医学信息学解锁22（2021）100500圣路易斯脑炎病毒多表位疫苗马里兰州Shakhawat Hossaina，Mohammad Imran Hossan b，Shagufta Mizan a，AbuTayab Moin a， Farhana Yasmina，Al-Shahriar Akash a，Shams Nur Powshi a，A.KRafeul Hasan c，Afrin Sultana Chowdhuryb，*a吉大港大学遗传工程和生物技术系，吉大港，4331，孟加拉国bNoakhali科技大学生物技术和遗传工程系，Noakhali，3814，孟加拉国c达卡大学遗传工程和生物技术系，达卡，1000，孟加拉国A R T I C L EI N FO保留字：脑炎多表位疫苗细胞免疫体液免疫信息学A B S T R A C T圣路易斯脑炎病毒（SLEV）是一种罕见的，称为脑炎的脑组织炎症性疾病的原因之一。属于黄病毒科，SLEV可对中枢神经系统造成严重、有害的损伤，使其永久受损。本研究旨在设计和提出一种多表位疫苗候选物，用于预防SLEV相关的神经系统疾病。在这项研究中，我们使用计算机模拟的方法来预测有效的抗原表位的SLEV包膜蛋白，通过使用多个免疫信息学和生物信息学数据库。我们从SLEV的靶包膜蛋白中筛选出13个表位，通过评估它们通过T和B淋巴细胞介导的应答引发先天性和获得性免疫的潜力。由于SLEV是一种RNA病毒，考虑到表位的保守性，发现所选表位是100%保守的。最终的多表位疫苗亚单位表现出0.6797的抗原评分多表位疫苗构建体的分子对接是用Toll样受体4（TLR 4）蛋白，发现最佳模型的能量评分为-1092.3。EX压在大肠杆菌的pET-28 a（+）质粒载体中检测多表位疫苗构建体的能力（菌株-K12）。尽管本研究中使用的计算测定返回了合理的结果，但需要通过体外和体内实验进一步验证拟定的候选疫苗，以评价其临床有效性。1. 介绍圣路易斯脑炎病毒（SLEV）是属于黄病毒科的B组虫媒病毒，是人类圣路易斯脑炎的病原体[1]。 尽管家禽和野生鸟类都是SLEV的宿主，但它可以通过库蚊属的嗜鸟蚊子传播给人类。咬一口[2]。SLEV与墨累谷脑炎、日本脑炎和西尼罗河病毒等同一科的流行病毒有着密切的系统发育关系[3]，其地理分布遍及加拿大、阿根廷、北美西海岸和东海岸以及加勒比群岛，尽管美国的流行率更高。国家[4虽然SLEV的人传人的情况还没有据观察，通过SLEV感染的输血被动传播可能是可能的[7]。SLEV有神经系统疾病的表现，主要与中枢神经系统有关。然而，类似于其其他黄病毒科亲属，确切的病理生理学尚待探索[8]。从SLEV病因学上可以观察到三种证候，按严重程度的下降顺序为：1。脑炎（包括脑膜脑炎和脑脊髓炎）; 2）无菌性脑膜炎; 3）发热性头痛伴发热，无CNS疾病[9]。总的来说，SLEV相关综合征的病死率为5%至20%，在共病、免疫共病和非免疫共病患者中更高75岁或以上的成年人[9黄病毒科病毒粒子通常是单链RNA类型，球形，并被衣壳（C）、膜蛋白（M）和包膜蛋白（E）包围。7非结构性* 通讯作者。电子邮件地址：afrin.bge@nstu.edu.bd，afringeb23@gmail.com（A.S.Chowdhury）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100500接收日期：2020年10月25日;接收日期：2020年12月9日;接受日期：2020年12月9日2020年12月13日在线提供2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊首页：http://www.elsevier.com/locate/imu医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005002在感染的细胞中也发现了这些蛋白，即NS1、NSBA、NSBB、NS3、NS4A、NS4B和NS5。虽然非结构蛋白在病毒复制、装配和信号转导中发挥作用，但增强蛋白表现出更多病理生理学倾向的功能，如红细胞的血凝、受体粘附和pH依赖性融合活性介导，最重要的是，在宿主中触发体液应答[3，12，13]。由SLEV引起的最后一次记录的流行病可以追溯到1933年，其中201例死亡和1095例临床人类病例[14]。因为先前 获得 数据 具有 证实 SLEV的 定位 在美国和其他美洲国家，它不被认为是一个主要的全球威胁。然而，在过去20年中，人畜共患病和虫媒病毒疾病在全世界的出现和重新出现，是一个需要谨慎对待的问题，因为我们仍然没有足够的能力，针对许多病原体的适当和具体的治疗和预防选择[15]。为了减少意外流行病和大流行病造成的伤亡，事先制定治疗措施是非常重要的，而不管某些微生物可能成为潜在威胁的事实。在疫苗开发方面，表位疫苗由于其诱导延长的抗原特异性免疫应答的能力以及成本效益而引起了相当大的兴趣[16]。如前所述，由于目前没有药物或疫苗可用于治疗或预防SLEV相关综合征，本研究的目的是通过利用可用的计算免疫信息学工具预测包膜蛋白特异性的T细胞和B细胞表位，以便通过计算机设计多表位疫苗，因为这些肽序列已被发现能够诱导免疫原性Fig. 1. 描述表位管理和多表位疫苗设计所遵循的程序的流程图。每一种颜色都代表一个人 步骤，相同颜色的框统称为同一步骤。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005003响应（L [17，18]。到目前为止，对于几种疾病，如利什曼病、霍乱、登革热和不同类型的癌症，多表位疫苗候选物已被原型化，并报道了在治疗中的功效。螺杆菌、血吸虫和癌症[19多表位疫苗构建体可以使用不同类型的抗原肽来设计，其刺激非常特异性的免疫应答。因此，可以排除不必要的病理情况的可能性[21，23在这项研究中，我们的目的是设计一个多表位疫苗模型，针对SLEV使用免疫信息学方法在计算机上，因为多表位疫苗比经典疫苗具有优势， 和 单个 表位 疫苗 由于 到 他们的 易感性通过各种主要组织相容性复合物（MHC）类分子以及它们的不同超型的识别[28]。虽然先前的计算机模拟研究已经显示了SLEV包膜蛋白的表位疫苗构建体的鉴定和构建[30]，但我们的研究已经采取了预测包膜蛋白上的多个抗原区段的途径，以巩固更扩增和更强大的先天免疫应答[31]。2. 方法和材料&2.1. 蛋白质序列检索我们的多步骤工作流程（图1）的第一步是检索包膜蛋白的序列。SLEV包膜蛋白（外膜蛋白）的序列以FASTA格式（ID：P09732）从UniProtKB（https：www.uniprot.org/help/uniprotkb）数据库检索。UniProtKB是一个很好的蛋白质序列数据源，它提供了高精度和良好的注释数据。2.2. 抗原性和跨膜拓扑预测用 Vaxijen2.0 抗 原 预 测 服 务 器 （ http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）检测蛋白质的抗原性。该服务器专注于独立预测和自互协方差（ACC）变换，可保持预测精度，准确度为70TMHMM服务器2.0用于检查蛋白质的跨膜拓扑结构，以区分膜和可溶性部分[33]。2.3. 表位预测评估2.3.1. CTL表位在NetCTL 1.2服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）的帮助下，预测了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别包膜蛋白的表位。该服务器通过结合蛋白酶体切割预测、TAP的运输能力和与MHC I类的亲和力来预测表位[34]。于2020年7月27日使用免疫表位数据库（IEDB）分析资源NetMHCpan（v4.0）工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.0/）[35]对12种可用的人白细胞抗原（HLA）超型中的每一种进行了主要组织相容性复合物I类（MHC-I）结合预测。 阈值设定为0.005。的每个周期预测返回300选择转运和MHC-I结合效率。使用Vaxijen 2.0再次计算每个表位的抗原性。为了检查过敏原性和toX icity，分别使用了另外两个在线服务器-AllerTOP v2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）[36]和ToXinPred （ https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toX inpred/protein.php ）[37]，其中所有参数均保持默认。Aller- TOP v2.0使用氨基酸E-描述符、自动和2.3.2. HTL表位使用IEDB分析资源共识工具（http://tools.iedb. 预测了MHC-II辅助T淋巴细胞（HTL）表位的结合亲和力[38，39]。从这些表位，干扰素-γ诱导（IFN-γ）表位，然后分离的帮助下，IFNe-pitope服务器（http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/predict.php）[40]。通过使用IL4pred（ https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il4pred/predict.php） [41] 和IL10pred（https://webs.iiitd.edu. in/raghava/il10pred/pred3.php）[42]服务器分别与所有默认参数。此外，使用Vaxijen 2.0 [32]、AllerTOPv2.0 [36]和ToX inPred [37]工具过滤表位，以依次选择抗原性、非过敏性和非过敏性表位。2.3.3. LBL表位线性B淋巴细胞（LBL）表位通过IEDB B细胞表位预测工具使用Kolaskar和Tongaonkar抗原性量表[43]、Emini表面可及性预测[44]和Bepipred线性表位预测[45]方法进行抗原性、变应原性和ToX性的计数与之前相似，分别使用Vaxijen 2.0 [32]、AllerTOP v2.0 [36]和ToX inPred [37]2.3.4. 表位保护性分析使用IEDB资源（http://tools.iedb.org/conservancy/）计算匹配蛋白质序列的百分比，用于表位保护，同一性水平为100%[46]。2.3.5. 人口覆盖率分析在IEDB群体覆盖率分析服务器（http://tools.iedb.org/population/）中找到。IEDB服务器的人口覆盖工具通过以下方式概述了表位的地理跨度：计算居住在特定区域的可能对所选表位产生免疫应答的人的总百分比[47]。2.4. 选择表位的肽模拟使 用 PEP-FOLD 3.0 [48] 服 务 器 （ https://mobyle.rpbs. univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3） ， 使 用 200 次 模 拟 用sOPEP分选方案对所选CTL表位进行建模。使用Auto- dock工具[49]和AutodockVina软件[116]进行对接仿真分析。在CTL表位的情况下，最保守的等位基因HLA-B*58：01的晶体结构(PDB ID ： 5IM7 ） 已 经 以 PDB 格 式 从 RCSB 蛋 白 质 数 据 库 [50]（https://www.rcsb.org/）检索。HLA-A*24：02精简结构。然后使用CASTp3.0[51]工具（http://sts.bioe.uic.edu/castp/calculation.html）找出HLA-B*58：01结合口袋和表位可以结合的活性位点残基。为了找出HLA-B*58：01与表位的结合沟处的结合能，将X轴、Y轴和Z轴上的网格中心分别设定为16.827482、29.958059和31.707576 nm。在X、Y和Z维度上，网格大小分别设置为10、122和126 mm，这些分析在1.0 mm间距参数下进行。最后，利用AutoDockVina软件进行了对接仿真研究使用PyMOL [52] 分 子 图 形 系 统 制 备 对 接 的 复 合 物 ， 并 使 用DiscoveryStudio 2017可视化对接的复合物。2.5. 多表位疫苗为了预测由所选表位产生的氨基酸序列的基于肽的佐剂，VaxinPad（https://webs.iiitd.edu.in/ra互协方差转型[三十六]而ToX inPred，使用ghava/vaxinpad/batch. php）[53]。VaxinPad，一种混合型不同的肽性质，预测肽的X性[37]。使用基于序列的特征组合开发的模型医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005004=++（二肽组成和基序频率）的准确度最高， 95.71%， 马修斯相关系数（MCC）值0.91在源自实验验证的表位的训练数据集上，所述表位可以激活抗原呈递细胞（APC）[53]。在选择调节剂时，考虑了亲水性、疏水性、根据变应原性和抗原性，选择CTL、HTL和添加LBL表位以使用EAAAK、GPGPG、AAY肽接头形成融合肽[54通过Vaxijen 2.0 server [32]和AllerTop2.0 [36]评价构建疫苗的抗原性和变应原性。2.6. 疫苗构建体的理化评价通 过 E x pasy 服 务 器 的 ProtParam 工 具 [57] （ https ： //web.expasy.org/protparam/）上提供。ProtParam计算蛋白质的几个化学和物理特性，如分子量，氨基酸数，脂肪族和不稳定指数，理论等电点，体外和体内半衰期，总平均疏水性（GRAVY）等。2.6.1. 二级-三级结构预测PSIPRED v4.01 （ http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ ） [58] 和RaptorX-Property（http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/predict/）[59]用于预测拟定疫苗的二级结构并展示其图形表示。PSIPRED是一种高度准确的预测二级结构工具，是一种基于序列概况的折叠识别系统[58]。另一方面，RaptorX-Property使用强大的DeepCNF（深度卷积神经场）内部深度学习模型来预测二级结构，溶剂可及性和无序区域（DISO）[59]。接下来，使用Iterative Threading ASSEmblyRefinement分析三级结构（I-TASSER）同源性 建模 工具（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/），旨在满足用户需求并提高建模预测精度[60-62 ]。 I-TASSER最初从几个线程生成三维（3D）原子模型从氨基酸序列开始的比对和迭代结构组装模拟然后通过将3D模型与其他公认的蛋白质进行结构比较来推断蛋白质结构[60]。尽管计算机模拟方法降低了复杂湿实验室技术的成本和适应性，但预测算法存在一些局限性。由于不同软件的算法存在差异，预测过程缺乏一致性此外，在模型预测方面，由于同源建模和线程识别方法主要依赖于基于模板的类比，适当的模板的不可用性可能会导致具有相当意外的结构域和功能的新蛋白质的扭曲模型。因此，蛋白质的计算机建模需要更深入的研究来改进建模方法[63，64]。2.6.2. 疫苗验证基 于 参 考 3D 蛋 白 质 模 型 ， 通 过 具 有 高 分 辨 率 3DRefine 服 务 器（ http ： //www.example.com ） [ 65 ] 、 GalaxyRefine （ http ：//gawww.example.com）的蛋白质结构细化工具，在原子水平上对所生成的疫苗3D模型进行细化sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/laxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?类型REFINE）[66]、ProSA网络服务器（https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）[67]和Swiss-Model工作空间（https://swissmodel.expasy.org/interactive）[68]。3Drefine网络服务器允许通过提交文本或文件数据方便地细化蛋白质结构[65]，而GalaxyRefine首先重建侧链并重新包装侧链，然后通过分子动力学模拟放松整体结构[66]。此外，ProSA-web还满足了验证从X射线分析、NMR分析光谱和理论计算[67]，而Swiss-Model工作区帮助并指导用户创建不同复杂 程 度 的 蛋 白 质 同 源 性 模 型 [68] 。 此 外 ， 使 用 ERRAT（https://servicesn.mbi.ucla.edu/ERRAT/）工具评估我们预测的三级结构的质量，该工具通过检查蛋白质中不同原子类型的非键合原子相互作用来分配质量因子值，保持默认参数[69]。2.7. 表位作图在疫苗构建体中，使用IEDB分析资源（http://tools.iedb.org/ellipro/）使用默认参数对B细胞表位进行作图，所述默认参数基于柔性和溶剂可及性预测表位[70]。2.8. 疫苗构建体为 了 增 加 稳 定 性 和 构 象 熵 下 降 ， 通 过 Design 2.0 （ DbD2 ）（http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php）通过二硫化物运行经验证的3D疫苗DbD2是一个基于Web的、独立于平台的框架，显著扩展了可访问性、可视化和分析功能[71]。2.9. 密码子适应和计算机克隆使用Java密码子适应工具（JCat）（http://www.jcat.de/）进行密码子适应，以在重组质粒中表达疫苗肽E. coliK12 菌 株 [72] 。 再 次 通 过 密 码 子 适 应 指 数 （ CAI ）（www.example.com）过滤优化的密码子https://www.biologicscorp。com/tools/CAICalculator/#.X0QDdMgzbIU）和用于表达目的的GC含量 的 百 分 比 。 使 用 SnapGene 软 件 （ 来 自 GSL Biotech; 可 在snapgene.com）用载体E模拟计算机克隆。coli K12菌株。选择由6X多组氨酸标签组成的细菌卡那霉素抗性表达载体pET-28 a（）进行计算机克隆模拟[73]。使用SnapGene 4.2软件（来自GSL Biotech;可在snapgene.com获得），进行了适应的密码子序列和pET-28 a（）表达载体之间的计算机限制性克隆的模拟[74，75]。2.10. 疫苗与TLR4受体的分子对接选 择 Toll 样 受 体 4 （ TLR4 ） 作 为 受 体 ， 并 从 RCSB PDB 数 据 库（https://www.rcsb.org/）（PDB ID：4G8A）中找到[50]，而疫苗模型用作配体。然后，使用ESPR1Pro2.0服务器（https://cluspro.bu.edu/login.php），通过分子对接鉴定多表位疫苗与TLR4受体之间的结合因子。服务器采用三个连续的步骤进行工作，例如刚体对接、最低能量结构的聚类和通过能量最小化的结构细化。基于最低能量评分和对接效率，提名了最佳对接复合物[76]。2.11. 疫苗-TLR 4复合物的分子动力学模拟分子动力学模拟研究仅针对含有在先前步骤中选择的最佳疫苗构建 体 的 复 合 物 （ 疫 苗 -TLR 4 ）在 线 服 务 器 iMODS（http://imods.chaconlab. org/）[77]用于分子动力学模拟，以评估和测量蛋白质的柔性。该工具预测各种动态参数，即，变形性、B因子（迁移率曲线）、个体值、方差、协方差图和蛋白质复合物弹性网络。2.12. 计算机模拟免疫反应使用C-ImmSim医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005005=服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/C-ImmSim-10.1/）来评估设计的嵌合疫苗在现实生活中的免疫原性概况[78]。第1次给药和第2次给药之间的最低推荐间隔为4周[79]。因此，在1、84和170个时间步（每个时间步相当于现实生活中的8小时，时间步1是在时间0注射）四周后施用3次注射，每次包含1000种疫苗蛋白（在C-ImmSim免疫模拟器中设定参数），总共1050个模拟阶段。所有其他模拟参数均保持默认值。3. 结果3.1. 蛋白质抗原性和跨膜拓扑预测在运行包膜蛋白时获得的抗原评分经Vaxijen 2.0服务器比对，其同源性为0.6368，表明该蛋白具有较好的免疫原性。使用TMHMM server 2.0跨膜拓扑预测工具预测所选包膜蛋白存在两个跨膜螺旋。3.2. T细胞表位预测CTL能够区分宿主特异性的内源性和外源性蛋白质。所有有核细胞都含有MHC-I分子，其通过鉴定表现出称为表位的抗原特性的外源蛋白的小肽片段来促进CTL的这种区分过程。因此，为了更好地标记致病蛋白，预测可被MHC-I分子检测到的表位是至关重要的[80，81]。从NetCTL 1.2服务器对MHC-I表位的预测中选择总共55个表位序列，进一步对其进行抗原性筛选3.3. B细胞表位预测为了从选择的包膜蛋白候选物预测LBL表位，使用IEDB B细胞表位预测工具，并且从预测结果选择的基准包括抗原性和表面可及性。基于Kolaskar和Tongaonkar抗原性量表，在抗原性评分方面，位于218-237的20-mer肽根据Emini地表可达性量表进行的预测表明，发现细胞表面上的可接近肽位于70和90之间，具有大于5的表面可接近性分数（补充表3）。为了使误差最小化，将Bepipred用于LBL表位预测的另一个循环（补充表4）。从合并的结果中，获得了45个总肽片段，从中排除了5个具有5个或少于5个氨基酸残基的片段。相应地在Vaxijen 2.0、AllerTOP v2.0和ToX inPred的帮助下仔细检查剩余的40个表位候选物的 变 应 原 性 、 ToX 性 、 抗 原 性 以 及 保 护 性 。 6 个 表 位 ：PWTSPATTDWRNRET 、 LQYTGS 、 FHDLNLPWTSPATTDWRNRE 、IDLV-选择表现出抗原性但不具有过敏性或对XIC特性且具有100%保护性的LEGGSCVTVM、GTVIVELQ和PCRVPISVTA（图1B）。 （补充表5）。3.4. 人口覆盖率分析对于所选择的7个总T细胞表位，发现全球人群覆盖率为99.97%，并且在美国，该分数为100%。预测显示，在欧洲部分地区，如俄罗斯，使用Vaxijen 2.0进行毒性、变应原性和保护性分析瑞典、 意大利和 西班牙 和 一 类似 范围为 发现亚洲AllerTOP v2.0和ToX inPred。共4个表位：巴基斯坦、泰国和中国等国家（补充图1）。RSGINTEDY，LTLQSGHLK，VPISVTANL和MEATELATV，从全部预测的55个表位（补充表1）中选择表现出抗原性以及不具有过敏性或对XIC性状的表位（表1）。在选择表位时，还考虑了包括蛋白酶体切割、TAP转运和MHC-I结合效率的组合评分，因为涉及这3个因素的较高组合评分指示较高的成功免疫应答率，因为在抗原蛋白消化成较小肽后诱发总体应答（通过蛋白酶体复合物进行），MHC-I分子识别和结合肽片段，TAP将MHC-I-肽复合物转运至内质网（转运相关蛋白），最后，暴露与质膜上的MHC-I结合的肽。从基于百分位排序的预测中检索总共28个MHC-II表位，并进一步评估变应原性、致敏性和抗原性，它们诱导IFN-γ、IFN A-γ-4和IL-10的 能 力 以 及 保 护 性 （ 补 充 表 2 ） 。 共3表 位 ：GALLLWMGLQARDRS，LGALLWMGLQARDR和发现WLVNRD WFHDLNLPW具有抗原性，没有痕量的表2预测的B细胞表位（基于Kolaskar和Tongaonkar抗原性量表[阈值-1.024]）。号起始和结束肽长度121 34 IDLVLEGGSCVTVM 14253 63拉脱维亚11368 74 LSTVARC 7488 96 PTFVCKRDV 95 114 119 DTCAKF 66 137 145 YEVAIFVHG 97 170 175 SPQAPS8 201 206 YYVFTV 69249 256 KQTVVALG 810263 295 HTALAGAIPATVSSSTLTLQSGHLKCRAKLDKV 3311321 328 GTVIVELQ 812335 344 PCRVPISVTA 1013349 361 LTPVGRLVTVNPF 134个选择的SLEV包膜蛋白的MHC-I表位。评分致敏性和抗毒性，保存率100%。1415372381378388MIEVEPPDSYIVVGR7816417423RLAVLGD717439448GKAVHQVFGG1018462473QGLLGALLLWMG12表1没有表位组合开始端抗原性同一性≤100%的蛋白质序列匹配百分比变应原性致xicity1RSGINTEDY1.8627-E193301一100.00%（36/36）NANT2LTLQSGHLK1.2859-E279187一100.00%（36/36）NANT3VPISVTANL1.3638-E338346一100.00%（36/36）NANT4MEATELATV1.12944856一100.00%（36/36）NANT医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005006-++-图二. B细胞表位预测：a）基于Kolaskar Tongaonkar抗原性量表（阈值-1.024）; b）Emini表面可及性量表（阈值&3.5. CTL（MHC-I）表位的分子对接模拟对筛选出的4个CTL表位进行建模，并与MHC-I分子的常见等位基因进行分子对接模拟研究。生成每个表位的9个结合模型，并根据其氢键数和结合能选择最佳结合模型（补充表6）。最佳模型及其结合能和相互作用残基如图3所示。对表位RSGINTEDY的预测给出了最好的结果，因为它在结合能方面表现出最低值（7.5 kcal/mol）和最高的氢键数，这表明RSGINTEDY与MHC-I分子具有稳定和高的结合亲和力。3.6. 多表位疫苗构建多表位疫苗构建体是融合肽，并且使用AAY、KK和GPGPG接头将7个T细胞（4个MHC-I和3个MHC-II表位）和6个线性B细胞表位组合而产生。为了触发抗原特异性免疫应答，在疫苗构建体的N-末端使用EAAAK添加TLR 4激动剂50 S核糖体L7/L12蛋白（UniProtKB ID：P9 WHE 3）作为佐剂（图4）。最终疫苗构建体的氨基酸残基计数为384。3.7. 疫苗构建体的抗原性和变应原性评估为了验证疫苗构建体是否具有方便的抗原潜力并且没有任何过敏性和 抗 XIC 特 性 ， 使 疫 苗 构 建 体 经 受 Vaxijen 2.0 、 AllerTOP v2.0 和TOXinPred。结果确定疫苗构建体为无致敏性的非过敏原。发现疫苗构建体具有0.6797的抗原评分，其将疫苗构建体标记为可能的抗原。3.8. 疫苗亚单位预测最终疫苗亚单位的分子量为40.8 kDa，理论pI为9.01。带正电荷的氨基酸残基（Arg）的总数 Lys）被预测为 50，而发现带负电荷的氨基酸残基（Asp Glu）的总数为44。大于7的pI和过量的带正电荷的氨基酸残基表明疫苗构建体本质上是碱性的。疫苗构建体在哺乳动物网织红细胞中的估计半衰期预测为1小时，对于酵母和E. 大肠杆菌（体内）半衰期预测为30 min和>10 h。预测不稳定指数（II）为30.74，蛋白作为稳定（二） 评分 >40个指导不稳定性）。89.90的脂肪族指数表明疫苗构建体的热稳定性[82]。GRAVY评分为0.076;负值表明疫苗构建体是亲水性的[73]。3.8.1. 二级结构RaptorX Property预测融合肽由27%的α-螺旋、30%的β-折叠和41%的卷曲组成（图5b）。在组成氨基酸残基的溶剂可及性方面，预测46%的残留物暴露，28%为中度暴露，25%被掩埋。PSIPRED的二级结构的视觉表示已显示在图中。 5点3.8.2. 三级结构3.8.2.1. 建模 基于 对 10 螺纹 模板， I-TASSER前-口述并呈现疫苗构建体的5个3D模型。所有10个穿线模板的Z分数在1.18-5.46的范围内，因此，证明了良好对齐的标准。5个模型的C值在-2.55到2.44之间。最高的模型医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005007图三. 分子对接模拟结果显示HLA-B：58：01为表面，CTL表位为粘性形式。a）HLA-B*58：01和RSGINTEDY，b）HLA-B*58：01c）HLA-B*58：01和VPISVTANL d）HLA-B *58：01和MEATELATV。见图4。 疫苗构建体的示意图。选择C值（2.44）用于进一步结构细化（柔顺剂，图2a）。3.8.2.2. 精炼。使用3Drefine和GalaxyRefine对疫苗亚单位的选定3D结构进行进一步细化，返回5个提议的细化结构。模型4表现出相对较好的Rama偏好区域（90.4）和总体可接受的GDT-HA（0.9974）、RMSD（0.243）和MolProbity（2.397）评分，因此选择了模型4以在池中进行进一步验证（补充图2b）。3.8.2.3. 验证。生成疫苗亚基的Ramachandran图，其显示90.31%的氨基酸残基位于有利区域，这与Galax-yRefine的预测一致（图6）。除此之外，Ramachandran图分析还预测，在允许和不允许的区域内，只有1.83%的残留物是离群值。使用瑞士模式医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005008--+-+图五. 拟定疫苗构建体的预测二级构象：a）PSIPRED预测二级结构分布的视觉表示; b）RaptorX Property预测的最终疫苗构建体二级结构的图形表示特征。疫苗构建体包含41%螺旋、27% α-螺旋和30% β-折叠。见图6。所提出的疫苗构建体的Ramachandran图，显示氨基酸残基在不同区域中的分布。在交互式工作空间中，发现疫苗构建体的QMEAN得分为7.68。ProsAWeb服务器预测Z得分为2.72。（图7a和b）。由ERRAT产生的高品质因数质量模型>50 [83]，我们模型的质量因子为56.30（图 7 c）。3.9. B细胞表位定位由于B细胞主要有助于增强体液免疫，因此评估我们的疫苗构建体是否具有足够的表位与互补位结合以触发适当的免疫应答是必要的。ElliPro：IEDB服务器的抗体表位预测工具用于B细胞表位预测以构建疫苗。预测总共13个表位具有不同的长度，其中9个表位是线性的（补充图3a-i），4个是构象的（补充图3 j-m）。3.10. 疫苗构建体根据对疫苗构建体进行从头二硫化物工程改造后返回的结果（补充表7），我们认为该模型具有小于2.2的能量评分和97至87之间的卡方3值。考虑到参数，产生了单个突变对，即ILE 80-LYS 150（补充图4）。JCat用于相对于大肠杆菌优化最终疫苗构建体的密码子使用。coli（菌株K12）中表达。优化序列的长度为1152，密码子适应指数为1.00。优化序列具有平均50.73%GC含量，这确立了疫苗构建体在E. coli宿主。使用SnapGene软件，将疫苗构建体的适应性密码子序列插入到质粒中。 pET-28a（）质粒 向量 和 的 重组 质粒设计（图8）。还添加了6XHis标签，以便于通过免疫色谱测定法快速检测重组疫苗[114]。克隆的总长度为6.4kb。医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）1005009-见图7。疫苗构建体的验证：a）通过Swiss-Model工作区进行QMEAN评分预测和比较; b）通过ProsA web进行Z评分预测; c）通过ERRAT进行总体质量因子预测。X轴表示残基，Y轴表示误差值。Y轴中的两条线表示置信度，超过该误差值的区域表示较低的质量。3.11. 疫苗构建体与TLR4的对于疫苗-TLR 4复合物，通过ESPRINPro 2.0共生产了30个模型，这些模型的能量评分见补充表8。在这30个预测的模型中，模型编号14由于具有1092.3的能量分数而被认为是最佳对接复合物，其是所产生的模型中的最低能量分数，表现出疫苗构建体与TLR 4跨膜蛋白之间的最大结合亲和力和相互作用（补充图5）。3.12. 疫苗-TLR 4复合物的分子对接模拟具有可变形性的蛋白质区域由疫苗-TLR 4复合物的可变形性图（图9a）中的峰指示。复合物的B因子图提供了对对接复合物的NMA和PDB场之间的分歧的直观理解（图9b）。图9c中描绘了复合物的本征值的曲线图。特征值越高，复形的稳定性越高。疫苗-受体复合物的特征值为1.268749e- 05，其表示蛋白质的硬度的方差和医学博士Hossain等人医学信息学解锁22（2021）10050010++见图8。pET-28 a（+）质粒载体中疫苗亚基的电子克隆。蓝色突出显示的区域代表优化的疫苗序列。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版协方差图在图9d和e中示出，并且该复合物具有大量的缔合氨基酸（以红色标记），并且还示出了大量的刚性区域（以深灰色标记）。原子之间的连接由弹性图表示，其中较暗的灰色区域指定刚性区域（图1）。9 f）。3.13. 计算机模拟免疫反应从C-ImmSim服务器的计算机模拟免疫应答中可以明显看出，与初次应答相比，二次应答和三次应答明显更大。大量的免疫球蛋白作用（即， IgG1 IgG2、IgM和IgG在第二和第三应答的情况下，标记了IgM抗体（图10a），并伴随抗原浓度的相关降低。此外，还发现了许多具有长期活性的B细胞同种型，这表明可能的同种型转换能力和记忆结构（图10b和c）。在T辅助性（Th）和细胞毒性T（CT）细胞群中观察到同样升高的应答，记忆形成（图10 d-f），这是补充免疫应答所必需的。 此外，巨噬细胞活性增强，观察到，同时树突细胞活性获得稳定（图1B）。 10 g和h）。此外，还观察到高水平的IFN-γ和IL-2，并且较低的Simpson指数（D）指示更大的多样性（图11）。 10 i）。4. 讨论自古以来，传染病就以急性、慢性和致命的方式侵袭人类。虽然对于许多复杂的传染病存在多种治疗措施，并且正在开发用于多种其他疾病，但是存在许多微生物来源的疾病，而没有任何授权的药物或疫苗。鉴于严重急性呼吸系统综合征（SARS），中东呼吸综合征（MERS）和冠状病毒病（COVID-19）爆发的情况，很明显，RNA病毒完全能够通过其基因组中的突变适应新的生态位，在大多数情况下，这将对我们有害。当处理能够进行促进性突变和随后的人畜共患病的病毒和细菌时，训练适应性免疫系统以触发对不同靶点的独特和特异性反应是至关重要的，疫苗对此没有匹配[84，85]。最近，用多个表位构建的嵌合疫苗已经成为感兴趣的领域，因为它们能够放大针对病原体的免疫应答[86]。尽管SLEV可与损害中枢神经系统的综合征相关，但该病毒在治疗药物、药物或疫苗的开发方面尚未获得太多关注[87]。在这项研究中，我们针对包膜蛋白预测保守的抗原肽序列，设计一个多表位疫苗对SLEV。在之前的一项研究中，医学博士Hossai
我的内容管理
展开
