绿色植保创新展望：植物毒性代谢物和酶活性对除草剂研发的影响"-2020

工程6（2020）509研究绿色植保创新展望通过植物初级代谢产物和酶活性的弗兰克·E放大图片作者：Stephen O.杜克湾a美国科罗拉多州立大学农业科学学院农业生物学系，柯林斯堡，CO 80523，b自然产品利用研究，农业研究服务，美国农业部，大学，MS 38677，美国阿提奇莱因福奥文章历史记录：2018年12月24日收到2019年4月15日修订2019年7月11日接受2020年3月14日网上发售保留字：天然产物生物理性发现作用模式除草剂A B S T R A C T自20世纪80年代以来，没有引入具有新的分子作用位点（SOA）的除草剂。从那时起，杂草对大多数商业除草剂的抗性的广泛进化极大地增加了对具有新SOA的除草剂的需求。两个未尝试过的策略发现新的除草剂SOA进行了讨论。一些初级代谢中间体是植物毒性的（例如，原卟啉IX和鞘氨醇碱），并且正因为如此，这些化合物的体内所有初级代谢物植物毒性和池大小的确定将确定感兴趣的目标。针对导致植物毒性化合物积累的SOA是发现除草剂的第一第二种方法是鉴定体内酶水平非常低的潜在SOA。我们知道，SOA的酶分子数量越多，需要更多的除草剂来杀死植物。现代蛋白质组学方法可以鉴定低酶水平的SOA，为除草剂的生物合理开发提供依据。这些方法可能有助于发现与天然化合物更密切相关的除草剂，并且可以以较低的剂量使用©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍具有明确的新分子靶标（作用位点（SOA））的商业除草剂已经超过30年没有引入[1]。在此期间，进化的抗除草剂杂草的独特案例数量增加了约500%，许多最有问题的杂草物种现在对具有不同SOA的几种除草剂具有抗性[2]。管理除草剂抗性进化风险的一种方法是联合施用具有几种作用模式（MOA）的除草剂，正如药物混合物延迟对药物的抗性进化一样。与抗生素和其他一些药物一样（例如，由于抗肿瘤药物），迫切需要具有新SOA的化合物用于耐药性管理。不幸的是，由于除草剂的巨大成功，农业化学工业在20世纪90年代中期对除草剂发现的投资下降了抗草甘膦作物的种植以及由此导致的除草剂市场价值的下降[1]。快速整合的COM-*通讯作者。电子邮件地址：franck. colostate.edu（F.E. Dayan）。参与除草剂发现的公司[3]也导致了除草剂发现总体投资的迫切需要发现具有新SOA的除草剂，这激发了人们对实现这一目标的从历史上看，发现程序依赖于合成和评估大型化学库，以确定有前途的除草活性的线索（高通量筛选）。另一种方法是优化具有新型分子靶标的中等活性化合物的结构，以开发在分子靶标上具有改进的活性和农业用途所需的物理化学性质的商业产品。这方面的实例是通过化感化学leptospermone的结构优化衍生的三酮除草剂[4]。Leptospermone和这些商业除草剂类似物抑制羟苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）[5]，最后一种新的除草剂SOA。存在许多其他具有新分子靶标的天然植物毒素，可用作除草剂发现的起始模板[6]。然而，迄今为止，这种方法还没有产生具有新SOA的商业除草剂。同样，无论是结合到潜在除草剂靶酶的小分子的计算机模拟（生物合理设计）还是用潜在靶酶的体外测定筛选大的组合化学文库，https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.03.0042095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng510F.E. 达扬， S.O. Duke /工程 6 （2020）509产生了具有新SOA的商业产品。最后，使用基因敲除来寻找新的SOA已经鉴定了潜在的新的除草剂靶标（在参考文献[7]中详细讨论），但是寻找具有良好除草活性的针对这些靶位点的分子尚未成功。这种方法的一个问题是敲除突变体通常完全消除靶酶的活性，而化学品很少提供100%的酶抑制。因此，用敲除实现的致死表型不转化为除草活性，其中靶标活性被化学品部分抑制。需要一种校准的基因敲除方法来更好地评估除草剂SOA。尽管人们对发现具有新SOA的除草剂的新方法有浓厚的兴趣，但很少有论文提供对此类发现的新策略的见解。一个例外是使用基因组方法从位于编码天然植物毒素的生物合成途径的酶的基因簇中的基因发现植物毒素的靶酶参考文献[8]）。产生抑制初级代谢酶的毒素的微生物通常在毒素合成的基因簇中具有抗性基因[9]。在一些情况下，抗性基因编码毒素靶标的突变抗性形式。因此，微生物植物毒素的研究具有发现新的潜在除草剂及其SOA的潜力这种方法是有前途的，但未经证实。例如，尽管通过该方法发现了支链氨基酸合成途径酶二羟酸脱氢酶（DHAD）的微生物产生的天然产物抑制剂（天冬氨酸），但它是酶的弱抑制剂和弱除草剂[10]。尽管DHAD被认为是一种潜在的除草剂SOA已有一段时间（在参考文献[9]中讨论），但仍然没有抑制DHAD的商业除草剂本文讨论了两种潜在的除草剂靶标识别新方法。第一个是鉴定当被抑制时会导致植物毒性代谢物积累的酶（图1）。第二是鉴定植物组织中低分子浓度的靶位点（图1）。这两种方法都有可能识别对相对较低的除草剂剂量有反应的靶标。从环境和毒理学的角度来看，低剂量是可取的，如果一种分子的生产成本很高，低剂量可以使其作为除草剂在经济上可行。2. 初级代谢酶大多数商业除草剂在杂草中仅具有一个主要分子靶位点。在某些情况下，除草剂靶向相同酶类型的几种变体，如Fig. 1.举例说明了本文讨论的两种新的潜在的除草剂靶标识别方法。第一个是鉴定酶，当抑制时，会导致植物毒性代谢物的积累（左），第二个是鉴定植物组织中低分子浓度的靶位点（右）。蛋白磷酸酶抑制剂内皮素和抑制极长链脂肪酸脱氢酶的除草剂几乎所有这些靶标都是初级代谢的具有非酶靶标的除草剂是光合电子流的光系统II抑制剂莠去津和敌草隆），光系统I能量转移剂（百草枯和敌草快），和植物生长素除草剂（例如，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D））结合F盒蛋白，其不是酶，但介导信号转导和基因表达。通过抑制酶阻断主要代谢途径应该是致命的，然而，用化学物质完全阻断是困难的植物毒性化合物的积累，除了部分阻断途径外，还应增加除草剂的功效。几种非常成功的除草剂和一些天然植物毒素发挥其作用，主要是由于积累的植物毒性中间代谢物或代谢物衍生物（图。 1）。最明显的例子是原卟啉原氧化酶（PPO）抑制剂（表1）[11]。PPO抑制剂是一类相对较大的除草剂。PPO是在线粒体和质体中发现的酶叶绿体）参与血红素和叶绿素生产所需的卟啉的生物合成。这些抑制剂引起PPO的酶产物原卟啉IX（PPIX）的积累，即使它们抑制PPO。PPIX在光和分子氧的存在下具有高毒性，因为在这些情况下，它作为光敏色素，产生单线态氧，这反过来又产生其他活性氧（ROS）。当PPO被抑制时，其前体原卟啉原IX积累并退出卟啉途径，在相对不受单线态氧和其他ROS保护的细胞部分中通过PPO以外的方式氧化成PPIX通常，PPIX和其他卟啉途径中间体以非常低的浓度被发现，表1涉及有毒前体积累和/或涉及低浓度靶位点（SOA）的除草剂MOA靶位点实例毒性中间体靶丰度原卟啉原氧化酶（PPO）原卟啉IX低乙酰乳酸合酶（ALS）a氯嘧磺隆乙基五氟磺草胺甲咪唑烟酸神经酰胺合酶（CS）bAAL-毒素Fumonisinsα-酮丁酸酯2-氨基丁酸奎宁鞘氨醇4-羟基鞘氨醇介质低谷氨酰胺合成酶（GS）2-磷酸乙醇酸乙醛酸酯5-烯醇式莽草酸-3-磷酸（EPSPS）高低AAL：链格孢（Alternaria alternataf.）sp. 番茄。a也称为乙酰羟酸合酶（AHAS）。b也称为鞘氨醇N-酰基转移酶。c草铵膦引起氨的积累，但这可能与其除草活性无关。F.E. 达扬， S.O. Duke /工程 6 （2020）509511局限于线粒体和质体中的卟啉途径，其中存在相对良好的保护免受ROS的影响，特别是在叶绿体中。这种类型的MOA的一个优点是，致死的ROS水平可能是由植物中PPO活性的部分抑制产生的最有效的PPO抑制剂是一些最有效的除草剂，其施用率最低（每公顷几克）。在致死剂量下，所有除草剂都会导致ROS的产生，这是严重的生化和生理破坏的第三种效应ROS进一步破坏植物有许多文章把这种普遍的第三效应误认为是一种更主要的效应。使用PPO抑制剂，ROS的产生更接近PPO抑制的主要事件乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂是一类非常大的除草剂（表1）。ALS是第一种合成支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的酶如果ALS抑制剂的作用完全是由于支链氨基酸的消耗，理论上，该途径的其他两种酶中的任何一种都可以是同样好的除草剂靶标。然而，有许多来自几个化学类别的商业ALS抑制剂除草剂，并且 没 有 靶 向 该 途 径 的其 他 两 种 酶 中 的 已 发 现 酮 酸 还 原 异 构 酶（KARI）和DHAD（途径中的第二和第三种酶）的良好体外抑制剂[12但是，KARI和DHAD开发商业除草剂抑制剂一直不成功。这三种酶之间的一个区别是只有ALS底物α-酮丁酸（2KB）是植物毒性的。2KB可以被转氨为植物毒性2-氨基丁酸（2AB），并且2KB和2AB都在用ALS抑制剂处理的高等植物中积累[15]。虽然沙纳和辛格[16]得出结论，由于2AB和ALS抑制剂的除草效果之间没有良好的相关性，因此缺乏良好的除草作用并不排除缺乏参与。在同一篇论文中，他们表明，用高水平的缬氨酸处理玉米幼苗会由于2AB是植物毒性的，这可以解释缬氨酸的生长减少。在他们的实验中缺乏良好的相关性可能是由于涉及植物毒性的2AB池的细胞定位的混杂效应。ALS抑制剂还引起奎尼酸（一种来自莽草酸途径的植物毒素）的积累，如下所述[17]。ALS的抑制如何导致奎尼酸积累尚不清楚。与大多数其他商业除草剂相比，最好的ALS抑制剂在非常低的剂量下是链格孢sp. 番茄（AAL）毒素是一种天然的植物毒素，其在非常低的剂量下有效通过抑制神经酰胺合酶（植物中的CS或二氢鞘氨醇N-酰基转移酶），它导致鞘氨醇碱CS前体二氢鞘氨醇和4-羟基二氢鞘氨醇的快速和高水平积累（表1）[18]。即使在亚微摩尔浓度下，作用也是迅速而强烈的。此外，外源性供应的CS前体引起与AAL-毒素类似的植物毒性症状[19]，表明前体的积累而不是神经酰胺的抑制产生是膜功能快速丧失的原因健康植物组织中CS前体的水平非常低，但神经酰胺及其葡萄糖基化形式是植物质膜的重要组分[20]。游离鞘脂碱对膜完整性损失的快速影响[19]可能是由于这些化合物对血浆膜完整性的直接影响，而不是其他机制的间接影响。AAL-毒素和其它结构上相关的CS抑制剂（例如，伏马菌素）对CS前体的积累产生类似的影响[21]。尽管许多人已经将诱导细胞凋亡作为AAL毒素的MOA（例如，参考文献[22]），这些影响显然是次要或三级的毒素对CS的主要影响，就像百草枯毒性相关的细胞凋亡在植物中[23]。这显然是除草剂的副作用在充足的阳光下，大量ROS产生导致细胞膜迅速破坏，导致百草枯引起细胞死亡，这种破坏速度太快，不涉及凋亡过程。草铵膦是一种广谱和非选择性除草剂，导致植物快速死亡（接触活性）。草铵膦是D-和L-膦丝菌素的外消旋混合物。L-草胺膦是吸水链霉菌的天然产物，是草铵膦的唯一活性成分.它用于非作物地区和转基因抗草铵膦作物的杂草管理。它抑制谷氨酰胺合成酶（GS），一种在植物叶片中大量存在的酶，在植物氮同化中起着至关重要的作用（表1）[24]。GS1同种型位于细胞质中，而GS2同种型存在于叶绿体中[25]。GS2将光呼吸产生的氨同化为谷氨酰胺[26，27]。虽然有几种已知的GS抑制剂，主要是由微生物产生的化合物，但草铵膦是唯一一种已开发成商业除草剂的分子[6]。草铵膦与GS不可逆地结合，并导致来自光呼吸途径的氨积累。虽然草铵膦的作用机制与其光呼吸途径的改变之间存在关联，但草铵膦的毒性作用与氨积累没有直接关系，而是ROS快速积累和随后脂质过氧化的结果[28]。ROS的起源还不清楚，但可能与用这种除草剂处理的敏感植物中观察到的碳同化抑制有关这种抑制可能是由于光呼吸途径中一些中间体（磷酸乙醇酸盐、乙醇酸盐和乙醛酸盐）的蓄积所致这些中间体中的一些是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RUBP羧化酶或Rubisco）的强抑制剂[29，30]，因此可以被认为是天然植物毒素。草甘膦是世界 它只有一个SOA，5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），但如何抑制EPSPS杀死植物（MOA）仍然不完全清楚（表1）[32]。EPSPS是莽草酸途径的酶，其负责芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的产生。大多数植物物种具有非常低水平的莽草酸-3-磷酸（EPSPS的底物）或莽草酸（EPSPS之前的酶的底物），但是用草甘膦处理导致高水平的莽草酸积累，并且在较小程度上导致奎尼酸积累，奎尼酸是莽草酸途径的中间体（3-脱氢奎尼酸）的另一种奎尼酸也可以通过奎尼酸水解酶从莽草酸产生[33]。有趣的是，ALS抑制剂除草剂（见上文）也会导致奎尼酸盐的积累[17]。通过任何抗性机制对草甘膦具有抗性的植物不会积累莽草酸，因此测量莽草酸对草甘膦的响应是检测草甘膦抗性的快速生物测定[34]。我们没有发现莽草酸的植物毒性数据，但奎尼酸具有中度植物毒性，可能引起ALS抑制剂和草甘膦的一些影响[17，35，36]。奎尼酸盐的一些作用，如对碳水化合物代谢的作用，与甘氨酸类似[35]。因此，草甘膦的至少部分影响可能是由于高水平的奎尼酸盐。虽然莽草酸和奎尼酸都被发现在非常低的在大多数植物组织中的水平，有几种植物物种积累高水平的莽草酸（ 例 如 ， 八 角 茴 香 （ Illicium verum ） 、 枫 香 （ Liquidamberstyraciflua））[37，38]和奎尼酸酯（quinate）（例如，Chinchonaofficianalis）[39].我们假设这些植物有一种将这些化合物与参与正常生长和发育的细胞分开的方法，以避免自毒性，正如许多其他化合物通常会导致植物自毒性一样[40]。512F.E. 达扬， S.O. Duke /工程 6 （2020）509·许多年前，Cornish-Brown预测通过非竞争性抑制作用的农药可能特别有效，因为代谢中间体的强烈积累[41]。如果中间体对目标生物体有毒，则草甘膦是已知的唯一一种与莽草酸无竞争性的酶抑制剂，并且它引起两种中间体的大量积累因此，抑制具有植物毒性前体的酶的非竞争性酶抑制剂除草剂有许多次生代谢的植物毒性代谢物，但产生它们的酶不太可能是良好的除草剂靶标。这有几个原因。第一，如果次级产物具有高度植物毒性，则将其分隔或排出以避免自毒。例如，高度植物毒性的青蒿素被分隔在远离细胞质的腺毛的表皮下空间中[40，42]。一些植物毒性化合物储存在液泡中，在那里它们不会造成伤害。例如，植物毒性芥子油苷储存在植物液泡中[43]。化感物质高粱酮的氢醌前体由高粱属物种的根毛分泌到土壤中，在土壤中氧化成植物毒性醌高粱酮[44]。这些次级化合物通常位于生物合成途径的末端，因此它们不是可以通过抑制酶而积累的底物另一个问题是，植物的大多数植物毒性次级代谢产物是由非常有限数量的植物物种产生的，其中大多数不太可能是目标杂草。一个极端的例子是青蒿素，它只由黄花蒿产生，一个很小的杂草[42]。有一些次级化合物几乎可以被认为是初级代谢产物，因为它们在高等植物中几乎无处不在一个例子是t-查耳酮，它是高等植物中苯丙烯类化合物的前体它是一种中等有效的植物毒素[45]，因此抑制将其用作前体的酶，查耳酮异构酶，可能导致毒性水平的积累。另一个可能增加植物毒素产生的因素是当SOA被抑制时，代谢途径的失调是中间体这是我们所知甚少的事情。有一些证据表明，抑制EPSPS会导致一种或多种莽草酸途径产物的浓度降低，这些产物调节进入莽草酸途径的碳流[32]。类似的情况也可能发生在ALS、CS、GS和PPO的抑制上。如果是这样的话，途径失调的程度可能是至关重要的，因为有毒中间体的浓度是否上升到致命的另一个要考虑的因素是植物毒性中间体的体内半衰期。该化合物可能不稳定，或者可能代谢转化为比中间体毒性更小或更大的化合物。后者的一个例子是莽草酸转化为羟基苯甲酸，如原儿茶酸和没食子酸[46]。没食子酸是一种植物毒素[47]。这些抑制酶引起有毒代谢物积累的情况可能代表了这些可能性的一小部分据我们所知，还没有研究来检查所有的初级代谢产物，更不用说次生代谢产物，植物的植物毒性。另一种方法可能是检查代谢组学数据，以发现哪些化合物在健康植物组织中的浓度非常低，因为进化使植物中植物毒性初级代谢中间体的积累最小化。然后可以测试这些化合物的植物毒性以鉴定潜在的除草剂靶酶（SOA）。3. 目标浓度低另一种可行的除草剂靶标鉴定方法是确定那些以相对低的浓度植物中的浓度（图） 1）。相反，长期以来人们认识到，大量存在的潜在靶位点不是好的靶位点，因为需要高剂量的除草剂来抑制足够部分 的 靶 标 以 杀 死 植 物 。 核 酮 糖 -1 ， 5- 二 磷 酸 羧 化 酶 / 加 氧 酶（Rubisco）是一种负责C3光合碳固定的酶。Rubisco是植物中最丰富 的 蛋 白 质 ， 分 别 占 C3 和 C4 植 物 绿 叶 中 蛋 白 质 的 约 50% 和30%[48]。由于其丰富，它甚至被提议作为绿叶的膳食蛋白质来源[49]。 存在Rubisco的天然和合成抑制剂，例如2-羧基阿拉伯糖醇-1-磷酸（Rubisco中间体的天然存在的过渡态中间体[50]）和碘乙酰醇（iodoacetol）（合成化合物[51]），但是抑制足够的Rubisco以杀死杂草将需要大量的施用率。因此，这不是那些参与除草剂发现的人感兴趣的靶位点。通过其靶标EPSPS的基因扩增而进化出对草甘膦的抗性的情况证明除草剂的靶位点的量对于除草剂是否可行是关键的。草甘膦是一种高用量除草剂，在许多情况下，需要~1 kg hm-2才能有效地杀死大多数目标杂草。作为地球上使用最多的除草剂[31]，进化抗性的选择压力是巨大的，在草甘膦商业化后约25年开始的20年内，有47种杂草物种具有抗性[2]。进化出了各种抗性机制[52，53]，但更常见的机制之一是EPSPS基因的扩增，导致杂草中EPSPS酶的浓度高得多，因此需要高得多的草甘膦剂量来抑制足够的EPSPS，从而致命地阻断莽草酸途径[54]。基因拷贝增加90倍导致抗草甘膦苋中EPSPS蛋白质的量增加12倍[54]，该量导致草甘膦的有效剂量增加约6至8倍，该剂量既不经济也不环境可行[54]。自从这第一例基因扩增以来，这种对草甘膦的抗性机制已经在阔叶和禾本科物种中发现（例如，参考文献[54如果杂草中的EPSPS水平通常与针对该除草剂靶标的基因的进化基因扩增的水平一样高，那么草甘膦将永远不会被开发为除草剂，因为它将需要每公顷至少10 kg的除草剂，这一剂量在经济和环境上都是不可接受的。如果它是一种低使用率的除草剂，情况可能并非如此。基因扩增也被发现是对乙酰辅酶A（CoA）羧化酶抑制剂除草剂的抗性机制[60]。在大多数除草剂抗性或某些物种对某些除草剂的天然耐受性的情况下，这种抗性机制尚未被寻找，因此我们不完全知道酶丰度在进化抗性和天然耐受性的许多情况下的作用有多重要。同样，几乎没有关于在植物中发现的主要生化途径的每种酶的蛋白质量（绝对或相对）。该量代表潜在的除草剂结合位点的数量，并且与草甘膦一样，它将影响必须到达这些酶的亚细胞位点以对植物致命的除草剂的浓度。蛋白质组学在过去的二十年里取得了巨大的进步，提供了大量关于比较蛋白质组学、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质功能、翻译后修饰等方面的信息，但是，即使对于拟南芥，初级代谢的所有酶的每种蛋白质的实际相对浓度也没有被确定。然而，有方法可用于鉴定植物细胞中低丰度蛋白质，其水平低至F.E. 达扬， S.O. Duke /工程 6 （2020）509513·2.25 fmol mg-1叶鲜重（例如，参考文献[61]）。低丰度酶比高丰度酶更可能是更好的潜在除草剂靶位点。4. 离别的思念关于这两种可能的办法，都有一些需要注意的问题，即资金池的规模或集中度并不反映资金池的周转率在有毒代谢物的情况下，当互补SOA被抑制时，库的更高周转率将意味着化合物的更快积累在酶SOA的情况下，更快的周转率可能会降低除草剂靶向该SOA的功效，因为单位时间内除草剂与靶标相互作用的可能性会增加，因为单位时间内存在更多如果除草剂是不可逆的粘合剂，并且酶的降解不会释放未改变的除草剂，这将是更重要的被抑制的酶和/或结合酶的除草剂的命运将影响酶库通量速率对除草剂效力的影响必须牢记这些告诫。对具有新SOA的商业除草剂的迫切需求使得使用可能最大化成功可能性的所有发现策略是值得的。在这篇简短的论文中，我们提出了两个概念简单的策略。代谢酶可用于鉴定可能具有毒性前体或如果在体内积累可能转化为毒素的前体的靶标。蛋白质组学可用于鉴定以低丰度存在的酶靶标。理想情况下，应该寻找低丰度的SOA，当抑制时产生植物毒素，如PPO（表1）。然而，情况并非总是如此，如草铵膦靶向GS（叶中第二丰富的酶）所证明的。我们讨论的两种策略可能都被除草剂发现公司使用过，但是，如果是这样，我们还没有找到它的公开记录遵守道德操守准则弗兰克·EDayan和Stephen O.杜克大学声明，他们没有利益冲突或财务冲突披露。引用[1] 杜克大学SO 。为什么近年来没有新的除草剂作用模式出现？害虫管理科学2012;68（4）：505-12.[2] 希普岛国际抗除草剂杂草调查[互联网]. 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