新孢子虫病的分子流行病学和发病机制

工程6（2020）10研究动物疾病研究综述新孢子虫病的分子流行病学和发病机制放大图片作者：Asis Khana，Jahangheer S.放大图片创作者：Patricia Sikorskia.放大图片作者：Michael E.格里格aa分子寄生虫学部分，寄生虫病实验室，国家过敏和传染病研究所，国立卫生研究院，Bethesda，MD 20892，USAb动物寄生虫病实验室，Beltsville农业研究中心，农业研究服务，美国农业部，Beltsville，MD 20705，USA阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2018年2019年2月12日修订2019年2月22日接受在线发售2019年保留字：新孢子病分子流行病学群体遗传学基因组学宿主反应疫苗A B S T R A C T犬新孢子虫（N. caninum），一种包囊形成原生动物寄生虫，是全世界牛流产和新生儿死亡的主要原因。N.犬科 动 物 具 有 广 泛 的 中 间 宿 主 范 围 ， 其 性 周 期 仅 发 生 在 犬 科 动 物 中 。 新 孢 子 虫 属 （ Neosporahughesi （ N.Hughesi），已被鉴定并引起马的骨髓脑炎。尽管分子流行病学研究尚处于起步阶段，但已发现小亚基核糖体RNA（ssuRNA）内的18S核糖体RNA（rRNA）和ITS1区以及一个N.犬种特异性DNA探针（pNc5）已被广泛用于从其他密切相关的顶复门寄生虫中鉴定新孢子虫。虽然这些重复区域具有比管家基因或抗原基因更高的灵敏度和特异性，但它们具有低辨别力并且不能捕获物种内多样性。类似地，尽管多个小卫星或微卫星标记研究已经显示新孢子虫内的明确地理亚结构，但由于微卫星基因座处不同等位基因的大小的趋同（称为同质性），菌株经常被错误分类。只有一个菌株，N.犬利物浦弓形虫（Nc-Liv）的基因组序列已测定，并与其近亲刚地弓形虫（T.弓形虫）。因此，需要基于来自世界各地的多个菌株的全基因组序列进行详细的群体基因组学研究，以便更好地了解新孢子虫的当前群体遗传结构，并最终确定针对牛新孢子虫病的更有效的候选疫苗。本文的目的是概述我们目前对新孢子虫的分子流行病学和基因组学的理解，并与密切相关的顶复门寄生虫Hammondia hammondi和T。刚地。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。1. 历史角度犬新孢子虫（N. 犬弓形虫（Toxoplasma gondii，T. caninum）是一种属于顶复门（apicomplexan phylum）的球虫原虫[1]，常与顶复门（apicomplexan）的弓形虫（Toxoplasma gondii，T. 1988年，[2，3]1984年，Bjerkås et al.[4]首次描述了挪威一窝六只先天性感染Boxer幼仔的脑脊髓炎（脑和脊髓疾病）和肌炎（肌肉疾病）病例，由一种不明寄生虫引起 这种寄生虫被正式确认为N。caninum的研究，基于对1952年至1987年在美国波士顿Angell纪念动物医院死于弓形虫样疾病的死狗和猫的数千个组织切片的回顾性分析，这些组织切片与抗T的免疫组织化学反应性呈阴性。弓形虫抗体[2，3]。*通讯作者。电子邮件地址：asis. nih.gov（A. Khan）。2. 生命周期N.犬科动物的宿主范围很广，其生活史具有异质性，由两种不同的生殖模式组成：①无性生殖，发生在中间宿主中; ②有性生殖，仅发生在最终犬科动物宿主中，包括狗[5]、郊狼[6]、灰狼[7]和野狗[8]（图1）。虽然T. gondii的发育阶段是明确的，N.犬科动物，如配子生殖和配子生殖，是未知的。这是N.犬卵囊是未形成孢子的二倍体卵囊，其对冷冻和干燥具有环境抗性。未形成孢子的卵囊在感染犬科动物的粪便中脱落，并在环境中进行减数分裂，形成单倍体子孢子（图1）[3]。在中间宿主摄取孢子化卵囊后，子孢子从卵囊中释放出来，并转化为快速生长的阶段，称为速殖子，其传播感染（图1）。① 的人。速殖子侵入宿主细胞并复制https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.02.0102095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engA. Khan等人 /工程6（2020）10-1911Fig. 1. N. 犬的转载自参考文献[3]，经CRC出版社许可，©2017。通过在寄生虫液泡（PV）内反复进行内分泌而无性繁殖。在几轮内分泌后，寄生虫从宿主细胞中排出[9]以重新感染新的宿主细胞，随后产生宿主特异性先天性和适应性免疫应答。由于宿主的免疫反应和其他环境因素，速殖子转化为缓慢生长的半休眠阶段，称为缓殖子，在组织囊肿中发现（图1）。组织包囊可以在宿主细胞中存在很长一段时间，并且可以转化为速殖子以产生潜伏感染，特别是在免疫功能低下的宿主中[10]。3. 传输尽管新孢子虫具有广泛的宿主范围和异源的生活史，但牛和狗分别作为其主要中间宿主和最终宿主感染[11]。牛可通过水平途径（摄入终末宿主排出的感染性卵囊）或垂直途径（从受感染的妊娠母亲经胎盘或先天性传播给胎儿）感染（图1）。垂直传播被认为是牛群中新孢子虫传播的主要和最有效（80%）途径。 垂直传播可以通过妊娠小母牛的卵囊源性感染作为外源性传播发生，也可以通过妊娠期间重新激活的潜伏感染作为内源性经胎盘传播发生[3]。感染新孢子虫的胎儿可在任何胎龄流产、再吸收、木乃伊化、自溶或出生时持续感染。经胎盘传播在其他中间宿主中也有记载，包括绵羊、山羊、鹿和狗。经精液传播性病通过牛奶传播被认为是不可能的[3]。犬通常通过摄入受感染的中间宿主组织经口感染。猫是T. gondii和Hammondia hammondi（H. Hammondi）[12]，在性传播过程中，犬通常产生较少的新孢子虫卵囊。考虑到牛群中犬和牛的密切关系[1，5]以及通过牛的世代垂直传播的相似性[13，14]，传播的可能性显著更高，因为寄生虫可以在同一牛群内的终末宿主和中间宿主之间维持和繁殖很长一段时间。牛和狗之间通过无性繁殖和有性繁殖的局部传播循环可能正在塑造新孢子虫的种群结构。4. 休氏新孢子虫本文报道了新孢子虫属（Neospora hughesi（N. hughesi），于1998年首次在美国加利福尼亚州的一匹患有马原寄生虫性骨髓脑炎的马中报道[15]。N. hughesi被认为是一个单独的物种，因为它似乎仅限 于 马 [15] ， 并 且 当 与 N. 犬 [16-18] 。 例 如 ， 表 面 抗 原 SAG1 在NcSAG1和NhSAG1之间表现出6%的氨基酸同一性差异[16]。因此，NcSAG1衍生的mAb 6C11不与N. hughesi SAG1 [16].类似地，另一种表面抗原SRS2（NcSRS2和NhSRS2）显示9%的氨基酸差异。因此，这两种大量表达的表面抗原之间的抗原特异性已被用于产生区分N. caninum和N. 胡盖西12A. Khan等人/工程6（2020）10[16]第10段。比较分析了N. hughesi和N.犬也显示出在氨基酸序列和结构组织方面的显著差异[18]。除了这些抗原性标记物外，还使用了灵敏的分子检测方法，该方法基于重复ITS1区域内的核苷酸序列差异来区分N。 hughesi从N. caninum（7 -9 bp）[19].有趣的是，N. 犬复孔绦虫和N. Hughesi还赋予实验啮齿动物感染期间的表型差异。N. hughesi主要引起心肌组织坏死，而N. 犬病变主要见于肝、肺和脑。此外，N.caninum和N. hughesi在沙鼠（长爪沙鼠）模型中的作用。 沙鼠对经口感染N. caninum，导致大多数沙鼠在感染后6-13 d内死亡[20]。反之，N. 除了一些显微镜下的损伤外，Hughesi感染在沙鼠中不产生显著的临床症状。然而，这两个物种之间的遗传和生物学差异是否是由于物种特异性差异或菌株特异性差异，需要澄清，如T。刚地。N.caninum和N. hughesi的研究可能有助于阐明这两种寄生虫是否应该被认为是分离的物种，因为最近已经证实在利什曼原虫领域内发生了种间杂交[21]。综上所述，目前的共识是，新孢子虫种群结构是由至少两个独立的新孢子虫种：N。caninum和N. hughesi，从一个共同的祖先进化而来，并独立扩展以适应其各种脊椎动物宿主。5. 检测5.1. 形态学检测已经开发了几种形态学检测方法通过细胞离心涂片或印模涂片的显微镜检查进行细胞学检查，然后对病变进行Diff-Quick快速染色、Giemsa染色和/或苏木精或伊红（HE）染色，是该领域快速检测新孢子虫病的最然而，由于与密切相关的寄生虫的形态相似性，除了存在厚壁（高达100 μ m）外，很难将新孢子虫与弓形虫和哈蒙德虫区分开。4lm）组织囊，这是Neospora.传输电子显微镜具有也被用于基于新孢子虫中电子致密棒状体（ROP）的存在，将新孢子虫与弓形虫和肉孢子虫区分开。相反，弓形虫ROP是电子透明的，而ROP在肉孢子虫裂殖子中不存在。免疫组织化学染色（IHC）是检测固定组织中新孢子虫病的另一种非常敏感且广泛使用的方法[22抗生物素蛋白-生物素复合物间接免疫过氧化物酶法和过氧化物酶-抗过氧化物酶法同样敏感。新孢子虫属特异性单克隆和多克隆抗体均已用于IHC，兔多克隆抗体显示出比单克隆抗体更高的灵敏度。然而，最近，NcSRS2和NcGRA7单克隆抗体的组合[24]显示出比多克隆抗体更特异和灵敏，避免了多克隆抗体与T.弓形虫或相关的球虫寄生虫。5.2. 血清学检测自从发现新孢子虫病以来，已经开发了几种血清学方法用于其检测。感染后，新孢子虫-特异性免疫球蛋白M（IgM）抗体可以在几周内检测到，而IgG抗体需要几周才能达到检测水平，滴度在初次感染后六个月达到峰值 几种抗原已被广泛用于检测，包括表面抗原NcSRS 2、NcSAG 1、NcSAG 4和Ncp 40;细胞骨架蛋白NCPF;致密颗粒蛋白NcGRA 2、NcGRA 6和NcGRA 7;丝氨酸蛋白酶NcSUB 1;以及微线（MIC）蛋白NcMIC 6和NcMIC 10 [25]。间接荧光抗体试验（IFAT）是第一个应用于新孢子虫检测的基于抗体的方法[2]。在这种方法中，将完整的速殖子固定在盖玻片上，并与试验血清孵育;然后将其与针对宿主免疫球蛋白的荧光素标记的二抗杂交。IFAT被认为是检测新孢子虫病的参考试验，因为该试验显示与密切相关的顶复门寄生虫的交叉反应性非常小，并且可以通过滴定血清进行定量[26，27]。新孢子虫直接凝集试验（NAT）也已取代T。来自改良凝集试验（MAT）的弓形虫抗原与新孢子虫特异性抗原[28，29]。NAT已被用于测试来自多达16种不同动物种属的大量血清中IgM的存在，并且被发现与IFAT一样敏感然而，最广泛和商业上使用的血清学检测方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）[30]，它可以自动化大量样品，并以高特异性快速扫描。各种ELISA方法（即， 间接ELISA（iELISA）和细胞ELISA（cELISA））主要使用总速殖子溶胞产物或纯化的天然抗原用于聚苯乙烯板致敏[31，32]。利用天然或总抗原的一个缺点是与其他密切相关的球虫寄生虫交叉反应的可能性[33]。因此，目前广泛的新孢子虫特异性抗原被用于包被ELISA板以建立特异性[30，34，35].还建立了使用IgG、IgA和IgE抗体的基于ELISA的亲合力测试，其他血清学技术，如使用NcGRA6[36]和NcSAG1[37]的乳胶凝集试验（LAT）和免疫印迹（IB）[38]，已被开发，但未被广泛使用。6. 血清阳性N.牛、肉牛、犬、山羊等家畜血清中的犬抗体在世界各地均有报道，大多采用上述血清学方法。牛、犬、山羊和绵羊的血清阳性率见图2[3]。重要的是然而，需要提及的是，由于使用不同的血清学方法、临界值的差异以及缺乏通过从受感染动物中分离活寄生虫的验证，来自不同研究组的血清阳性率数据不具有可比性[1]。尽管如此，在其他研究中，已成功从终末宿主（特别是犬）以及各种中间宿主（如牛、绵羊、白尾鹿和水牛）中分离出活寄生虫[1，3]。尽管实验表明新孢子虫在养牛业中仅在牛和狗之间传播，但任何上述中间宿主都可能作为新孢子虫传播的额外重要宿主存在。例如，白尾鹿是美国新孢子虫的主要宿主之一，血清阳性率为88%[39]。 人畜共患病传播的可能性也是未知的。有人认为，与T. 弓形虫、新孢子虫和哈蒙德虫不具有传染性对人类在巴西、丹麦、埃及、韩国和美国的人体中检测到低滴度的新孢子虫抗体[40虽然这一观察结果可以解释为A. Khan等人 /工程6（2020）10-1913图二.全球N.犬在不同宿主中的分布，包括牛、狗、山羊和绵羊（x轴）。y轴代表国家/地区。T.弓形虫和新孢子虫，在实验中已经在初级动物（猕猴）模型中描述了经皮新孢子虫病[43，44]，并且新孢子虫可以在体外培养中使用不同的人细胞系繁殖[45]。因此，这些数据提供了关于人畜共患病传播可能性的线索然而，目前还没有从人类身上发现活的寄生虫和寄生虫7. 分子流行病学新孢子虫领域的成功分子流行病学和系统发育研究需要从其广泛的宿主和地理范围中分离出大量菌株，以及合适的遗传工具。与弓形虫不同，新孢子虫研究缺乏足够的工具和分离物来区分不同的新孢子虫菌株及其宿主限制机制迄今为止，新孢子虫属菌株的鉴定依赖于几个已测序的标记，这些标记已用于区分新孢子虫属与密切相关的球虫;然而，这些标记不能区分不同的新孢子虫属菌株。使用最广泛的分子-新孢子虫中最大的标记是小亚基核糖体RNA（ssuRNA）和pNc5（GenBank登录号，X84238）内的18S rRNA和ITS1区域[43，44]，这是由于它们的重复特征，因为单拷贝基因对聚合酶链反应（PCR）检测的敏感在T. gondii，H. hammondi和Neospora的亲缘关系较近。然而，这几个SNP足以区分新孢子虫与弓形虫和H。使用通用引物、种特异性荧光DNA杂交探针[46]、使用新孢子虫特异性引物的第二轮巢式PCR [47]或使用BsaJI酶的PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）[48]，虽然18S rRNA可以用来区分密切相关的寄生虫，但迄今为止在不同的新孢子虫分离株之间没有检测到序列差异，包括NC 1，N.犬利物浦（Nc-Liv）、NC 3和NC-SweB 1 [43，44]。另一个ssuRNA标记ITS1由于其高灵敏度和特异性也被广泛用于物种特异性后来设计了新孢子菌属的基于ITS 1的单管巢式PCR，以提高检测1-10 fg新孢子菌属基因组DNA的灵敏度该方法具有高度的灵敏度和特异性。然而，与18 S rRNA基因座不同，在菌株NC-Bahia（南美来源）与新孢子虫的不同犬和牛分离株（包括NC 1、Nc-Liv、BPA 1、NC-SweB 1和NcNZ 1）之间检测到差异，其在ITS 1处共享相同序列[15、44、50、51]。虽然这些后一种标记物对于检测新孢子菌极其敏感，但由于在循环新孢子菌分离株中发现的高度遗传相似性，它们可能不适合表征种内菌株异质性或用于系统发育分析。另一种多拷贝基因pNc5已被广泛用于在广泛的中间宿主和终末宿主中检测新孢子虫感染然而，它不是精确特异性的，因为已经报道这些引物扩增啮齿动物特异性DNA[52]。最近，基于单基因测序的标记物包括14-3-3、表面抗原（SAG 1、SAG 4和SRS 2）、分泌致密颗粒蛋白（GRA 6和GRA 7）和几种管家蛋白（GRA）。基因如a-和b-微管蛋白和热休克蛋白70（HSP-70）用于对一些牛和犬新孢子虫进行基因分型从有限的地理分离[16这些标记似乎是高度保守的不同的新孢子虫分离株，这提出了问题，它们在区分新孢子虫分离株的有用性。与单拷贝基因序列标记不同，小卫星或微卫星标记被归类为可变数目的串联重复序列（VNTR）DNA，在物种内的不同分离株之间捕获了广泛的遗传多样性。因此，微卫星标记已被广泛应用于近缘N. 犬分离株[55，56]。利用微卫星标记进行基因分型研究，确定了9个N.犬，每个分离株的DNA图谱与其地理来源之间没有关联[55]。在最近的一项研究中，11N.从世界各地收集的犬参考菌株和96个N.使用9个多位点微卫星标记对来自西班牙、阿根廷、苏格兰和德国的犬牛临床分离株进行基因分型[57]。微卫星特征显示了广泛的遗传多样性，包括96个微卫星多位点基因型。微卫星标记不能捕获整个基因组中多态性的真实程度，并且可能由于同源性而将菌株错误分类为变体[58]。然而，基于F-统计值（F-ST）和eBURST分析，这些标记可以确定明确的地理亚结构，这可能表明最近引入的N。犬隔离与养牛业的运动[57]。因此，有必要进行系统的分析，比较14A. Khan等人/工程6（2020）10非多态性单基因位点，用微卫星标记鉴定遗传多样性，以确定群体遗传多样性的真实程度。最近，宏基因组下一代测序（NGS）已发展成为研究弓形虫脑炎的诊断工具[59]。因此，宏基因组NGS可以被开发用于以与新孢子虫病病例因果相关的靶标非依赖性方式鉴定和基因分型感染因子。8. 基因组新孢霉属（Neospora）、H. hammondi和T.弓形虫在宿主范围和其他生物学方面（如在小鼠模型中的毒力）存在显著差异，但基于全基因组测序，它们的基因组高度同线性（表1，图3（a））[60-62]。Nc-Liv是第一个使用Sanger测序以八倍覆盖率测序的新孢子虫基因组;它聚类成由585个超重叠群和7121个基因组成的61 Mb基因组（欧洲核苷酸档案馆，项目CADU 0000000;www.toxodb.org）。随后，这些超重叠群使用T.弓形虫Me49基因组分为14条染色体，因为它们的基因组高度共线（图3（a））[60，61]。虽然新孢子虫和弓形虫在大约2800万年前从它们最近的共同祖先分化出来，但根据恶性疟原虫和赖氏疟原虫之间的突变率计算， [63]，只有少数染色体重排和一个在这两个物种之间观察到遗传信息的低净增益/损失。一个例外是表面抗原家族，特别是新孢子虫中SAG1相关序列（SRS）的显著扩展（227个NcSRS基因和52个NcSRS假基因），它们在整个基因组中串联排列成多基因簇（图3（b））。在这些SRS中，新孢子虫在速殖子阶段仅表达25个NcSRS基因的子集，并且每个多基因簇仅表达一个基因最近，基于使用Nc-Liv速殖子的链特异性RNA测序和鸟枪蛋白质组学，已经校正了超过三分之一先前注释的基因模型和非翻译区（UTR）的预测遗传结构[64]。RNAseq数据的使用不仅显著提高了新孢子虫基因组的注释质量，而且还导致了顺式天然反义转录物（cis-NAT）和长基因间非编码RNA（lincRNA）的鉴定[64]。有趣的是，对T。gondii，H. hammondi，和N.犬氮素代谢基因的变化不明显，只有少数差异表达基因和氮素代谢基因表达上调。犬[61]。9. 分子遗传学工具全基因组测序和转录分析的出现促进了分子遗传工具的发展，以阐明新孢子虫基因调控的潜在机制，表1三种近缘顶复门寄生虫的比较分析特征N. caninumH. 哈蒙迪T. 弓形虫终宿主犬科动物猫科动物猫科动物中间宿主牛科动物，马啮齿动物哺乳动物、鸟类人类感染不可能不可能是的估计大小（Mb）626565无测序缺口的组装长度（bp）57 524 11967 460 98565 464 221染色体数目141414蛋白质编码基因6 9368 0048 322GC含量（%）54.852.552.2蛋白质编码基因的平均长度（bp）4 8924 8684 778图3.第三章。 比较分析了近缘顶复门寄生虫N. caninum，H. hammondi和T.刚地。（a）Circos图表明三种密切相关的顶复门寄生虫之间的基因组高度同线外圆代表每种寄生虫的注释染色体。使用NCBI blast V在这些菌株的参考序列（www.toxodb.org）2.5，允许70%或更高的同一性百分比，小于0.001的e值，和500 bp的最小片段大小通过核苷酸爆炸发现的参考序列之间的同线性使用Circos V中的带状链接绘制0.69 （b）T. gondii Me49（Tg）在N. caninum（Nc）和H. hammondi（Hh）在N. 犬的A. Khan等人 /工程6（2020）10-1915发病机制然而，有必要开发遗传工具来操纵基因组，以阐明已通过基因组研究鉴定的基因的功能。由于与T. gondii，现有的异源表达系统可用于T. gong-dii最初已被成功地用于感染和转化新孢子虫[65]。大肠杆菌lacZ基因在新孢子菌中也得到了稳定表达。 弓形虫[66]，并且该转基因菌株成为筛选抗寄生虫分子的非常重要的工具。随后，几个基因的T.将弓形虫SAG1、GRA2、NTPase3和ROP2基因成功转染到新孢子虫中，以进一步了解这些基因的分子机制。这项工作最终导致了ROP 8基因的鉴定。 因此，异源表达T.将弓形虫基因引入免疫学上不同的新孢子虫背景[67]证明了研究重要弓形虫的有用性。用于开发活疫苗候选物的弓形虫基因[68]。在稳定的转染系统成功之后，突变的二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（DHFR-TS）（其赋予对乙胺嘧啶的抗性[69]）和稳定的药物选择性标记物如氯霉素乙酰转移酶的插入[70]已经被工程化以研究新孢子虫中的基因组编辑。最近，来自T.弓形虫已有效且特异性地适用于新孢子虫的基因组编辑[71]。利用CRISPR/Cas9系统，来自Nc-1GFP表达菌株的绿色荧光蛋白（GFP）和来自Nc-Spain 7分离株的NcGRA 7基因已被成功缺失并被乙胺嘧啶选择性标记替换[71]。因此，CRISRP/Cas9系统将提供有效和可靠的方法来对新孢子虫的基因组进行精确的靶向改变，以研究特定的基因功能[72]，检测与新孢子虫发病机制相关的基因，或产生能够提供针对急性和慢性新孢子虫病的免疫保护的减毒活疫苗株。10. 寄主-病原相互作用在进化过程中，宿主已经发展出复杂的免疫防御来对抗病原体，而病原体已经进化出逃避宿主监视并实现成功感染的策略新孢子虫感染广泛的中间宿主。因此，进入宿主细胞并绕过宿主免疫对其存活和持续感染至关重要。为了进入宿主细胞，新孢子虫寄生虫首先在速殖子与宿主细胞表面之间形成低亲和力接触，然后粘附到宿主细胞上。宿主细胞表面蛋白聚糖，特别是速殖子的硫酸软骨素糖胺聚糖（GAG）和缓殖子的末端唾液酸残基作为粘附受体促进新孢子虫感染[73，74]。新孢子虫表面抗原包括NcSAG1和NcSRS2，是促进宿主和寄生虫之间初始接触的寄生虫因子。有趣的是，全基因组测序已经确定了新孢子虫表面抗原的显著扩增（223个SRS基因，图3（b））。弓形虫（135个SRS基因）[61]。SRS基因扩增的这种显著差异及其对初始宿主免疫调节和寄生虫毒力调节的在初始接触后，利用其分泌细胞器（即MIC、ROP和GRA）中存在的主动滑动运动和组成型表达的蛋白质，寄生位点通过移动连接进入宿主细胞以形成PV [75-77]。 与T. gondii是新孢子虫体内的一种N-乙酰基蛋白酶抑制剂，称为胃蛋白酶抑制剂，在组装和运输MIC和ROP蛋白进入宿主细胞中起重要作用，并对寄生虫入侵有显著影响[77，78]。使用兔抗N54的免疫荧光研究鉴定了另一种新孢子虫蛋白酶NcSUB 1（以前称为NC-p65），其定位于寄生虫的MIC细胞器中并参与宿主细胞的侵袭[79]。移动连接的形成导致ROP 蛋白注入 PV 。通过正向遗传学研究、 数量性状基因座（QTL）分析和反向遗传学基因敲除研究，对小麦的遗传多样性进行了研究。弓形虫已确定ROP 18/ROP 5复合物是易感实验室小鼠感染期间的主要毒力效应物。在ROP 18介导的IRG磷酸化之后，ROP 5蛋白与免疫相关的GTP酶（IRG）结合以阻断其寡聚化和活化[80最近显示，R 0 P18/R 0 P5复合物还包括另一种ROP激酶R 0 P17，其对寡聚化的IRG具有高亲和力[88]。有趣的是，ROP 18序列的全基因组比较表明，ROP 18在新孢子虫中是假基因化的，并且含有存在于非毒性III型菌株中的上游区域（UPS），但不存在于毒性I型和间毒性II型T中。弓形虫菌株[61，89]。然而，从T.新孢子虫属（Nc1）中的弓形虫I型强毒RH株使其在小鼠中的病毒性显著增强[90]。尽管ROP 18在新孢子虫属中是假基因化的，已经有充分的文献证明干扰素（IFN）-c是主要细胞因子介导对新孢子虫的抗性[91，92]。有趣的是，IFN-c激活的间充质基质细胞不仅抑制了新孢子虫的生长，而且还表现出参与细胞增殖的能力。IRGs（irga 6、irgb 6和irgd）和鸟苷酸结合蛋白（GBP; mGBP 1和mGBP 2）在抗新孢子虫作用中的作用[93]。因此，综合起来，这些发现表明假基因化的ROP 18和IRG参与寄生虫清除是导致新孢子虫非毒性表型的原因。小鼠模型。除了IFN-c，新孢子菌是Toll样受体（TLR 3）依赖性I型（a/b）IFN-γ[94].对T.弓形虫还鉴定了一种非ROP 2 ROP蛋白，ROP 16，其以菌株特异性方式运输到宿主细胞核并磷酸化STAT 3/STAT 6，导致先天免疫信号传导的显著激活，并通过减弱IL-12信号降低小鼠中的毒力[61，95，96]。与T.刚地，新孢子菌ROP 16仅磷酸化STAT3而不磷酸化STAT6，导致诱导宿主细胞凋亡[97]。ROP蛋白质组分析已经鉴定了新孢子虫中的其他ROP组分，包括NcROP 1、NcROP 5和NcROP 30，它们具有与新孢子虫相似的结构。高度同源于中描述的那些T. 刚地。类似地，GRA在入侵期间以高水平分泌，并且在PV中组成型表达以调节宿主信号传导途径。虽然几种GRA已被确定为T. [98]，其中很少有，即GRA15 [99]，GRA16 [100]和GRA24 [101]与宿主细胞核相关。GRA15已被证实激活NF-κB通路并控制IL-12的诱导分泌后T.弓形虫 感染[99].相反，GRA16是参与细胞周期进程和p53肿瘤抑制途径[100]，而GRA24调节宿主p38 MAP激酶[101]。 与T. 刚地，GRA不是很 好NcGRA6和NcGRA7（最初命名为NcDG1[102] 和NcDG2[103] ）除外。NcGRA7是分泌成的PV和是已知到在PV矩阵（PVM）中定位[76]。其他GRA包括NcGRA1、NcGRA2、NcMAG1和NcNTRA已被表征，并在速殖子密集的GRA中表达，并定位于PV基质中[76，104]。尽管GRA15激活了NF-κB通路在T. gondii[99]，该基因在新孢子虫·×××·×·16章Khan等人/工程6（2020）10已经鉴定出多种差异性和菌株特异性分泌效应物，其影响T。鼠模型中的弓形虫宿主相互作用和病毒。虽然新孢子虫属的菌株特异性差异尚未得到充分研究，但已记录了几例例如，与无毒力的Nc-SweB 1相比，参考菌株Nc-Liv显示出在小鼠中诱导新孢子虫病的严重临床症状，包括炎性浸润和高度坏死性病变。[105]I'm sorry. 另一种无毒力分离株Nc-Nowra在实验室小鼠中引起轻度至中度非化脓性脑炎，而Nc-Liv引起重度非化脓性脑炎[106]。小鼠毒力分析也表明，NC1比NC3更具毒性[107]。基于这些观察，我们推测，与T.在弓形虫中，毒力的差异是由于新孢子虫寄生因子的菌株特异性差异。为了支持这一假设，进行了比较差异凝胶电泳（DIGE）和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术，结果表明，强毒株和减毒株之间的蛋白质组表达谱存在显著差异;此外，这些分析确定了新孢子虫强毒株中NTR的不受调控的表达[108]。最近的一项新孢子虫免疫组学研究揭示了强毒株（Nc-Liv、Nc-Spain 1H）和减毒株（Nc-Spain 7）之间的毒株特异性差异，并显示强毒株中四种蛋白质的表达始终较高：丝氨酸-苏氨酸磷酸酶2C、超氧化物歧化酶、GAP 45和NcGRA 1 [109]。 正如T。弓形虫的正向遗传分析，包括遗传杂交的发展，随后进行QTL分析或全基因组关联测试，将可能鉴定出导致新孢子虫发病机制中菌株特异性差异的其他分泌决定因素。11. 疫苗接种牛新孢子虫病是一个巨大的关注世界范围内由于其经济影响。根据一项系统综述，全世界牛新孢子虫病造成的经济损失估计为1.298109USD a-1，范围高达2.380 109 USD a-1[110]。这些损失中的三分之 二是 由 乳制 品 行 业造 成 的（ 8.429 108 美 元 a-1 ） ， 因 为奶 牛（ 14.3% ） 因 新 孢 子 虫 引 起 的 中 位 特 定 流 产 风 险 高 于 肉 牛（9.1%）。此外，全球损失的三分之二发生在北美（65.7%），其次是南美（18.5%）和澳大拉西亚（10.6%），而三个欧洲国家（荷兰、西班牙和英国）的损失估计仅为5.3%。因此，巴西、墨西哥和美国是新孢子虫病疫苗接种的主要目标市场[110]。尽管已经假设全球抗牛新孢子虫病疫苗市场非常大，但目前还没有预防流产诱导新孢子虫病传播的治疗方法或疫苗。唯一获得许可的N。犬疫苗是Bovilis Neoguard（Intervet International B.V.，荷兰），组成的灭 活N.caninum速 殖 子 （ 收 获 时 3 × 106 mL-1 ） 、10%Havlogen佐剂、5%稳定剂和5%磷酸盐缓冲盐水。不幸的是，在哥斯达黎加和新西兰进行的几项随访研究表明，该疫苗的有效性较低（20%）或经胎盘传播增加，早期胚胎死亡风险增加，最终导致该疫苗退出市场[72，111]。最近，一种含有大豆卵磷脂的速殖子提取物疫苗的可溶性部分b-葡聚糖佐剂（sNcAg/AVEC）在妊娠牛中显示免疫原性和诱导高IFN-c应答[112]。从来没有，活速殖子疫苗组成的自然减毒或毒性较小的分离株，如Nc-Nowra[113]，Nc-Spain 1H[114]，和阿根廷分离物Nc-6 [115]提供了N.犬抗体应答，并导致流产率显著降低。然而，使用活疫苗存在一些固有的缺点，例如活寄生虫的批量保存和免疫后致病性的逆转风险[116];因此，灭活或亚单位疫苗是更有吸引力的选择。 不幸的是，重组NcGRA 7（50200μg）包埋在寡聚甘露糖微粒体（M3-NcGRA7）[117]以及细菌表达和纯化的重组体包括rNcSAG1、rNcHSP 20和rNcGRA7[118]在内的蛋白质显示出非常小的前景，因为它们未能预防怀孕小母牛中的感染。因此，鉴定一种新的、更有效的疫苗方法，如新孢子虫减毒活菌株（包括Ca2+依赖性蛋白激酶2缺陷型速殖子），对于确保对新孢子虫病的持久保护至关重要[119]。12. 结论顶复门寄生虫N.犬是导致牛流产和死胎或犬神经肌肉疾病的主要原因。牛新孢子虫病在肉类和乳制品行业都具有很大的经济影响，并且没有有效的因此，迫切需要新的药物、疫苗和/或工具来对抗新孢子虫病。为了确定减轻新孢子虫病的新方法，有必要确定其种群遗传结构，以预测病原体如何演变;还需要更好地了解宿主-病原体相互作用。目前可用的遗传标记（RFLP和基于序列的）不足以区分N。 犬分离株。最近微卫星标记的使用导致了新孢子虫种群内亚结构的鉴定;然而，使用微卫星标记确定的固定（FST）统计和贝叶斯聚类算法被同源性混淆，该同源性推断出比可能存在的更复杂的种群结构。因此，应该对来自世界各地广泛宿主范围的多种菌株进行全基因组测序这将扩大可用遗传标记的范围，并产生更好的模型来确定通过无性或有性传播发生传播的程度，以便制定更明智的策略来降低传播风险，并提高对新孢子虫急性和慢性感染的免疫保护。确认作 者 得 到 了 美 国 国 立 卫 生 研 究 院 国 家 过 敏 和 传 染 病 研 究 所（NIAID）校内研究项目的M.E.G. 是加拿大高级研究所（CIFAR）微生物生物多样性综合项目的学者遵守道德操守准则Asis Khan，Jahangheer S. Shaik，Patricia Sikorski，JitenderP. Dubey，and Michael E.格里格声明，他们没有利益冲突或财务冲突披露。引用[1] Dubey JP，Schares G，Ortega-Mora LM.新孢子虫病和犬 新孢子虫病的流行病学与防治。 临床微生物学评论2007;20（2）：323-67。[2] Dubey JP，Hattel AL，Lindsay DS，Topper MJ.犬新生儿新孢子虫感染：病原体的分离和实验性传播。 美国兽医医学杂志1988;193（10）：1259-63。[3] 杨文 伟 ， 王 文 伟 . 动物的新孢子虫病。Boca Raton：CRC Press; 2017.A. Khan等人 /工程6（2020）10-1917[4] Bjerkås I，Mohn SF，Presthus J.不明囊形成孢子虫引起犬脑脊髓炎和肌炎。ZParasitenkd1984;70（2）：271-4.[5] McAllisterMM，Dubey JP，Lindsay DS，Jolley WR，Wills RA，McGuire AM.犬是新孢子虫的最终宿主。 Int J Parasitol 1998;28（9）：1473-9.[6] Gondim LF，McAllister MM，Pitt WC，Zemlicka DE.狼（Canis latrans）是新孢子虫的最终宿主。 Int J Parasitol 2004;34（2）：159-61.[7] [10] Dr.J，Dr. J，Dr. J，Dr. J，et al. 灰狼（Canis lupus）是新孢子虫的自然终末宿主。 VetParasitol 2011;181（2-4）：382-7.[8] King JS，Slapeta J，Jenkins DJ，Al-Qassab SE，Ellis JT，Windsor PA.澳大利亚野狗是犬新孢子虫的最终宿主。IntJ Parasitol 2010;40（8）：945-50.[9] Ojo KK，Reid MC，Kallur Siddaramaiah L，Müller J，Winzer P，Zhang Z，等. 犬新孢子虫钙依赖蛋白激酶1是治疗新孢子虫病的有效药物靶点。 PLoS ONE2014;9（3）：e92929.[10] Dubey JP. 新孢子虫和新孢子虫病研究进展。Vet Parasitol1999;84（3-4）：349-67.[11] Dubey JP.牛的新孢子虫病：生物学和经济影响。美国兽医医学杂志1999;214（8）：1160-3。[12] Dubey JP，Ferguson DJ. Hammondia hammondi（顶复门：肉孢子虫科）在猫体内的生活史J Eukaryot Microbiol 2015;62（3）：346-52.[13] Pare J，Thurmond MC，Hietala SK.奶牛先天性犬新孢子虫感染和相关的犊牛死亡率。CanJ Veter Res1996;60：133-9.[14] Thurmond MC，Hietala SK.先天获得性犬新孢子虫感染对奶牛流产和随后流产风险的影响。美国兽 医 研 究杂 志 1997;58（12）：1381-5。[15] Marsh AE，Barr BC，Packham AE，Conrad PA.新孢子虫属一新种的描述（原生动物门：顶复门：肉孢子虫科）。J Parasitol 1998;84（5）：98