4Dia：自动4D显微镜图像对齐工具

软件影响11（2022）100199原始软件出版物4Dia：用于自动4D显微镜图像对齐的工具Nimmy S.作者：Michelle A.Urman，ChangHwan Lee美国纽约州奥尔巴尼大学RNA研究所生物科学系A R T I C L E I N F O关键词：ImageJ/Fijimacro细胞/组织对齐时间流逝实时成像荧光显微镜图像处理A B标准显微镜的最新进展使得能够以高分辨率进行三维实时成像。多细胞生物体的长期活体成像需要在稳定的生理条件下固定生物体。尽管适当固定，但由于其他内在和外在动力学，实时成像数据分析仍然存在挑战，这可能导致图像序列随时间的不对准。4Dia是一个ImageJ/Fiji宏脚本，通过Z堆栈以及使用任何用户选择的通道随时间对齐3D时移图像。4Dia基本上可用于任何组织样本，对Z堆叠的大小或时间点的数量没有限制。代码元数据当前代码版本V1.1用于此代码版本的代码/存储库的永久链接https://github.com/SoftwareImpacts/SIMPAC-2021-157可复制胶囊的永久链接N/A法律代码许可证MIT许可证使用的代码版本控制系统使用的软件代码语言、工具和服务IJM（ImageJ Macro language）编译要求、操作环境和依赖关系Fiji（ImageJ v1.53f），‘MultiStackReg’ plugin, and ‘TurboReg’如果可用，请链接到开发人员文档/手册N/A问题支持电子邮件chlee@albany.edu1. 介绍自光学显微镜出现以来，成像已成为生物学各个子领域（包括细胞生物学和遗传学）中日常使用的关键工具。特别是，荧光显微镜，它使用荧光蛋白或染料在特定波长可见，提供高度灵敏，特异性和可靠的显微镜图像，使观察细胞器和生物大分子的利益与非常详细[1，2]。光学技术的最新进展使荧光显微镜达到了另一个水平，其中大分子，如蛋白质和核酸，可以以单分子分辨率可视化[3]。显微镜的这些突破和力学的进步导致了空间和时间的高分辨率成像[4配备快速、灵敏的相机或光电探测器和精确的电动载物台的显微镜现在不仅可以在空间上实现亚分子分辨率，而且可以在时间尺度上实现更精细的像素/体素尺寸或更高的信噪比。高空间分辨率通常*通讯作者。电子邮件地址：chlee@albany.edu（C. Lee）。https://doi.org/10.1016/j.simpa.2021.100199需要延长的成像时间（例如，共焦激光扫描仪的激光停留时间较长），因此对固定样本的成像最有利，其中时间因素可以忽略。相比之下，高时间分辨率对于实时成像至关重要，特别是对于实时捕获高度动态的事件，如转录爆发或与快速移动的生物体一起工作完整生物体的活体成像比固定样品成像更具挑战性。外部因素，如任何阶段和焦点漂移、移动性和稳定的生理条件（温度、机械压力等）在对完整的多细胞生物体进行长期实时成像时必须考虑到这一点考虑到这些因素，已经开发了几种实时成像方法，但直到最近，很少适用于移动的多细胞生物体[11，12]。然而，即使生物体被适当地固定并良好地保持在成像系统内，细胞和组织仍然可以在生命系统内移动比如说，接收日期：2021年11月11日;接收日期：2021年11月30日;接受日期：2021年12月1日2665-9638/©2021作者。由Elsevier B.V.出版。这是一篇开放获取的文章，使用CC BY许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表软件影响杂志 首页：www.journals.elsevier.com/software-impactsN.S. 约翰，文学硕士Urman和C.李软件影响11（2022）1001992||一些细胞向组织的另一个区域迁移，或者感兴趣的组织可以被具有某些动力学（例如肠运动）的相邻组织移动[11]。所有这些因素使得更难以长时间监测动态生物现象。然而，这些内在的运动不容易调节，因为这些活动的中断通常会产生伪影。因此，图像采集后的计算处理以最小化这些运动的影响是获得实时成像数据的精确和完整分析的关键步骤。在这里，我们描述了用于自动4D显微镜图像对齐（4Dia）的ImageJ宏，我们开发了该宏以通过空间（X轴，Y轴和Z轴）和时间对齐组织或生物体。 宏是使用秀丽隐杆线虫种系的图像创建的，但基本上可以应用于任何组织类型[11]。2. 描述4D显微镜图像对准（4Dia）使用三维Z-堆叠时移图像（TIFF格式）并将它们沿着X轴对准，以及通过使用任何通道作为对准参考的时间，包括荧光通道（例如， GFP）、明场或DIC通道。4Dia可以处理的Z堆栈、通道或时间点中的切片数量没有限制。4Dia在ImageJ/Fiji软件中工作，需要两个ImageJ插件，bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/http://bradbusse.net/downloads.html4Dia 包 含 两 个 ImageJ/Fiji 宏 ： （ 1 ） “MultiStackReg_BatchProcess1of2.ijm”和（2）“MultiStackReg_BatchProcess2of2.ijm”，它们必须按顺序运行。第一个宏通过X轴对齐每个时间点的Z堆栈图像。该过程对于高度动态的组织或生物体特别有用，即使当在一个时间点内获取图像堆栈时也是如此。第二个宏使用来自第一个宏的经处理的图像，并进一步对齐所有时间点的Z堆栈。(1) 'MultiStackReg_BatchProcess1of2.ijm'在运行宏之前，用户需要指定将用于图像对齐的通道。为此，使用ImageJ/Fiji或文本编辑器打开文件，并将与通道顺序匹配的编号分配给第7行中的变量“ChToUse”。比如说，如果第二个通道将用于对齐，则用户应将数字“2”分配 执行宏时，首先要求用户选择一个源目录以及弹出窗口上的输出文件夹。 一旦选择了这两个文件夹，宏就会循环遍历时间流逝Z堆栈图像，并逐个处理它们。源文件夹中除TIFF以外的任何其他格式的文件都将被排除在对齐之外。 宏分离出要用于对准的通道，并使用两个相邻Z切片之间的信号模式的相似性开始沿着Z堆叠对准Z切片。对齐从Z堆栈的中间开始，将其用作参考图像。该宏将相同的对齐向量应用于所有其他通道，合并通道，并将新对齐的图像文件保存为原始文件名，指定输出文件夹中的'_Zreg'后缀。如果时移Z堆栈图像不需要通过X轴对齐，则可以跳过第一个宏。(2) 'MultiStackReg_BatchProcess2of2.ijm'此宏的工作方式与上述第一个宏类似。用户必须指定将用于图像对齐的通道，如上面针对第一个宏所解释的。执行时，宏将打开一个对话框，输入源目录和输出文件夹。应选择第一个宏新生成的文件夹，以通过时间点进一步对齐图像。此宏使用最大Z投影来对齐时间点之间的图像。它分离每个通道，使用来自第一个通道的Z投影图像（根据当前设置）记录每个时间点的对齐向量，并将其应用于每个时间点的所有Z切片。新对齐的图像以'_Treg'后缀保存3. 影响由于内在和外在运动，完整生物体的长期实时成像仍然难以分析。实时成像数据，特别是长期3D时移图像，通常非常大，因为每个时间点包含整个Z堆栈。 此外，当将突变体等其他条件添加到实时成像实验中时，要分析的数据量迅速扩大。因此，需要一种自动化的系统工具来确保实时成像数据已准备好进行分析。图像分析之前最关键的步骤之一是通过时间流逝对齐所有Z堆叠，以容易地追踪生物学现象的动态，例如转录突发事件[11，12]。据我们所知，4Dia是第一个以自动方式通过X轴以及时间点对齐3D Z堆栈图像的脚本。���4Dia允许通过Z堆栈和时间点进行4D图像对齐，使用任何选择的通道，如荧光、明场或DIC通道。4Dia最初是为了对准C而开发的。线虫生殖系组织图像以监测转录动态[11]。然而，4Dia基本上可用于任何组织类型，对Z堆叠的大小或时间点数量没有限制。4Dia可以帮助使用显微镜或生物医学成像的任何领域的研究人员，并需要在分析之前处理他们的时移图像，以更精确地评估动态。4. 局限性和可能的改进这些脚本的主要局限性在于它们没有经过测试 对于C以外的图像，秀丽隐杆线虫生殖系然而，我们期望宏将适用于所有组织类型，因为它们不基于C的任何特定特征。线虫生殖系组织我们的目标之一是使用具有不同物种和信号的其他图像来进一步优化脚本。另一个潜在的限制是，脚本可能无法对齐经历剧烈运动的组织。我们实现了另一个宏来手动修复这样的问题，通过用户输入转换特定的Z切片或时间点，可以在：https：//github.com/chleelab/4Dia网站。4Dia的最新版本也将在任何更新可用时上传。竞合利益作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作致谢感谢Judith Kimble、Sarah L. Crittenden和Tina R.林奇对这份手稿的批评该项目得到了美国心脏协会（18POST34030263，CHL）和美国RNA研究所奖学金（MU）的支持。引用[1] J.W. Lichtman，J. A. Conchello，Fluorescence microscopy，Nature Methods 2（2005）910-919.[2] M.J.桑德森岛史密斯岛帕克医学博士布特曼，荧光显微镜，冷泉港。协议2014（2014）pdb.top071795。[3]D.B.施 莫 尔 策 角 斯 坦 德 利 ， K.E. Fogarty， A.H. Fischer ， 显 微 镜 技 术 进 展 ，Arch.Pathol。实验室135（2011）255-263。[4]单分子荧光显微镜综述：新的发现对波特兰出版社. https：//portlandpress.com/bioscirep/article/37/4/BSR20170031/57124/Single-molecule-fluorescence-microscopy-review.[5]C. Lee等人，单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）秀丽隐杆线虫，生物协议7（2017）。[6]C. Lee，E. B.索伦森，T.R.林奇，J.C. Kimble，Elegans GLP-1/Notch在整个生殖系干细胞库中以概率梯度激活转录，ELife5（2016）e18370。N.S. 约翰，文学硕士Urman和C.李软件影响11（2022）1001993[7]克里滕登湾L.，例如，生态位结构的性二态性和秀丽隐杆线虫生殖系干细胞库的调节，MBoC 30（2019）1757-1769。[8]C.李，S.E. Roberts，A.S. Gladfelter，使用单分子FISH对多核细胞中的转录物进行定量空间分析，方法（2016）http://dx.doi。org/10.1016/j.ymeth.2015.12.007。[9]C. Lee，P. Occhipinti，A.S. Gladfelter，PolyQ依赖的RNA-蛋白质组装控制对称性破坏，J. Cell Biol. 208（2015）533[10] C. Lee等人，蛋白质聚集行为调节细胞周期蛋白转录本定位和细胞周期控制，开发。Cell 25（2013）572-584.[11] C. Lee ， H. 申 杰 Kimble ， Dynamics of notch-dependent transcriptionalburstingin its native context. Cell 50（2019）426[12] J.Falo-Sanjuan，N.C. H.G.拉默斯Garcia，S.J. Bray，Enhancer primingenablesfast and sustained transcriptional responses to notch signaling，Dev.Cell 50（2019）411 -425，e8.