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高压下灭菌20min,冷却至60℃时加入100 mL 10 × D。
YPD+Zeocin固体培养基:将酵母提取物、蛋白胨 (终浓度分别为10g/L、20 g/L)溶于蒸
馏水中;加入琼脂(终浓度20 g/L),121℃高温高压下灭菌20min;冷却至60℃时加入经滤膜
过滤灭菌的10 × D和 1/1000总体积的100mg/mL的Zeocin。混匀后,倒入培养皿制成平板。
BMGY培养基:在700 mL dd H2O中溶解10 g酵母提取物、20 g蛋白胨,121℃灭菌20 min。100
温度降至室温时加入1 mol/L磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 100 mL,10 × YNB 100 mL,500×B 2
mL,10×G 100 mL。混匀后4℃保存。
BMMY培养基:在700 mL dd H2O中溶解10 g酵母提取物、20 g蛋白胨,121℃灭菌20 min。
温度降至室温时加入1 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH值8.0) 100 mL,10 × YNB 100 mL,500 ×
B 2 mL,10 × M 100 mL。混匀后4℃保存。 105
其中:500 × B (0.02 % Biotin):称取20 mg 生物素溶解在100 mL dd H
2
O中,过滤
除菌,4℃保存。
10 × YNB (13.4 % Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino Acids):
称取134g YNB(含硫酸铵不含氨基酸)溶解在1000mL dd H
2
O中,在50℃以下溶解,过滤除菌,
4℃保存。 110
10 × D (20 % Dextrose):称取200 g D-glucose溶解在1000 mL dd H2O中,过滤除菌,
4℃保存。
10 × M (5 % Methanol):量取5 mL甲醇加至95 mL dd H
2
O中过滤除菌,4℃保存。
定点突变的引物设计,突变体表达载体的构建和阳性克隆的筛选: 根据重组表达质粒
pPICZα A-axe1 的序列,借助软件Primer Primer5.0 设计筛选引物,突变体名称和引物见115
表1。通过重叠延伸PCR(over-lapping PCR)法得到突变基因,得到的突变基因全长分别在
其5’末端和3’末端加上EcoRI和NotI的酶切位点。突变基因、载体pPICZα A分别进行双酶
切,构建重组酵母表达质粒。使用SacI对上述表达载体进行单酶切线性化,按照Invitrogen
公司的毕赤酵母表达手册,转入
Pichia pastoris
KM71H。将转化的细胞涂布在含
100µg/mLZeocin的YPDSZ平板上,涂布3-5块板,28℃倒置培养2-4天直至菌落出现,挑选阳120
性克隆。
表 1 引物序列
Table 1 Sequences of primes