新碱叶酸壳聚糖纳米粒对非小细胞肺癌的治疗作用

埃及基础与应用科学杂志5（2018）87长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒的合成、表征及对非小细胞肺癌Naresh Kumara，Raj Kumar Salara，Mar，Minakshi Prasadb，Koushlesh Ranjanca生物技术系，Chaudhary Devi Lal大学，Sirsa 125055，Haryana，印度b动物生物技术系，Lala Lajpat Rai兽医动物科学大学，Hisar 125001，Haryana，印度cSardar Vallabhbhai Patel农业大学兽医生理学和生物化学系，Meerut，250110，印度北方邦阿提奇莱因福奥文章历史记录：2017年8月14日收到2017年10月31日收到修订版，2017年2017年11月26日在线发布关键词：肿瘤细胞壳聚糖新诺明A B S T R A C T阿贝斯汀用于治疗不同类型的癌症。但是不必要的副作用限制了它们在医学上的应用。为了克服靶向给药的副作用，我们采用离子凝胶法合成了长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒。采用动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜对纳米粒子进行了表征。DLS证实了小尺寸的纳米颗粒（200 nm），而FTIR证实了与合成的纳米颗粒相关的不同官能团。SEM显示球形纳米粒表面光滑，而TEM证实叶酸-壳聚糖结合纳米粒中负载长春新碱。通过MTT法检测载长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒对NCI-H460细胞的抗肿瘤活性，随后检测活性氧水平、线粒体跨膜电位和凋亡形态学变化，证实纳米粒的细胞毒性。红细胞聚集试验证实纳米颗粒无毒性。因此，这些纳米颗粒可用于治疗NCI-H460细胞。©2017 曼 苏 拉 大 学 。 由 爱 思 唯 尔 公 司 制 作 和 主 持 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型，占主要肺癌类型的近85%只有17.3%的NSCLC患者存活5年。NSCLC是一种恶性肿瘤，在美国每年造成的肺癌相关死亡人数超过结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的总和[1]。NSCLC的主要类型化疗、放疗和手术已被用于治疗非小细胞肺癌，但有严重的副作用。自20世纪60年代初以来，阿贝斯汀一直用于临床实践[3，4]。长春新碱用于治疗不同类型的癌症，包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、霍奇金它是一种长春花生物碱，从Mada- gascar periwinkleCatharanthusroseus中获得[6]。然而，多药耐药性、对健康细胞的不良副作用以及对癌细胞的不良利用性限制了其在医学上的应用。在几年内，负载天然和人工聚合物的抗癌药物已经*通讯作者。电子邮件地址：rajsalar@rediffmail.com，rajsalar@cdlu.in（R.K. Salar）。针对癌细胞系进行了测试，以绕过p-糖蛋白受体，这是耐药性的主要原因。在不同的聚合物中，壳聚糖（阳离子多糖）由于其生物利用度、粘膜粘附性、生物相容性、生物降解性、无毒和低免疫原性而在药物和生物医学应用中引起了关注[7 Chitosan由（1？4）通过甲壳质的脱乙酰化获得的连接的D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡糖胺单元，甲壳质是存在于甲壳类动物如蟹和虾的外骨骼中的天然多糖[7]。壳聚糖被认为在脊椎动物中被结肠中的溶菌酶和细菌酶降解[10]。这些特性使壳聚糖成为一种优良的抗癌药物载体。壳聚糖纳米粒可通过配体的修饰而成为肿瘤特异性靶点将靶向配体与壳聚糖结合不会改变其物理化学和生物化学性质[11，12]。与其他靶向配体相比，叶酸更便宜，可以容易地与药物递送载体缀合，并且在加工，储存和应用中更稳定[13]。在这项研究中，长春新碱负载叶酸-壳聚糖缀合纳米粒的合成，通过不同的技术表征，并针对NCI-H460非小细胞肺癌细胞系检查https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2017.11.0022314- 808 X/©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas88N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-99≥2. 材料和方法2.1. 化学品低分子量壳聚糖（75%脱乙酰度）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N-0-二环己基碳二亚胺（DCC）、二甲亚砜（DMSO）、三乙胺、乙酸钠、氢氧化钠、三聚磷酸钠（85%）、乙酸、叶酸、Hoechst33258、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）、二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、罗丹明123（Rh-123）、吖啶橙（AO）、溴化乙锭（EtBr）购自Sigma Aldrich。磷酸盐缓冲盐水（Dulbecco A）、醋酸盐缓冲液（pH 5.6）和RPMI- 1640培养基购自HiMedia Laboratories，India。所有化学品均为分析级。非小细胞肺 癌 细 胞 系 （ NCI-H460 ） 购 自 印 度 浦 那 国 家 细 胞 科 学 中 心（NCCS）。2.2. N-羟基丁二酰亚胺叶酸酯的合成根据先前报道的方法合成叶酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯[14]。制备N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-0-二环己基琥珀酰亚胺的IM溶液。将1.5g叶酸溶于25 ml二甲亚砜（DMSO）中，加入2 ml 1 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）.向该溶液中加入2ml三乙胺，使反应在黑暗中搅拌进行17小时通过125μ m孔径的滤纸除去浅黄色二环己基脲，并用30%丙酮溶液洗涤黄色N-羟基琥珀酰亚胺酯。2.3. 叶酸-壳聚糖偶联物将45 mg量的壳聚糖溶解在烧瓶中的15 ml乙酸盐缓冲液（pH5.6）中，磁力搅拌几分钟。取200 mg N-羟基琥珀酰亚胺-叶酸酯，溶于15 ml DMSO中。滴加N-羟基琥珀酰亚胺-叶酸酯的壳聚糖溶液，合成叶酸-壳聚糖偶联物。将混合物在30 °C下在黑暗中搅拌20小时。2.4. 叶酸-壳聚糖偶联纳米粒空白和长春新碱的制备空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合（FA-CS将0.2 g FA-CS结合物溶于100 ml乙酸（2%，v/v）中，制备乙酸（2%，v/v）和FA-CS溶液（0.2%，w/v）的储备液。用IN NaOH和HCl将FA-CS溶液的pH调节至5通过将250 mg三聚磷酸钠（TPP）（0.5%，w/v）溶解于50 ml双蒸水中来预溶解该还制备了长春新碱的水贮备液（1 mg/10 ml，pH 4.77）。为了合成空白叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒，在烧瓶中加入25 ml叶酸-壳聚糖缀合物溶液，然后向其中逐滴加入5 ml三聚磷酸钠以形成1：5的比例，直到形成纳米颗粒悬浮液，并在室温下在磁力搅拌器上搅拌30分钟为了合成长春新碱负载纳米粒子，取恒定体积（25 ml）的预先溶解在乙酸中的叶酸-壳聚糖缀合物置于四个单独的烧瓶中，在这些烧瓶中加入不同体积的长春新碱储备溶液（100ml、200ml、300ml、400ml），然后在每个烧瓶中逐滴加入三聚磷酸钠使溶液在室温下在磁力搅拌器上搅拌30分钟。将合成的叶酸-壳聚糖长春新碱纳米粒分别标记为1：25、2：25、3：25和4：25的处方。将空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的纳米颗粒悬浮液以16，000rpm离心30分钟以从溶液中分离纳米颗粒用于进一步表征。2.5. 表征2.5.1. 平均粒径、多分散指数和zeta电位纳米颗粒的平均尺寸、多分散指数和ζ电位通过动态光散射（ DLS ） 使 用 Malvern Zetasizer Nanos Nano 90 （ MalvernInstruments ，UK）测量。将纳米颗粒（50 ml）分散在双蒸水（950 ml）中以制备1 ml溶液，并在25 °C下读取读数。分析了三个不同批次，以给出平均尺寸、多分散指数和zeta电位的平均值和标准偏差。2.5.2. 包封率（%）和装载量（%）通过在16，000 rpm下将样品研磨30分钟来测定负载长春新碱的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒的包封效率（%）和负载容量（%）通过UV 分 光 光 度 计 （ NanoDrop 2000c ， Thermo Scientific ，Wilmington，DE，USA）在220 nm波长下测定上清液中游离长春新碱的含量，使用其相应空白纳米颗粒的上清液作为基本校正。通过以下公式计算包封率（%）和装载容量（%）封装效率<$ %<$1/4氨氯地平总剂量-氨氯地平游离剂量=氨氯地平总剂量×100氨氯地平1倍装载量%w=wt%壳聚糖纳米颗粒=回收的壳聚糖纳米颗粒的质量×100 × 2cm2.5.3. 纳米颗粒的储存稳定性在冰箱中于4°C在磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中测量空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒平均尺寸、多分散性指数和ζ电位在 10 天 后 使 用 MalvernZetasizerNanos90 （ MalvernInstruments，UK）用动态光散射（DLS）将纳米颗粒（50 ml）分散在双蒸水（950 ml）中以制备1 ml溶液，并在25 °C下读取读数。实验一式三份进行。测量平均尺寸、多分散指数和zeta电位的平均值和标准偏差2.5.4. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）通 过 Spectrum RX-IFTIR 光 谱 仪 （ PerkinElmer ， Waltham ，MA，USA）分析空白和负载长春新碱的壳聚糖纳米颗粒的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。将干燥的纳米颗粒与溴化钾（KBr）以2%w/w比率混合。将混合物研磨成细粉并在10，000psi的液压机下压入溴化钾盘中.每个溴化钾片在4000 ~ 400 cm-1的波数范围内扫描，分辨率为1cm-1。记录了不同样品的官能团特征峰2.5.5. 扫描电子显微镜（SEM）扫描电镜分析空白和长春新碱壳聚糖纳米粒的形态N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-9989××(JEOL型号JSM -6390 LV）。为此，将少量样品放置在铝短柱中，然后用铂涂覆。SEM图像是在15 kV电压的加速电子下拍摄的。2.5.6. 透射电子显微镜（TEM）通过透射电子显微镜（Jeol/JEM 2100，Peabody，MA，USA）检查叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒中长春新碱的负载。将一滴纳米颗粒在铜网格上干燥，并在200 kV的工作电压下拍摄TEM图像。2.5.7. 体外释放研究在37 °C下，通过透析管（截留分子量在12，000 - 14，000 Da之间）在磷酸盐缓冲盐水（pH 6.7）中分析长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒的体外将负载有阿贝斯汀的纳米颗粒（10 mg）分散在1 ml磷酸盐缓冲盐水中并置于透析管中将该管浸入50 ml磷酸盐缓冲盐水中，并在37 ℃下以105 rpm振荡。在确定的时间间隔，收集释放介质并用新鲜的磷酸盐缓冲盐水替换。使用紫外-可见分光光度计（NanoDrop 2000 c，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）在220 nm波长下测定释放到磷酸盐缓冲液中的长春新碱浓度2.5.8. 荧光显微镜采用荧光显微镜观察长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒在NCI-H460细胞中的摄取情况将细胞与100 ml Hoechst孵育33258染料（0.51g/ml，蓝色荧光）在37 ℃下在CO2孵育器中孵育，并用PBS（pH 7.4）洗涤两次，以5000 rpm离心5分钟（Velocity 18 R，冷冻离心机，Dynamica，United Kingdom）。将洗涤的细胞重悬于RPMI-1640培养基中，并与100 ml负载长春新碱的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（10 mg/ml，4：25制剂）在37 ℃下孵育45分钟。然后在荧光显微镜下使用蓝色荧光在20 ° C下检查细胞。40倍放大（Nikon TiS Eclipse荧光显微镜，Tokyo，Japan）。2.5.9. 长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒2.5.9.1. 细胞培养。非小细胞肺癌细胞系（NCI-H460）的研究工作在Hisar的Lala Lajpat Rai兽医和动物科学大学动物生物技术 NCI-H460细胞购自印度浦那国家细胞科学中心（NCCS）。将细胞在补充有ImM丙酮酸钠、2 mM L -谷氨酰胺、4.5g葡萄糖/升和2 mM L -谷氨酰胺/升的RPMI-1640培养基上以单层培养。1.5g/L碳酸氢钠（不含HEPES缓冲液）、10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素，在37 °C、95%空气和5% CO2的潮湿环境中。细胞在75cm 2组织培养瓶中生长，并在指数生长期用于实验。2.5.9.2. MTT法通过Mosmann方法[16]略微修改后测定长春新碱负载叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒的细胞毒性。在96孔板中培养细胞（1ml，1 ×106个细胞/ml），并用4：25制剂的不同浓度的空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（5、10、15、20和25 mg/ml溶解在磷酸盐缓冲盐水中）处理将细胞在95%空气和5%CO2 中于37°C在CO2培养箱中培养16 h将含有RPMI-1640培养基的PBS（pH7.4）中的细胞和单独的RPMI- 1640培养基用作阴性对照。 添加10ll将MTT染料储备溶液（5 mg/ml）加入到每个孔中，并在37 °C下孵育板2小时。在不破坏细胞的情况下，在微量移液管的帮助下小心地去除培养基，并在每个孔中加入100ml无水异丙醇（0.1 N HCl）。将细胞在37 °C下用95%空气和5%CO2在37 °C下孵育2小时。用Synergy 2 Multi-Mode Reader（BioTek，Winooski，VT，US）在570 nm处获取每个孔的分光光度读数。计算IC50值，并将最佳剂量用于进一步研究。通过以下公式计算细胞活力百分比细胞存活率：用纳米颗粒处理的细胞的%H2O：D=O： D：对照细胞×100 × 3 μ g将NCI-H460细胞分为4个实验组。第1组：在RPMI-1640培养基中的未处理的对照细胞，第2组：在含有RPMI-1640培养基的PBS（pH 7.4）中的未处理的对照细胞，第3组：空白叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒（10 mg/ml），第4组：长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒（5 mg/ml）。2.5.9.3. 测定细胞内活性氧（ROS）水平。使用非荧光探针20，70-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测量细胞内ROS水平，其在活细胞中被ROS氧化成荧光二氯荧光素（DCF）[17]。将NCI-H460细胞（1 ml，1× 106个细胞/ ml）在96孔板中在37℃下在CO2培养箱中用空白（50ml，10 mg/ml，在PBS中）和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（50ml，5 mg/ml，在PBS中）处理细胞将RPMI-1640培养基和PBS（pH 7.4 +细胞+ RPMI- 1640培养基）中的未处理细胞用作阴性对照。将细胞与95%空气和5%CO2在37°C下孵育16小时。添加50m l制备10μ M 20，70-二氯荧光素二乙酸酯储备溶液在DMSO中的溶液加入到每个孔中，并允许在37°C下在CO2培养箱中 温 育 30 用 RPMI-1640 培 养 基 洗 涤 细 胞 ， 并 使 用 荧 光 显 微 镜（Nikon TiS Eclipse，Tokyo，Japan）在蓝色荧光下观察。2.5.9.4. 线粒体跨膜电位变化的测定。使用稍微修改的罗丹明-123染色分析用空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒处理的NCI-H460细胞中线粒体跨膜电位的变化[17]。将NCI-H460细胞（1 ml，1×106个细胞/ml）培养于在CO2培养箱中在37 ℃下用95%空气和5%CO2培养96孔板，然后用空白（50 μ l，10 mg/ml的PBS溶液）和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（50 μl，5 mg/ml的PBS溶液）处理。将具有RPMI-1640培养基和PBS（pH 7.4 +细胞+ RPMI-1640培养基）的细胞用作阴性对照，并在37 ℃下孵育16小时。制备罗丹明储备液（5 mmol/L），每孔加入50mL，然后在CO2培养箱中孵育30分钟。用RPMI-1640培养基洗涤细胞，并使用荧光显微镜（Nikon TiSEclipse，Tokyo，Japan）在蓝色荧光下观察。2.5.9.5. 凋亡形态学变化的测定。采用吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EtBr）双重染色法区分浓缩的凋亡细胞核和正常细胞[17]。将NCI-H460细胞（1 ml，1× 106个细胞/ml）置于96孔板中，37 ℃CO2培养箱中，95%空气，5%CO2用空白（50ml，10 mg/ml，在PBS中）和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（50ml，5 mg/ml，在PBS中）处理细胞用RPMI-1640培养基和PBS（pH7.4+细胞+ RPMI-1640培养基）用作阴性对照，并在37 °C下孵育16小时。制备的acri-90N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-99×3在PBS（pH 7.4）中的橙和溴化乙锭（1 mg/ml）在37 °C下，将细胞与每个孔中的吖啶橙和溴化乙锭各5 ml孵育30分钟。用RPMI-1640培养基洗涤细胞，并使用荧光显微镜（Nikon TiS Eclipse，Tokyo，Japan）在蓝色荧光下观察。2.5.9.6. 红细胞聚集试验。进行聚集测定以检查纳米颗粒对红细胞的毒性作用[17]。由于包封率（%）和装载量（%）4：25的制剂是最大的，因此选择用于测定。将人血收集在含有乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌试管中。将约500ml血液以2000 rpm离心30分钟以分离红细胞。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤细胞两次，并储存在相同的缓冲液中。为了检查长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的毒性作用，将100ml红细胞用溶解在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中的400 ml纳米颗粒处理，并在37 ℃摄氏度。在复合显微镜（Magnus Analytics，New Delhi）下以40倍放大率观察红细胞。3. 结果和讨论3.1. N-羟基琥珀酰亚胺叶酸酯及叶酸-壳聚糖偶联物的合成叶酸与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N0-二环己基碳二亚胺（DCC）和三乙胺反应，生成深浅黄色的二环己基脲，证实了叶酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成。Earlier、Salar和Kumar[14]在pH 2.5下合成长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒时观察到黄色同样，Ji等人[18]还在制备甲氨蝶呤负载的叶酸缀合的O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒期间观察到叶酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。此外，溶解在乙酸盐缓冲液（pH 5.6）中的叶酸-壳聚糖缀合物与叶酸的N-羟基琥珀酰亚胺-酯反应以形成叶酸-壳聚糖缀合物。类似地，Wang等人[19]合成了叶酸-壳聚糖缀合物，同时将米托蒽醌负载到叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒中。Naghibi Beidokhti等人[20]通过叶酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯与壳聚糖反应合成叶酸-壳聚糖缀合物。3.2. 空白和长春新碱叶酸壳聚糖纳米粒由于叶酸-壳聚糖缀合物的带正电荷的氨基（-NH+）与带负电荷的三聚磷酸钠之间的离子相互作用，形成叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒[18]。将叶酸-壳聚糖溶解于乙酸中，与三聚磷酸钠和不同浓度的长春新碱反应，导致在不同制剂中形成负载长春新碱的叶酸-壳聚糖缀合在早期的报道中，已经通过离子凝胶化方法制备了负载甲氨蝶呤的壳聚糖纳米颗粒，并在体外针对LNCaP前列腺癌细胞系进行了测试[21]。3.3. 表征3.3.1. 平均粒径、多分散指数和zeta电位空白叶酸-壳聚糖偶联纳米颗粒的平均粒径为95.59 ± 0.52 nm，多分散性指数为0.229 ± 0.31，ζ电位为+8.91 ± 0.36 mV（表1）。当长春新碱被装载在纳米颗粒中，从1：25至4：25制剂观察到平均尺寸（nm）和zeta电位（mV）的浓度依赖性增加对于具有最大量的长春新碱（4：25）的制剂，负载长春新碱的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的平均尺寸为130.0 ± 0.89 nm，多分散指数为0.221 ± 0.01，ζ电位为0.221± 0.01。+9.83± 1.41 mV（图①的人。据报道，由于增强的渗透效应，尺寸小于200 nm的纳米颗粒通常可以增加抗癌药物在肿瘤中的蓄积[22]。此外，由于网状内皮系统的低摄取，小于200 nm的纳米颗粒具有显著更长的循环时间[23]。所有制剂中的负载有阿贝斯汀的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的尺寸低于200 nm所有制剂的正ζ电位有利于带负电荷的癌细胞摄取纳米颗粒。在先前的研究中，Salar和Kumar[14]观察到相同制剂在pH 2.5下长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒的平均尺寸、多分散指数和zeta电位的这表明在合成纳米颗粒之前溶解在乙酸中的叶酸-壳聚糖缀合物溶液的pH对平均尺寸、多分散性指数和zeta电位具有3.3.2. 包封率（%）和装载量（%）所有制剂的包封效率（%）和负载容量（%）示于表2中。观察到长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的包封效率（%）和负载能力（%）的浓度依赖性增加，其中对于4：25制剂最大，即95 ± 0.35，并且对于4：25制剂最大，即95 ± 0.35。48.65 ± 0.47。发现这些效率高于Salar和Kumar在pH 2.5下合成的长春新碱负载叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒[14]。这表明pH值对抗癌药物载体系统的包封率（%）和载药量（%）具有控制作用。此前，Sun等人[24]合成了负载5-氟尿嘧啶的壳聚糖纳米粒，当5-氟尿嘧啶和壳聚糖的质量比为1：1时，观察到最大包封率和负载量分别为44.28 ± 1.69%和20.13± 0.007%。Xu等人[25]报道了叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒中吉西他滨的包封效率（85.4 ± 4.9%）和负载能力（3.91 ± 0.12%）。3.3.3. 纳米颗粒的储存稳定性如表3所示，在磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中储存10天后，所有制剂的平均尺寸增加，并且发现2：25制剂的最大值，即，341.1 ±0.58 nm。除了1：25制剂外，还观察到多分散指数增加然而，除了3：25之外，在所有制剂中发现zeta电位降低，但仍然是正的总体而言，平均尺寸、多分散指数和zeta电位存在变化，但不显著。因此，磷酸钠缓冲液（pH7.4）是保存空白和长春新碱叶酸-壳聚糖复合物的适宜介质。表1长春新碱负载叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒在pH 5下的平均尺寸、多分散性指数和zeta电位。制剂平均粒径（nm）多分散指数Zeta电位（mV）空白FA-CS NP95.59 ± 0.520.229 ± 0.31+8.91 ± 0.36一点二十五分121.9 ± 0.950.271 ± 0.76+9.11 ± 0.29两点二十五分129.8 ± 0.300.250 ± 0.02+9.38 ± 0.61三点二十五分124.9 ± 0.960.249 ± 0.02+8.96 ± 0.50四点二十五分130.0 ± 0.890.221 ± 0.01+9.83 ± 1.41N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-9991图1.一、4：25制剂的负载有阿贝斯汀的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（a）平均尺寸和多分散性指数，以及（b）和ζ电位。表2长春新碱负载叶酸-壳聚糖缀合纳米粒的包封效率（%）和负载容量（%）。S.号制剂包封率（%）装载量（%）1.一点二十五分50 ± 0.5810.90 ± 0.452.两点二十五分70 ± 0.5012.24 ± 0.513.三点二十五分80 ± 0.4525.40 ± 0.384.四点二十五分95 ± 0.3548.65 ± 0.47±标准差（n = 3）。表3在4 °C下在磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中储存10天后对空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒的平均尺寸、多分散指数和ζ电位的影响。10天后的制剂门控纳米粒子。已经观察到在25 °C下在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中储存的壳聚糖/三聚磷酸盐纳米颗粒的尺寸在10天的时间内增加[26]。3.3.4. 傅里叶变换红外光谱空白叶酸壳聚糖复合纳米粒的FTIR光谱在3338.52cm-1处出现N-H伸缩振动特征峰，在1：25，2：25，3：25和10：25时，该特征峰分别位移到3336.79，3326.54，3355.91和3709.102cm-1。4：25制剂（图2a-e在3709.102 cm-1处的较宽峰表明，由于三聚磷酸钠的三聚磷酸基团与叶酸-壳聚糖缀合物的铵基团连接，叶酸-壳聚糖纳米颗粒中的分子间和分子内相互作用增强[27]。在1549.82、1549.61、1552.93和1551.94 cm-1处的峰由于酰胺II N-H变形和C-N伸缩振动而移动，平均粒径（nm）多分散指数Zeta电位（mV）这可能是长春新碱负载在纳米颗粒中的结果。空白FA-CS NP203.0 ± 0.50 0.329 ± 0.10 +3.94 ± 0.251：25 220.0 ± 0.96 0.259 ± 0.45 +2.76 ± 0.352：25 341.1 ± 0.58 0.611 ± 0.09 +3.74 ± 0.403：25 225.3 ± 0.34 0.547 ± 0.04 +4.25 ± 0.804：25 208.2 ± 0.43 0.336 ± 0.03 +3.83 ± 0.28±标准差（n = 3）。3.3.5. 扫描电子显微镜（SEM）通过扫描电子显微镜观察到具有球形形状和粗糙表面的不同尺寸的纳米颗粒（图3）。但由于制备工艺的不同，纳米颗粒的粒径也存在差异，这与动态光散射（DLS）结果92N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-99用于制备用于分析的纳米颗粒的纳米颗粒。4：25制剂中的纳米颗粒看起来更粗糙，这可能是由于这些制剂中长春新碱的最大负载。相比之下，Panwar等人[28]观察到光滑和球形的阿魏酸负载壳聚糖纳米颗粒，并检查了对ME-180人宫颈癌细胞系的抗癌活性。他们在ME-180细胞中观察到显著的抑制作用，包括这些纳米颗粒可用于治疗宫颈癌。Anitha等人[29]还观察到负载姜黄素的N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的球形形态，并检查了对正常（L929）和乳腺癌细胞系（MCF-7）的抗癌活性。作者报道了纳米颗粒对L929细胞的无毒性，而对MCF-7细胞的毒性增强。在另一份报告中，Mehrotra et al.[30个]98.99590858075%T706560555047.0电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510 - 88888888cm-1（一）98.9989694929088%T868482807877.0电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510 - 88888888cm-1（b）第（1）款100.29590858075%T706560555048.0电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510 - 88888888cm-1（c）第（1）款图二、FTIR光谱显示，由于长春新碱负载导致峰偏移（a）空白FA-CS NP和不同制剂的长春新碱负载FA-CS NP，（b）1：25，（c）2：25，（d）3：25，（e）4：252152,971018,961641,891411,851549,823336,791118,972152,961018,931346,901641,751412,671549,613326,542132,961414,921637,743338,52N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-9993×98.698979695%T9493929190.4电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510 - 88888888cm-1（d）其他事项104.310310210110099%T98979695949392.0电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510 - 88888888cm-1（五）图2（续）观察到球形和光滑表面的洛莫司汀负载的壳聚糖三聚磷酸钠和壳聚糖-六偏磷酸钠纳米颗粒。3.3.6. 透射电子显微镜（TEM）如图 4、空白和长春新碱负载的FA-CS纳米柱均为球形。与空白FA-CS纳米颗粒相比，由于长春新碱的负载，1：25、2：25、3：25和4：25制剂的纳米颗粒中存在颗粒样结构。然而，与SEM相比，由于用于制备纳米颗粒以用于TEM分析的样品的更多稀释，纳米颗粒的尺寸存在差异。早些时候，Salar和Kumar[14]观察到球形长春新碱负载叶酸-壳聚糖结合纳米颗粒，由于负载长春新碱而具有颗粒状结构。类似地，还观察到球形的米托蒽醌负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒[19]。3.3.7. 体外释放研究如图5所示，1：25制剂在2 h内显示出16.67%的长春新碱累积释放，随后在4、6和8 h后分别为16.71、33.33和33.37%。 与此相比，2：25制剂在2小时内显示出16.31%的释放，而在2小时内显示出16.67，16.71，4、6、8h释放率分别为27.33%同样，公式-3：25的比例在2 h内和4、6、8 h后释放6.25释放率分别为6.07、6.09、12.5%最后，4：25公式-结果表明，叶酸-壳聚糖纳米粒2 h内释放长春新碱5.51%，4，6，8h后释放分别为5.47，5.57，11.11%。除1：25外，所有制剂均显示长春新碱缓慢和持续释放。类似地，Wang等人[19]观察到装载在叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒中的米托蒽醌在人工胃液（pH 1.2）和体液（pH 6.8）中缓慢释放。3.3.8. NCI-H460细胞对长春新碱FA-CS纳米粒的摄取使用Hoechst 33258染料，通过荧光显微镜分析NCI-H460细胞在37 ℃下孵育45分钟期间摄取长春新碱负载叶酸-壳聚糖纳米颗粒（4：25）的视觉证据。NCI-H460细胞在RPMI-1640培养基中生长时显示荧光减弱。然而，当用长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（100ml）处理细胞时，由于纳米颗粒的摄取，在40倍放大下观察到更亮的荧光（图6）。由于Hoechst 33258是用于染色细胞DNA的蓝色荧光染料，因此由于细胞摄取纳米颗粒及其对DNA的作用而观察到荧光。类似地，Karthikeyan等人[17]还观察到，在30分钟孵育时间内，使用Hoechst 33258染料，在用白藜芦醇负载的明胶纳米颗粒处理的NCI-H460非小细胞肺癌细胞中比游离白藜芦醇更亮的蓝色荧光。1343,971643,951412,941552,933355,913709,1022975,1001551,941405,9394N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-993.3.9. 长春新碱FA-CS纳米粒的抗肿瘤活性表4显示了空白和长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒（5、10、15、20、25 mg/ml）在NCI-H460细胞中的细胞毒性百分比。对于 空 白 纳 米 颗 粒 ， 在 20 mg/ml 浓 度 下 观 察 到 最 低 的 细 胞 活 力（40.25%）。相比之下，长春新碱负载的FA-CS纳米颗粒在10 mg/ml浓度下显示出最低的细胞活力（32.78%）。 因此，将空白的抑制浓度50（IC 50）固定为10 mg/ml，将长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒的抑制浓度50（IC50） 固 定为5 mg/ml，因为在这些浓度下，NCI-H460非小细胞肺癌细胞系可用于检查细胞内ROS水平、线粒体跨膜电位的变化和凋亡形态学变化，而不会对细胞造成损伤。对于组1：RPMI- 1640培养基中的未处理对照细胞和组2：PBS（pH7.4），观察到几乎100%的细胞活力，因此未包括在表中类似地，Wang et al.[31]测定了不同浓度的游离5-氟尿嘧啶和负载5-氟尿嘧啶的透明质酸包被的壳聚糖纳米颗粒对A549细胞和HepG 2细胞的细胞毒性。结果显示，在一定浓度（范围从0.1至1.5 μ g/ml）下，裸透明质酸包覆的壳聚糖纳米颗粒具有良好的生物相容性。1.0对A549和HepG2细胞的增殖无明显抑制作用，细胞存活率均在85%以上。与5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒子相比，5-氟尿嘧啶透明质酸壳聚糖纳米粒子对A549和HepG 2细胞具有更高的细胞毒性，其50%最大抑制浓度（IC50）为8.0 48 h时分别为6.71g/mL。 的细胞毒性作用透明质酸包被的壳聚糖纳米颗粒被还原为图3.第三章。纳米颗粒的SEM图像显示球形（a）空白FA-CS NP和不同制剂的长春新碱负载的FA-CS NP，（b）1：25，（c）2：25，（d）3：25，（e）4：25。N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-9995见图4。空白和长春新碱负载的FA-CS纳米颗粒的透射电子显微照片显示长春新碱的包封（箭头）（a）空白和不同制剂，（b）1：25，（c）2：25，（d）3：25，（e）4：25。13.11g/mL的透明质酸对A549细胞作用48 h，而加入游离透明质酸对HepG 2细胞作用不明显。Anitha等人[29]研究了姜黄素和姜黄素- N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒在正常（L929）、人乳腺癌（MCF-7）和前列腺癌细胞系（PC-10）中的体外细胞毒性。3）。用N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒处理的L929细胞系在1-5 mg/ml的浓度范围内显示出高的细胞活力，而用相同浓度的姜黄素和姜黄素负载的N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒观察到降低的细胞活力。然而，80%的细胞活力表明姜黄素、N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒和姜黄素负载的N，O-羧甲基壳聚糖纳米颗粒对正常细胞无毒性。对于MCF-7细胞，N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒显示无毒性，而姜黄素和姜黄素N，O-羧甲基纳米粒显示相当大的毒性。同样，在PC-3细胞，姜黄素-N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒显示出毒性，其结果是在5 mg/ml浓度下细胞存活率降低至30%，证实了其抗癌作用。3.3.10. 细胞内ROS水平如图所示（Fig. 7 i），在未处理的NCI-H460细胞中观察到弱的ROS产生。相比之下，空白纳米颗粒显示出显著的ROS产生，并且在长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合的纳米颗粒中发现了进一步增强的ROS产生（图1B）。 7 i）。类似地，Hou et al.[32]通过靶向递送阿霉素至线粒体，观察用三苯基膦官能化壳聚糖纳米颗粒处理的人肺癌（A549）和宫颈癌细胞系（HeLa）中的ROS结果表明，阿霉素对A549和HeLa细胞的ROS水平有一定的促进作用，24 h和48 h后分别增加到120.5%和130.4%。96N. Kumar等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）87-99图五.不同制剂（1：25、2：25、3：25、4：25）的叶酸-壳聚糖偶联纳米粒中长春新碱的累积释放（%）行为显示在磷酸盐缓冲盐水（pH 6.7）中缓慢和持续释放。见图6。 NCI-H460细胞中纳米颗粒的细胞摄取40×（a）对照，（b）用长春新碱负载的叶酸-壳聚糖缀合纳米颗粒增强荧光。A549细胞中，24 h后为130.4%，48 h后为136.7%以同样的方式，