在X、Y和Z维度上分别将网格大小设置为76、60和86 μ m,以获得
HLA-A*24:02与HLA沟处的表位最后,使用AutoDockVina工具在
0.681 μ m间距参数下进行对接模拟研究为了制备和可视化对接的受
体-表位 复合 物 , 分 别使 用PyMOL [30]分子 图形 系 统 和 Discovery
studio 2017。在RCSB蛋白库中未发现预测HTL表位的两种常见HLA II
类等位基因(HLA-DRB 3 *02:02和HLA-DRB*15:02)的实验验证
晶体结构,因此未进行HTL表位的对接。
2.10.
多表位疫苗
TLR4的表达在感染期间增加,并且TLR4激动剂经常用作基于肽的亚
单位疫苗的一部分[31]。佐剂在增强针对抗原的免疫应答并在各种免疫
机制的帮助下启动特异性、持久的免疫应答方面发挥重要作用[32]。出
于这个原因,从UniProtKB数据库(登录号P9 WHE 3)检索50 S核糖体
蛋白L7/L12(Toll样受体4(TLR 4)激动剂)以用作序列N末端的佐
剂 。 从 RCSB 蛋 白 质 数据 库 中 检 索 另 一 种 蛋 白 质 , 即 人 β- 防 御 素 2
(Accession No.1FD3),并将其添加到疫苗序列的C-末端。两个肽接
头,即GPGPG和AAY,用于分离表位并确保人体内的个体免疫应答。
GPGPG接头用于分别在疫苗序列的N端和C端连接两种佐剂50 S核糖体蛋
白L7/L12和人β-防御素[34]。
2.11.
疫苗构建体
使 用 VaxiJen 2.0 [11] 和 ANTIGENpro
(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)[35]工具评估构建疫苗的抗
原性。通过IEDB免疫原性工具[14]和AllerTOP 2.0 [15]评价免疫原性
和变应原性
构建的疫苗的理化特征,即,使用EXpasy服务器的ProtParam工
具(https://web.expasy.org/protparam/)评价分子量(MW)、脂
肪族指数(AI)、理论等电点(PI)、不稳定指数(II)、亲水性总
平均值(GRAVY)以及体外和体内半衰期[36]。此外,SOLpro工具
(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)
[37]用于预测疫苗蛋白在E.
通过
Protein-Sol(www.example.com)工具
预测并确认https://protein-sol.manchester.ac.uk/了大肠杆菌的蛋白质含量
[38]。
2.12.
预测疫苗
PSIPRED v4.0(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)[39]用于预测
疫苗
具体迭代爆炸)[39]。接下来,我们使用了迭代线程自动化细化(I-
TASSER ) 工 具 ( https://zhanglab.ccmb.med ) 。 umich.edu/I-
TASSER/)[40]来预测我们最终疫苗构建体的3D结构。该工具通过迭
代的基于模板的片段组装模拟生成同源模型[40]。Pymol用于可视化
I-TASSER输出的最佳3D模型
2.13.
疫苗
3D
结构的优化和验证
生 成 的 疫 苗 蛋 白 质 原 始 模 型 首 先 通 过 3Drefine 工 具
(http://sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/)[41]进行优化,该工具通
过 最 小 化 原 子 级 能 量 和 优 化 氢 键 网 络 来 优 化 结 构 。 之 后 , 使 用
GalaxyRefine(http://galaxy.seoklab.org/refine)[42]通过分子动力学模
拟的结构弛豫来细化结构,以改善结构。
平均全局和局部结构质量。因此,将改进后的结构提交给ProSA网站
(https://prosa.services.came.sbg)。ac.at/prosa.php)[43]通过计算整
体质量得分进行结构验证。天然和预测质量评分范围之间的差异是预测
三级结构中可能错误的指示。此外,EXpasy服务器的Swiss模型交互式工
作 空 间 ( swissmodel.expasy.org/assess ) [44] 用 于 结 构 验 证 并 生 成
Ramachandran图。
2.14.
疫苗构建体
为了确认疫苗构建体中线性和构象B细胞表位的存在,使用IEDB服务
器(http://tools.iedb.org/ellipro/)[45]的ElliPro工具和默认参数。
2.15.
最终疫苗构建体
将 改 进 的 疫 苗 结 构 提 交 给 设 计 二 硫 键 ( DbD ) 2.12
(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/)[46]工具,以通过在潜在残
基对之间产生二硫键来增加稳定性基于一组标准,选择潜在的残基对
并用半胱氨酸残基突变[46]。
2.16.
密码子优化、计算机克隆和
mRNA
结构预测
为了保证疫苗蛋白在大肠杆菌中的高效表达
,
coli K12,使用Java密
码 子 适 应 工 具 ( JCAT ) ( www.example.com ) 进 行 密 码 子 适 应
http://www.jcat.de/[47]。在密码子适应过程中,检查三个参数以避免
限制性酶切位点、rho非依赖性转录终止和原核核糖体结合位点。此
外,将EcoRI和BamHI限制性位点分别引入疫苗序列的N和C末端。最
后,在对应于所设计的疫苗构建体的适应的核苷酸序列和对应于所设计
的疫苗构建体的适应的核苷酸序列之间进行克隆模拟。
E. coli pET 28a ( ) 表 达 载 体 , 通 过 使 用 SnapGene 4.2 软 件
(https://www.snapgene.com/)进行。
RNAfold ( http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibi/RNAWebSuite/RNAfold.
cgi)在线工具用于产生mRNA二级结构,
其预测mRNA的结构,并作为最小自由能得分的标志[48然后通过DNA
>
RNA
>
Protein tool
(http://biomodel.uah.es/en/lab/cybertory/analysis/trans.htm)将JCat
工具生成的优化DNA序列转化为RNA序列。 和 提交 到 的 RNA 倍
服务器维护
默认参数。
2.17.
疫苗与
TLR4
受体的
为了检查TLR4(作为受体,PDB ID:4G8A)和设计的多表位疫苗
( 作 为 配 体 ) 之 间 的 结 合 亲 和 力 , 在 HPLCPro 2.0 服 务 器
(cluspro.bu.edu/)的帮助下进行分子对接研究[51]。BMPPro是蛋白质-
蛋白质对接的顶级工具,通过结合三个连续步骤产生结合亲和力:刚体
对接,最低能量结构的聚类和通过能量最小化的结构优化[51]。
2.18.
疫苗稳定性
通过i-MODS工具(http://imods.chaconlab.org)[52]进行分子动力学
模拟,以评估受体-疫苗复合物在生物环境中的稳定性。该工具通过计算
变形性、B因子、特征值、协方差和弹性网络来估计蛋白质-蛋白质复合
物动力学[52]。