构建与应用：线性化BmNPV穿梭载体BmBacmid

"一种可线性化BmNPV穿梭载体的构建及应用" 本文主要介绍了一种用于构建家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）表达系统的新型穿梭载体——BmBacmid，该载体具有可线性化的特点，能提高基因表达效率。研究人员通过一系列分子生物学技术步骤，成功地建立了这个系统。 首先，研究人员将mini-F、LacZα-attTn7和Kanr基因的BAC片段整合到pBacPAK8载体中，生成了含有BAC片段的转移载体pBACAvrII2。这个载体的设计是为了实现特定基因的克隆和转移，mini-F是维持BAC稳定性的元件，LacZα-attTn7是转座子插入位点，Kanr则提供了抗生素抗性筛选标记。 接下来，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出包含多角体基因座侧翼序列的BAC片段，两侧的序列能够确保基因插入的精确性。这个PCR产物与线性化的BmBacPAKDNA共同转染家蚕细胞BmN，以产生重组病毒感染。经过筛选和鉴定，获得了含有目标片段的重组病毒DNA。 重组子DNA被导入ElectroMAXDH10B感受态细胞，通过蓝白斑筛选方法选出阳性克隆，进一步验证确认后，得到了BmNPV Bacmid载体（BmBacmid）。BmBacmid的成功构建意味着可以在此基础上进行基因操作，并且它能在家蚕细胞BmN中诱导病变，证明其功能活性。 为了建立BmNPV Bac-to-Bac系统，研究人员将转座辅助质粒pMON7124转化到含BmBacmid的DH10B细胞中。这个系统允许外源基因在病毒DNA和细菌之间穿梭，极大地提高了基因表达的便利性。通过与pFastBac HTB-AcGFP转座重组，研究人员在家蚕BmN细胞中成功表达了绿色荧光蛋白（GFP），验证了系统的有效性和灵活性。 此外，通过AvrII酶切线性化BmBacmid，并与pBacPAK8-AcGFP共转染BmN细胞，同样观察到了GFP的表达，表明这种线性化载体也能有效地进行基因表达。这证明BmBacmid不仅可以用作Bac-to-Bac系统的一部分，还可以作为独立的线性化病毒载体使用，增加了基因工程操作的多样性和实用性。 本研究成功开发了一种新型的BmNPV穿梭载体BmBacmid，它可以用于构建高效、灵活的基因表达系统，对于家蚕生物反应器和生物医药领域具有重要意义。这种载体的构建方法和应用为家蚕病毒表达系统提供了新的思路，有望推动相关领域的科学研究和技术发展。