻心肌缺血损伤。3.5. CPAL缺失减少MI小鼠的心肌细胞焦亡为了确定CPAL缺失是否对MI心脏中的心肌细胞焦亡发挥保护作用，进行TUNEL染色并显示心肌缺血引起的细胞死亡，其中CPAL缺失减弱了细胞死亡（图1B）。5（a））。如图5（b）所示，与MI心脏中的那些相比，CPAL缺失降低了NLRP 3、半胱天冬酶-1、IL-18和IL-1b一致地，与MI小鼠的那些相比，CPAL缺失降低了NLRP3、切割的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b和成熟IL-1b的蛋白水平，如通过蛋白质印迹分析所示（图1B）。 5（c））。 从每组收集血清样品，用于使用ELISA测量IL-18和IL-Ib水平;结果显示，相对于MI样品，在CPAL敲低的MI小鼠中，IL- 18和IL-Ib的血清水平明显降低（图1B）。 5（d））。一致地，免疫组织化学分析显示，与MI小鼠相比，CPAL缺失小鼠中NLRP 3和半胱天冬酶-1蛋白水平分别显著降低（图1B ）。 5（e））。3.6. CPAL沉默减少体外细胞凋亡在心肌细胞中，使用si-CPAL进行CPAL敲低（附录A中的图S3）。在LPS组中观察到严重的心肌细胞然而，si-CPAL处理显著改善了心肌细胞存活，如TUNEL染色所揭示的（图1）。 6（a））。如图 6（b），LPS刺激后细胞出现不同程度的超微结构改变，包括核固缩、线粒体肿胀变性和膜损伤，这些改变可被si-CPAL逆转。此外，蛋白质印迹结果显示，与LPS组相比，CPAL沉默在蛋白质水平上减弱了NLRP 3、切割的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b和成熟IL-1b的表达（图6（c））。一致地，免疫荧光测定显示与单独si-NC处理的那些相比，si-CPAL处理的新生小鼠心肌细胞中NLRP 3和半胱天冬酶-1蛋白水平降低（图1B）。 6（d））。此外，我们分析了CPAL对LDH释放的影响，发现CPAL沉默抑制了由于LPS而增加的LDH释放水平这些结果表明，质膜渗透性的增加参与了CPAL介导的心肌细胞焦亡（图1）。6（e））。3.7. CPAL作为NFjB的上游激活剂为 了 探 索 CPAL 调 节 心 肌 细 胞 凋 亡 的 关 键 机 制 ， 我 们 使 用catRAPID数据库对 分析揭示了在76-127和209-260nt处CPAL和NF κ B相互作用的高概率（图1B）。（见第7（a）段）。这一初步分析使我们检查了CPAL和NFj B之间的功能关系然后我们进行RIP以确定CPAL是否可以直接结合NFj B。结果清楚地表明存在这种相互作用，即NFj B与可观量的CPAL结合的免疫沉淀（图7（b）），这表明CPAL对NFj B具有强的特异性亲和力。在这之后，J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4955图3.第三章。CPAL在MI心脏和炎症条件下上调（a）通过qRT-PCR测定，相对于MI，假手术小鼠心脏的lncRNA表达分析（n=3至n= 6;*P 0.05，**P 0.01，与假手术相比（b）LPS（50nmol·L-1）处理12 h后或未处理的心肌细胞中lncRNA表达分析的验证（n= 3至n= 6;**P 0.01，与对照（Ctl）组相比（c）心肌细胞中CPAL特异性探针的FISH染色（18S是细胞质标记，U6是核标记，n= 3至n= 5）。(d)体内研究的实验程序示意图。(e)携带shRNA（AAV 9-sh-CPAL）的重组腺相关病毒（血清型9; AAV 9）载体在MI小鼠中敲低内源性CPAL在假手术组、MI组、+AAV 9-sh-NC组和+AAV 9-sh-CPAL组中，小鼠心脏的梗塞边缘区的TTC染色（f）假手术、MI、+AAV 9-sh-NC和+AAV 9-sh-CPAL小鼠的超声心动图、EF和FS分析（**P 0.01，与假手术组相比;#P0.05，##P0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;n= 5至n= 8;平均值± SEM）。(g)来源于假手术、MI、+AAV 9-sh-NC和+AAV 9-sh-CPAL心脏的横截面切片的HE染色（蓝色箭头表示较大的细胞间隙，黄色星形表示炎性细胞浸润;n= 3至n= 4）。(h)TEM显微照片显示各组小鼠心肌超微结构变化（蓝色箭头：核固缩;绿色箭头：线粒体肿胀;n= 4）。我们检验了CPAL除了蛋白质相互作用外是否在NFjB活性中执行任何直接作用。我们发现，CPAL耗竭后，P-NFj B的表达在蛋白水平上明显下调，而总的NF j B的蛋白表达在蛋白水平上明显下调。NFj B无显著变化。 （图 7（c））。通过免疫组织化学分析，在CPAL敲除MI小鼠中也观察到类似的P-NFκ B下调（图1B）。 7（d））。体外实验中，利用CPAL siRNA验证CPAL的调控功能J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4956图四、CPAL对小鼠心肌梗死后心肌代谢的调节作用（a）来自假手术、MI、+AAV 9-sh-NC的心脏组织的匀浆中的ATP水平，以及+ AAV 9-sh-CPAL组（n= 5;**P 0.01;##P 0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比（b，c）MI手术后24小时每组左心室梗死边缘区中HK 1和CD 36在mRNA水平上的表达（**P0.01，与假手术组相比;##P 0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;n= 3至n= 5：平均值± SEM）。（将蛋白质表达标准化为GAPDH（*P 0.05，**P 0.01，与假手术组相比;#P0.05，##P0.01，与+AAV9-sh-NC组相比;n= 3;平均值± SEM）。在NFj B上。结果表明，与+si-NC组相比，LPS条件下si-CPAL处理后，P-NFjB在蛋白水平的表达明显下调（图7（e））;然而，总NFj B的表达没有改变。通过免疫荧光分析在P-NFjB P65中显示了类似的结果（图7（f））。免疫荧光染色显示，LPS处理可导致P-NF_（1B）P65在心肌细胞核内聚集，而CPAL沉默可抑制这一现象。这些结果表明，CPAL可能通过促进NFj B的磷酸化而激活NFjB功能，从而允许NFj B进入细胞核。为了证实NFj B磷酸化是由CPAL结合位点1，CTCGGAGAGACCTGGAGGGACCAGGACCACTCTTGTCTCGCCTGGA-CCTGC和位点2，TGTCTGAAGAAAAATGCTGGCCACTAATCGTTT-直接诱导的，采用寡脱氧核苷酸（ODN）技术。构建了两段特异性靶向和掩蔽NFjB结合位点的CPAL-ODN，标记为CPAL-ODN-1（掩蔽位点1）和CPAL-ODN-2（掩蔽位点2）。两个ODN分别与两个预测的CPAL结合位点完全互补 用CPAL和ODN共转染不能影响P-NF κ B水平（图1B）。 7（g））。这一结果表明CPAL可以与NFj B物理结合，并通过结合位点（位点1：76-127 nt和位点2：209-260 nt）诱导NFj B磷酸化3.8. 抑制NFjB减少LPS诱导的新生小鼠心肌细胞凋亡为了探索NF j B在LPS介导的新生小鼠心肌细胞焦亡中的作用，我们进一步探索了心肌细胞焦亡是否被SN 50（NF j B易位的细胞渗透性抑制剂）和Ac-YVAD-CMK（有效的半胱天冬酶-1抑制剂）逆转（图1B）。 8（a））。我们发现SN 50在蛋白水平上显著抑制LPS处理的新生小鼠心肌细胞中的这一发现意味着抑制NFj B可显著抑制caspase-1蛋白的表达，提示caspase-1可能是NFj B转录调控的下游基因。Ac-YVAD-CMK明显抑制心肌细胞中NLRP 3、半胱天冬酶原-1、裂解的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-18原、成熟IL-18、IL-1b原和成熟IL-1b的表达，表明心肌细胞中半胱天冬酶-1的抑制剂显著抑制与焦斑相关的基因的表达。当两种抑制剂一起作用时，心肌细胞中的NLRP 3、caspase-1原、切割的caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-18原、成熟IL-18、IL-1b原和成熟IL-1b的表达水平明显降低，表明NF κ B通过调节心肌细胞中caspase-1的表达而参与炎症反应和细胞凋亡。最后我们J. Li，H. Xue，N. Xu等人工程20（2023）4957图五、CPAL抑制的焦亡的下调（a）代表性TUNEL图像，显示每组中具有染色体DNA片段化的细胞（绿色：TUNEL阳性细胞;蓝色：DAPI;n=3至n=4 **P 0.01，与假手术组相比;##P0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;平均值± SEM）。（b）MI手术后24小时每组左心室梗死边缘区中mRNA水平的NLRP 3、半胱天冬酶-1、IL-18和IL-1b（**P0.01，与假手术组相比;##P 0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;平均值± SEM;每组n=6至n= 10只小鼠（c）小鼠心脏中NLRP 3、裂解的半胱天冬酶-1、GSDMD、GSDMD-N、pro-IL-18、成熟IL-18、pro-IL-1b和成熟IL-1b的相对蛋白水平将蛋白质表达标准化为GAPDH（**P 0.01，与假手术组相比;##P 0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;n= 3至n= 6;平均值± SEM）。(d)每只小鼠血清中IL-18和IL-1b的浓度（**P 0.01，与假手术组相比;##P 0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;平均值± SEM;每组n= 4至n= 6只小鼠（e）左心室梗死边缘区中NLRP 3和半胱天冬酶-1蛋白的免疫组织化学染色（**P 0.01，与假手术组相比;##P0.01，与+AAV 9-sh-NC组相比;n= 3至n= 4;平均值± SEM）。研究了NFj B是否对Caspase-1活性有任何直接影响，除了调节表达和这种Caspase-1介导的表达调节
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