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第 32 卷第 2 期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2010 年 2 月
Vol畅32 No畅2 Journal of Southw est University (Natural Science Edition) Feb畅 2010
文章编号 :1673 9868(2010)02 0052 04
羊 附 红 细 胞 体 PCR 诊 断 方 法 的 建 立 及 应 用
①
周作勇
1
, 聂 奎
2
, 周荣琼
1
, 刘凤英
1
, 陈艳灵
1
1畅 西南大学 荣昌校区动物医学系 ,重庆 荣昌 402460 ;2畅 西南大学 动物科技学院 ,重庆 400716
摘要 :根据羊附红细胞体 16S rRNA 基因序列设计特异性引物 ,建立了羊附红细胞体的 PCR 诊断方法 .该方法能
扩增羊附红细胞体 16S rRNA 基因片段 ,对大肠杆菌 、 羊无形体 、 羊源支原体 、猪附红体和假单孢菌基因组 DNA
没有扩增出条带 ,所能检测羊附红细胞体 DNA 的最低量为 1畅82
pg
/mL .运用所建立的方法对从重庆市荣昌县采
集的 110 份羊血样进行附红细胞体检测 ,其中 13 份羊附红体感染阳性 ,表明该方法特异性和灵敏度高 ,可用于急
性羊附红细胞体病和临床带菌羊的检测 .
关 键 词 : 羊附红细胞体 ;PCR ;检测
中图分类号 :S826 文献标识码 :A
附红细胞体病是由寄生于血液内的原核生物 ——— 附红细胞体引起的 ,以溶血性贫血 、黄疸 、 发热为主
要特征的人畜共患病 ,在我国相继报道发现本病流行的省 、市 、自治区已有 20 多个
[1]
.我国羊附红细胞体
病最早报道于 1982 年 ,近年来该病的发生和报道日渐增多 ,给我国养羊业造成一定的损失
[2 3]
.在羊附红
细胞体病诊断及附红细胞体感染的检测方法中 ,常用的血液涂片和染色镜检特异性不高 ,加上染色颗粒沉
着易造成误判 ,出现假阳性
[4 5]
.16S rRNA 已被广泛用于细菌的鉴定研究 ,越来越多的细菌如假单胞菌 、
果胶杆菌等也都依据 16S rRNA 被正确鉴定
[6 8 ]
.因此 ,笔者根据羊附红细胞体 16S rRNA 基因序列设计
特异性引物 ,建立了 PCR 诊断方法 ,并对重庆市荣昌县采集的山羊血样进行检测 .
1 材料与方法
1畅 1 试验材料
Taq DNA 聚合酶 、dN T P 、DNA Mark2000 、PMD18‐T 连接试剂盒均购于 T AKARA 公司 ;Genonmic
DNA Purification Kit 、Gel Extraction Kit 购于 Promega 公司 ;DH5α 购自大连宝生物公司 .大肠杆菌 、羊
无形体 、羊源支原体 、猪附红体和假单孢菌为本研究室保存 .
1畅 2 PCR 检测方法的建立
1畅 2畅 1 引物设计
参考 GenBank 登录的羊附红细胞体 16S rRNA 序列(AF338268) ,利用 Oligo 6畅1 软件设计 1 对特异性
引物 .上游引物 SF (位于基因序列 56 ~ 79 位) :5′‐CGAACGAGT AGAACT TGT TCTGCT‐3′ ,下游引物
SR(位于基因序列 453 ~ 475 位) :5′‐TAGT ACCA TCAAGGCGCGCTCA T‐3′ ,由上海英骏生物技术有限
公司合成 ,预计扩增片段长度为 420 bp .
1畅 2畅 2 羊附红细胞体 DNA 模板的制备
用一次性 10 mL 注射器于羊颈静脉采血 5 ~ 8 mL ,注入加有 1畅 5 mL ACD(柠檬酸钠)抗凝剂灭菌离心
①
收稿日期 : 2009 03 21
基金项目 : 重庆市自然科学基金资助项目 (CS T C ,2006BA1009) .
作者简介 : 周作勇 (1979 ) ,男 ,四川冕宁人 ,讲师 ,博士研究生 ,主要从事动物寄生虫和传染病学研究 .