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基于ddPCR的着丝粒拷贝数变异癌症检测新方法
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更新于2024-06-18
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着丝粒阵列拷贝数变异与癌症不稳定性的PCR检测方法是一种创新的技术,它利用PCR扩增子技术来鉴定人类基因组中着丝粒区域的广泛拷贝数变异。着丝粒,尽管仅占人类基因组的6%,因其高度重复且结构复杂,传统上在测序和分析上存在困难。然而,作为染色体稳定分裂的关键组成部分,着丝粒拷贝数的准确评估对于理解染色体传递的动态和维持基因组稳定性至关重要。 这项研究由Leonardo Gómez-Delima等研究人员开发,他们采用了一种先进的数字液滴PCR (ddPCR) 方法,这是一种高灵敏度的技术,能够精确测量人类着丝粒的拷贝数并提供个体特有的指纹特征。他们首先通过基准测试验证了这一方法的可靠性,确保其在不同人群的正常组织中都能稳定地反映出着丝粒的拷贝数特性。 实验结果显示,在分析原发性人类癌症样本时,他们发现着丝粒拷贝数出现了显著变化,这揭示了癌症过程中新的基因组不稳定性现象。这种变化可能与染色体异常、肿瘤发生和进展有关,因为着丝粒异常可能会导致染色体分离问题,从而影响基因表达和细胞功能。 该研究的重要贡献在于,它不仅提供了对人类着丝粒拷贝数变异的新认识,也为临床癌症诊断和预后提供了潜在的生物标志物。通过这种方法,科研人员可以更深入地了解着丝粒在癌症病理过程中的作用,为进一步的分子靶向治疗和遗传咨询提供依据。 deLima等人在《细胞基因组学》杂志上发表的研究,为我们理解着丝粒在癌症中的关键作用提供了一个强有力的工具,促进了染色体生物学和癌症研究领域的发展。这一突破性的PCR检测方法为未来的个性化医疗和精准医学提供了新的可能性。
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Cell Genomics1,100064,2021年12月8日
3
会
开放获取
技术
A
图
1.
着丝粒阵列的分析
ddPCR
(A)
一个示意性的概述提出了通过ddPCR的着丝粒
阵列尺寸测量工作流程。在GRCh38中鉴定了分析
的每个高阶重复序列(HOR)阵列的独特非重叠
扩增子。通过除以染色体特异性单拷贝基因的拷贝
数来归一化阵列拷贝数值。通过将拷贝数乘以单个
重复的大小来计算阵列大小。
(B)
通过ddPCR一式三份地对CHM13对五个不同
的着丝粒阵列进行拷贝数测量,证明了高重现性。
误差 酒吧 是 计算 关于Taylor
扩展并基于标准devia-
B
每个
重复实验的浓度。
(C)
将源自CHM13 v1.0的计算组装的每个HOR的
拷贝数和以Mb计的阵列
(D)
10个人的独特指纹图谱(A
J)显示。条形表示归一化
的
正常
乳腺组织中5个着丝粒阵列的平均着丝粒阵列
大小(Mb)从10
个体
D
阵染色体可以具有单个阵列或多个阵列,但是只有一个阵列将对
于染色体传递是活跃的。我们设计了针对存在于阵列DXZ 1、
D18 Z1、D11 Z1、D 7Z 2和D 6 Z1中的独特扩增子的PCR引物
(图1A;表S1)。染色体由'' D,''后面的符号指定,数组由后面
的数字指定 Z为了设计引物,我们使用肌肉算法
18
对构成
HOR的每个单体进行多重序列比对并进行成对比较,以发现每
个HOR中的独特区域,并鉴定在hg 38基因组中产生约100 bp扩
增子的17-24 bp引物我们接下来使用University of California,
Santa Crus(UCSC)浏览器(https://genome.ucsc.edu/cgi-
bin/hgPcr)
进行计算机模拟
PCR,以确认扩增子全部来源于具
有靶向HOR的染色体。预测选择用于消化每个扩增子周围的模
板的限制性内切酶切割最小值, 在给定阵列的每个重复中两次
(表S1),确保重复将被分离以分配到液滴中。
除图1中的扩增子外,我们还纳入了先前
发表 的D8Z2 检 测 试 剂的 信 息( 表 S1和
S2)。每个染色体上独特的单拷贝基因
的扩增能够使染色体拷贝数标准化,这对
于癌症样品尤其重要。与多个生物重复测
量相关的误差约为10%(图1B)。基准
测试的DNA模板来自于
CHM13,最新和最完整的单倍体参考基因组。设计和验证准确
反 映 阵 列 大 小 的 引 物 的 能 力 大 大 增 强 最 近 的 着 丝 粒 组 装
(CHM13 v1.0)。然而,我们目前还不能报告万无一失的扩增
子设计原则,需要进行大量的试错和基准测试来开发其他检测方
法。此外,一些染色体具有高度相似的着丝粒阵列,并且可能无
法通过PCR区分(例如,1/5/19、13/21、14/22)。
为了进一步对测定进行基准测试,我们进行了两种类型的分
析。首先,我们比较了DXZ 1在四种不同细胞系(LT690、HAP
1、T6012和CHM13)中从拷贝数计算的大小与通过PFGE估计
的大小在所有4例病例中,两次测量结果一致。
3
LT690中的DXZ
1阵列因其相对于平均值的小尺寸(约1,500 kb)而引人注目,
平均值接近3,000 kb,如1998年首次基于PFGE报道的那样。
20
其次,我们将ddPCR计算的大小与所有五个计算估计的大小进
行了
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