肺癌中RPL9和LIAS基因组学和分子分析

医学信息学解锁25（2021）100698肺癌中RPL9和LIAS的基因组学和分子分析癌发生的新意义ZodwaDlamini a，d，*，Rahaba Marima a，Rodney Hull a，Konstantinos N. Syrigos c，Georgios Lolasa，c，Lebogang Mphahlele a，Zukile Mbita ba南非比勒陀利亚大学，哈特菲尔德，0028，泛非癌症研究所，SAMRC精密肿瘤学研究单位（PORU）b林波波大学生物化学、微生物学和生物技术系，Sovenga，0727，南非c雅典国立卡波季斯特里安大学第三医学系，雅典，15772，希腊d威特沃特斯兰德大学临床医学院健康科学系，南非，帕克敦A R T I C L EI N FO保留字：肺癌RPL9LIASHSPA9计算机生物信息学分析qPCR原位杂交A B S T R A C T在世界范围内，肺癌是癌症相关死亡的主要原因，也是最常见的癌症诊断形式。肺癌的一个主要特征是其严重的临床、组织学和分子异质性。这种异质性不仅是空间的，而且是时间的，因此强调需要个性化的患者定制的治疗计划。目前的最佳治疗计划目前是基于在整个疾病和治疗过程中实时监测肿瘤的演变分子谱。在目前的工作中，我们将研究RPL9和LIAS在致癌作用中可能发挥的新作用。虽然RPL 9的异常表达已经显示在结直肠癌中发生，但其在肺癌中的作用尚不清楚。类似地，LIAS作为一种代谢相关基因，在癌症生物学中，特别是在肺癌中的作用仍然未知。新兴的研究揭示了RPL9和LIAS作为相互作用的伴侣和凋亡抗性基因。本研究的目的是确定rpl9和lias基因在正常肺组织和肺癌样本中的差异表达这是通过使用原位杂交（ISH）和定量实时PCR（qPCR）来实现的。通过使用计算机生物信息学分析建立了关于RPL 9在肺癌中所起作用的进一步数据。这样做是为了绘制通过这些基因的表达而丰富的生物途径。KEGG途径和Reactome分析都证实了这些基因在RNA代谢途径中的作用。此外，RPL9被证明在信号转导、自噬和细胞对应激途径的反应中发挥作用。这两种蛋白质的功能在蛋白质代谢方面重叠。STRING分析也证明了RPL9和LIAS之间的相互作用在此，我们建议，RPL 9和LIAS的异常表达可能参与肺癌的发生，并可作为靶向治疗。语言治疗1. 介绍在世界范围内，肺癌仍然是男性和女性癌症相关死亡的主要原因[1]。肺癌的一个重要特征是其极端的临床、组织学和分子异质性。肺癌异质性不仅是空间的，因此在不同患者之间（患者间）或同一肿瘤内的不同区域（肿瘤内）发展，而且由于其动态演变而随着时间的推移，分化程度更低，更具侵略性和抗药性的克隆。虽然多种因素可能导致肺癌，但吸烟仍然是肺癌发病率和死亡率较高的主要因素[2]。在发达国家，全面的烟草控制计划已导致肺癌发病率和死亡率下降[3然而，在发展中国家，吸烟在男子和妇女中仍然普遍存在研究表明，肺癌缩略语：HSPA 9，热休克70 kDa蛋白9; ICSA 1，铁硫簇组装体1; LIAS，硫辛酸合成酶; LIPT 1，脂酰转移酶1; LIPT 2，脂酰转移酶2; NSCLC，非小细胞肺癌; PIK3CA，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶; RP，核糖体蛋白; RPL 6，核糖体蛋白L 6; RPL 9，核糖体蛋白L9。* 通讯作者。SAMRC精密肿瘤学研究单位（PORU），泛非癌症研究所（PACRI），比勒陀利亚大学，哈特菲尔德，0028，南非。电子邮件地址：Zodwa.Dlamini@up.ac.za（Z.德拉米尼）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100698接收日期：2021年6月27日;接收日期：2021年8月9日;接受日期：2021年2021年8月11日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊首页：www.elsevier.com/locate/imuZ. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006982表1rpl9和lias的引物序列。Rpl9正向CTCCGGGTTGACAAATGGTGGCTCCGGGTTGACAAATGGTGGRpl9反向CCCATTCTCCTGGATAACAACGCCCATTCTCCTGGATAACAACGLiasForward TAAGACTGCAAGAAATCCTCCTCC2. 材料和方法2.1. 计算机生物信息学生物信息学工具被用于绘制由RPL9和LIAS富集的生物和分子途径。使用Reactome数据库（https：reactome.org/）版本72绘制生物学路径-利亚斯逆转GopdhForwardTAAGACTGCAAGAAATCCTCCTCCCACAAGGATTTTTGGATTCCTTTCCCACAAGGATTTTTGGATTCCTTTCC涉 及 RPL9 和 LIAS 的 方 式 。 上 传 了 rpl9 （ NM_000661 ） 和 lias（NM_006859）的GenBank登录号。选择人类标识符和IntAct交互器功能以增加分析背景。为了研究蛋白质之间的相互作用Gapdh反向序列GGCATGGACTGTGGTCATGAGGGCATGGACTGTGGTCATGAG这些国家的死亡率较高，尽管发病率较低。这可能是由于多种因素，包括环境污染物。除此之外，社会和文化障碍加上卫生设施的不足，可能导致在疾病的后期才诊断出疾病，治疗效果较差。这些诊断和治疗的延误严重影响了总生存率率[6]。肺癌的预后一般是严峻的，5年涉及RPL 9（NM 000661）和LIAS（NM_006859），使用STRING数据库[20]。DAVID v6.8[21]用于可视化富集的途径。基于使用计算机模拟分析获得的初步结果，将蛋白质硫辛酸合成酶（LIAS）鉴定为RPL 9活性的新的可能下游效应物。这导致使用LIAS作为额外查询进行生物信息学分析。为了进一步分析使用STRING鉴定的预测蛋白质相互作用，有必要构建RPL 9相互作用网络中蛋白质的3D同源模型，包括LIAS，ICSA 1，生存率是approX iphone415.7%[1]的文件。腺癌，aHSPA9、RPL6和RPL9。这是使用SWISS模型完成的[22]。非小细胞肺癌（NSCLC）型是男性和女性中最常见的肺癌组织学亚型，其次是鳞状细胞癌、大细胞癌和小细胞肺癌[7，8]。目前，病理分期是预测NSCLC患者生存率和确定相似治疗策略组的最重要系统。然而，分子标志物如EGFR、ALK、KRAS、HER2、MET、BRAF、PIK3CA、MEK1、已在NSCLC中鉴定的NRAS、AKT 1和ROS 1[9有一个显着的必要性，以增加知识的遗传因素，在肺癌的易感性中发挥作用，因此，分子基因谱有望产生潜在的诊断，预后和治疗目标，从而改善肺癌的诊断和治疗。核糖体蛋白L9（RPL9）是蛋白质合成的60S rRNA亚基的组成部分。Baik等人[13]将RPL 9的异常表达与结直肠癌中的Id-1/NF-κ B信号通路和细胞存活相关联。此外，Zhang等人[14]提出，上调的人RPL 9表达似乎通过促进结直肠癌中应激介导的存活而参与不受控制的生长。Eid等人[15]得出结论，rpl9是酵母中编码核糖体蛋白（RP）的抗凋亡基因。此外，已发现各种核糖体蛋白（RP）在不同的癌细胞中过表达，并且也与恶性癌症的发展和进展相关[16]。除了蛋白质生物合成，RPL 9的其他核糖体功能尚未完全了解，特别是在肺癌中。Rpl9具有不同的剪接变体，Lezzerini等人，2020年的研究表明，Rpl9变体可以严重损害核糖体功能和细胞代谢。例如，保留5'UTR的变体在目前的研究中进行的生物信息学分析强调了RPL 9和蛋白质硫辛酸合成酶（LIAS）之间的可能联系。RPL9和LIAS均已被报道为凋亡抗性基因[17]。参考文献[18]进行的卵巢癌甲基化谱的全基因组研究显示，当比较时，LiAs和RP19在癌组织中都低甲基化，正常组织在癌症中经常发现甲基化变化，DNA甲基化的丧失，也称为低甲基化，可能在肿瘤发生中起作用[19，18]。在这项研究中，我们的主要目的是测量肺癌与正常肺组织相比RPL9和LIAS的表达水平，并使用生物信息学分析来确定RPL9和LIAS的差异基因表达模式是否可能在肺癌的细胞凋亡和细胞存活途径中发挥通过使用ProSA网络服务器将预测模型与其模板进行比较，进一步验证预测模型并评估其质量，这提供了各个模型的z值得分。根据STRING分析显示为相互作用的蛋白质之间的对接分析使用TRIPPro 2.0进行[23]。因此，在LIAS的3D同源性模型与ISCA 1和RPL 9的3D同源性模型之间，以及在HSPA 9的3D同源性模型与ISCA 1和RPL 6的3D同源性模型之间进行对接分析。在BMPro分析之后，使用蛋白质相互作用计算器生物信息学工具来识别这些相互作用蛋白质之间形成的键， 6、A、切断。除此之外，还使用USCF Chimera工具进一步分析了模型[24]。作为这些生物信息学分析的结果，LIAS的表达模式也与RPL 9在正常肺组织、多种形式的肺癌组织和来源于健康肺组织和肺腺癌组织的细胞系中的表达模式一起确定。2.2. 样品收集正常对照和肺癌组织从南非约翰内斯堡病理学系国家卫生实验室服务 中 心 （ NHLS ） 获 得 ， 并 获 得 患 者 书 面 知 情 同 意 书 。 根 据Witwatersrand大学人类研究伦理委员会批准的指南和法规，按照伦理许可中的规定处理组织（许可编号：M050308）。这些组织样本由顾问病理学家（来自威特沃特斯兰德大学公共卫生学院）诊断并分类为正常组织或肺癌亚型。提供的癌症病例为腺癌（NSCLC）、大细胞癌、鳞状细胞癌和小细胞癌。2.3. 细胞培养本研究中还使用了两种细胞系，即原代成纤维细胞肺细胞系MRC-5和肺腺癌细胞系A549。MRC-5（ATCCCCL 171）和A549（ATCCCCL 185）细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。两种细胞系均在补充有10%热灭活胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies）中生长（FBS）（Sigma-Aldrich）和1%青霉素和链霉素。将细胞在37°C下在具有5%CO2的加湿培养箱中培养。将细胞培养2-3 天 以 达 到 约 70 %汇合， 然后进行 胰蛋白酶消 化以用于 后续实验目 的。Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006983Fig. 1. Reactome、STRING和KEGG途径分析。（A）表示使用Reactome途径数据库的RPL 9、HSPA 9、ISCA 1和LIAS基因的全基因组图谱分析。橙色线条和蓝色圆圈代表涉及RPL 9的途径。带黑线的紫色圆圈代表涉及ISCA 1的途径。黄圈绿线代表涉及LIAS的途径。黑色圆圈和蓝色线条代表涉及HSPA9的途径。HSPA9显示参与途径的几乎所有区域，但为了清楚起见，图中省略了这些区域。这些蛋白质都参与蛋白质代谢（B）显示RPL 9和LIAS两者的STRING分析，显示核糖体蛋白质与HSPA 9之间的相互作用以及该蛋白质与ISCA 1和LIAS之间的相互作用。它还显示了RPL 9和LIAS之间的弱相互作用。（C）代表KEGG途径分析LIAS，显示其在硫辛酸代谢中的作用。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006984××××±表2为通过STRING分析鉴定的蛋白质构建的同源性模型的详细信息蛋白模板结构参考序列鉴别序列相似性GMQEQMEANZ评分RPL6HSPA9ISCA1LIAS人核糖体的CryoEM结构DnaK的ICSA（汞衍生物）的X-射线晶体结构脂磷壁酸合成酶[29日][30个][三十一][32个]100.0061.9438.145.000.610.480.810.420.630.700.420.553.680.92-2.87-1.12-3.29-11.63-5.29-9.32.4. 原位杂交量热和荧光检测为了合成用于定位rpl9和lias转录物的RNA探针，设计引物以从它们的mRNA转录物扩增cDNA片段。将所得扩增子克隆到pGEM-T Easy载体（Promega，USA）中，并在Inqaba Biotec，South Africa测序，并使用NCBI BLAST 搜 索 工 具 确 认 。 然 后 使 用 T7 或 Sp6 聚 合 酶 （ RocheDiagnostics，Germany）产生DIG标记的反义和正义RNA探针。用石蜡切片法对正常组织和肺癌组织进行原位杂交在55℃下进行过夜，然后用2生理盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液和1个SSC，55℃。然后在室温下在0.5SSC和0.1通过在室温下将杂交的切片在抗地高辛配基（DIG）碱性磷酸酶缀合的抗体溶液（Roche diagnostics）中孵育1小时来进行比色检测。然后使用5-溴-4-氯-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑（Roche diagnostics）用Mayer ′ s Haemato x ylin（Sigma）复染使结合的探针抗体复合物可视化。染色切片然后用水性封固剂（Serotec）封固两 种 策 略 （ 比 色 法 和 比 色 法 ） 用 于 肺 癌 和 非 癌 组 织 中 rpl9 和liasmRNA的定位。为了使用原位杂交检测liasmRNA定位，使用DIG标记的探针，并用抗DIG缀合的碱性磷酸酶染色。然后利用底物NBT/BCIP检测定位的探针，其根据BCIP的水解和NBT的还原（比色法）产生紫色/蓝色沉淀。第二种策略采用抗DIG缀合的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，使用荧光原位杂交（FISH），如先前报道的[25]。将切片在与FITC缀合的抗DIG（Roche Diagnostics）中孵育。然后使用SlowFade LightAntifade Kit（Molecular Probes）封固染色的切片。使用荧光显微镜检测定位的探针，使用A× 10软件（Zeiss，Germany）拍摄图像。2.5. 实时定量PCR（RT-qPCR）使用FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒（Roche Diagnostics，Germany ） 进 行 定 量 实 时 PCR 反 应 。 rpl9 [NM_000661] 、LIAS[NM_006859] 的 基 因 特 异 性 引 物 （表 1 ） 。 使 用 primer 3 工 具（http://primer3.wi.mit.edu/）设计。GAPDH [NM_002046.5]用作内部对照。使用1μ g cDNA进行基因特异性表达PCR，0.016μ mol/μl各基因特异性引物。使用PCR级H2O代替模板作为无模板对照。根据下式，使用Livak和Schittman方法[26倍数变化=2-[ΔCT（测试）2.5.1. 统计分析来自三个独立实验的数据， （此荧光强度）和实时qPCR的结果表示为平均值的平均标准误差（SEM），并使用GraphPad Prism版本5进行分析。使用ANOVA和Tukey事后检验，在p≤ 0.05时认为组间存在显著性差异3. 结果3.1. RPL9通路作图和蛋白质相互作用分析将LIAS鉴定为感兴趣Reactome数据库鉴定出RPL 9参与蛋白质代谢和翻译以及在自噬、免疫应答、信号转导和对外部刺激的细胞应答中发挥作用（图1A）。癌症中RPL 9的过表达被认为允许癌细胞中蛋白质表达增加[27]。 RPL9的Reactome和STRING分析表明，大多数与RPL9相互作用的蛋白质是其他核糖体蛋白。然而，通过寻找与这些其他核糖体蛋白相互作用的蛋白质，除了其他核糖体蛋白，发现了其他感兴趣的蛋白质。这些蛋白质的Reactome分析揭示了它们也在蛋白质代谢中起作用（图1A）。特别感兴趣的是热休克蛋白HSP9A的鉴定。热休克蛋白不仅在蛋白质表达和代谢中发挥作用，而且在应激反应中也发挥作用。STRING鉴定的与HSP 9A相互作用的蛋白质之一是铁-硫簇组装体1（ICSA 1）同源蛋白，其反过来与硫辛酸合成酶（LIAS）相互作用（图11）。 1 B）。当使用Reactome数据库分析LIAS、ISCA 1和HPSA 9的功能与RPL 9的功能有重叠蛋白质代谢的作用。然而，与RPL 9不同，LIAS不参与翻译，但参与氨基酸代谢。连接RPL9和LIAS的蛋白质如HSPA9和ISCA 1也显示出在蛋白质和氨基酸代谢中的功能。RPL9与其他核糖体蛋白RPL6和RPS13相互作用，这些蛋白与应激蛋白HSPA9相互作用。HSPA9是一种分子伴侣，有助于蛋白质折叠，并与RPL 6和RPL 8相互作用。这两种蛋白质都是核糖体的组成部分，并与RPL 9相互作用。ISCA1和HSPA9都参与翻译，但热休克蛋白参与蛋白质转运和错误折叠的蛋白质反应。ISCA 1通过翻译后修饰参与蛋白质成熟（图1A）。特别是ISCA 1参与铁-硫簇支架组装途径。该途径在蛋白质折叠期间提供稳定性[28]。除了ICSA 1，LIAS与参与代谢的蛋白质如脂酰转移酶1（LIPT 1）和脂酰转移酶2（LIPT 2）强烈相互作用。STRING分析表明LIAS和RPL9之间存在弱相互作用KEGG分析显示LIAS参与了硫辛酸代谢（图1C）。这里揭示了硫辛酸辅因子在线粒体能量代谢的多酶复合物的活性中起重要作用（图1C）。作为这些分析的结果，结合RPL 9表达确定肺癌组织和细胞中LIAS的表达。3.2. 同源建模和对接分析利用同源蛋白质Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006985图二. Protein Interaction Calculator和Chimera分析的MIPPro相互作用模型：MIPPro分析导致多个对接模型的构建。预测RPL 9-LIAS模型（A）仅在5 μ cu偏离范围内具有两个H键。STRING分析预测这两种蛋白质之间只有弱相互作用，而这种对接分析似乎验证了这一预测。STRING分析预测了RPL 6和HSPA 9之间更强的相互作用（B），这通过对接模型中预测的H键数量的增加来反映。对HSPA 9-ISCA 3（ C）和ICSA 1-LIAS（D）对接模型的分析预测了这些蛋白质之间的多个H键。这两种模型都显示了包括氢键、离子键和疏水键的键。相互作用中的多种颜色反映了亲-泰恩对于HSPA 9-ISCA 1，存在最多的键合在ISCA 1的非结构化C末端（链B）和HSPA-9的C末端α螺旋之间。对于LIAS 9-ISCA 1，大多数键存在于ISCA1的非结构化中心区域与LIAS的中心α螺旋和β折叠（链B和D）之间。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006986图三. STRING蛋白质-蛋白质相互作用途径分析显示TP 53与本研究中感兴趣的蛋白质之间的相互作用。在RPL 9和LIAS之间鉴定的相互作用途径中的所有蛋白质的相互作用的STRING分析表明，连接LIAS和RPL 9的HSPA 9热休克蛋白与p53相互作用，在那里它作为p53功能的负调节剂。如表2所示。所得到的模型如Supple-图2所示。这些模板的PDB条目以及与靶蛋白相比的序列同一性和同源性值在表2中给出。评估这些模型的质量和立体化学质量。Prosa服务器用于分析模型，Z评分也在表2中给出。所有这些分数都是负的，表明残基能量连同对能量、结合能量和表面能都是负的，并且与它们的模板结构具有可比较的表面能亲和力这些不同模型的Ramachandran图显示，所有模型中的大多数氨基酸均处于与右旋α-螺旋一致的正态分布，因此可能是质量良好且可靠的模型（补充图S1）。总之，在验证过程中未观察到异常。基于STRING预测的蛋白质-蛋白质相互作用，使用RISTOPro进行3D同源性模型之间的对接分析。 以这种方式构造的对接模型的细节在补充表1中给出。所有对接分析导致每个相互作用的27-29个模型。基于多因素选择用于图形表示和进一步分析的模型。那些被选中的成员数量最多，具有最有利的能量中心模型以及具有最低能量的模型。选择的模型是用于RPL 9-LIAS对接的模型01、用于HSPA 9-RPL 6对接的模型02、用于LIAS-ISCA 1对接的模型03和用于HSPA 9-ISCA 1对接的模型01。使用蛋白质相互作用计算器生物信息学软件[33]以及UCSF Chimera软件分析了RISTOPro模型中蛋白质之间的预测键形成。RPL 9-LIAS模型的分析表明，在5 μ m内仅形成两个氢键（图2A）。这与STRING的预测相匹配，即这将是一个非常弱的相互作用。在HSPA 9-HSPA 9-ISCA 1模型预测了ISCA 1和HSPA 9的所有三条链之间的相互作用。这些包括多重疏水相互作用、离子相互作用和氢键。这些键都是在5秒钟内形成的。ISCA 1-LIAS SPECTROPRO模型的PIC分析也是如此（图2D）。还进行了生物信息学分析，以确定是否这些蛋白质中的任何一种都与肿瘤抑制因子TP 53相互作用。这样做是为了阐明RPL 9和LIAS在促或抗细胞存活机制中的作用。正如预期的那样，只有热休克蛋白HSPA9与p53相互作用（图3）。这种相互作用得到了IntAct工具的证实。这证实了这种相互作用是通过实验确定的。这里显示，HSPA9将p53隔离在细胞质中，防止其执行肿瘤抑制功能[34]。RPL 9或LIAS与TP 53缺乏相互作用并不令人惊讶，因为它们在细胞增殖和细胞死亡中的作用尚未或仅部分确定。3.3. lias和rpl9在肺癌中的高表达原位杂交显示，与正常组织相比，肺癌中rpl9和lias的转录水平升高。通过染色强度建立的rpl9和lias转录物的mRNA水平在正常和肺癌组织之间进行比较。此外，基于观察到的染色模式，将转录物定位于组织样品内的不同细胞类型。正义探针用作阴性对照。基于比色和荧光分析，观察到这两个基因在正常和癌组织中转录，但这两个基因的mRNA水平在癌组织中更高。基于在如图4所示的FISH染色结果中观察到的荧光强度的分析，rpl9和lias两者的转录水平分别为100和1000。在小细胞肺癌和肺腺癌（*p 0.05）中显著上调（**p<<然而，在鳞状细胞癌中，细胞肺癌（P> 0.05）。这些结果表明，rpl9和lias的转录水平在小细胞肺癌中最高（图4），其次是腺癌，而在鳞状细胞肺癌carcinoma.在正常肺组织和肺癌中，rpl9的总体转录水平相对于lias的水平是高的。这可能意味着RPL 9在肺癌中的重要作用尚未阐明。这些发现与[13]中的RPL 9水平升高相关。 在结肠直肠癌中。与正常组织相比，ISH还显示肺癌中rpl9的更多积累（图5）。Rpl9mRNA在肺鳞癌中定位于I型肺细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。在支气管腺的柱状纤毛细胞中也有表达。在小细胞肺癌中，在类似淋巴细胞的肿瘤细胞中检测到rpl9。在肺腺癌的柱状上皮细胞中检测到Lias mRNA（图1B）。 5）。3.4. RT-qPCR揭示肺癌中rpl 9和lias的转录水平升高实时荧光定量PCR显示肺腺癌中rpl9和lias mRNA水平升高。使用2-[ΔCT（测试）- ΔCT（校准品）]方法[26]，倍数变化代表rpl9的变化，计算测试（癌症）和对照（正常）之间的lias基因表达。发现LIAS在肺腺癌中上调4倍，而发现rpl9上调8倍。图6示出了肺癌细胞（A549）相对于正常肺成纤维细胞（MRC-5）中lias和rpl 9的上调的基因表达水平。rpl9和lias在肺癌中的表达水平均升高。4. 讨论进行了计算机生物信息学研究，以鉴定与RPL 9相互作用的蛋白质，这些蛋白质可能在肺癌的发展和进展中发挥作用。STRING分析最初仅将核糖体蛋白鉴定为相互作用蛋白。然而，使用这些其他核糖体蛋白的相互作用的检查的扩展鉴定了HSPA9热休克蛋白。选择该蛋白质作为完整的，并且STRING分析鉴定该蛋白质与p53相互作用。在STRING中使用RPL 9、RPL 6进行进一步的下游分析，Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006987见图4。使用荧光原位杂交（FISH）检测RPL 9和LIAS的转录水平。(A)正常肺组织以及各种类型肺癌（包括鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌和腺癌）中Rpl9和LiasmRNA的荧光染色（400 ×放大）。(B)使用荧光信号的强度作为每个样品中转录物水平的指示，测定并然后将其转化为荧光强度。相对于正常组织的染色强度评分。在小细胞肺癌中，rpl9和lias的转录均最高。当与正常肺组织相比时，在所有癌症类型中rpl9和lias的转录水平都增加。这两个基因的转录在肺腺癌和小细胞肺癌中显著较高。还确定了组织内不同细胞类型中转录本的存在在相互作用网络中连接RPL9和HSPA9的蛋白质，以及作为查询蛋白的HSPA9，鉴定了多个相互作用物。使用Reactome途径分析工具搜索具有总体相似功能的蛋白质，鉴定了ISCA 1和LIAS，以确认这些蛋白质都在蛋白质和氨基酸代谢中发挥作用。RPL9和LIAS之间也存在弱相互作用，这与它们共享的相互作用网络相结合，将LIAS确定为研究RPL9在肺癌中可能发挥作用的重要新靶点。在此生物信息学分析的基础上，将LIAS基因表达与RPL 9基因表达进行了关联分析。这些蛋白质相互作用的进一步分析是通过构建这些蛋白质的3D同源模型。对这些模型的质量进行了分析，结果表明这些模型质量良好。结果表明，HSPA9与ISCA 1之间以及ISCA 1与LIAS之间存在强相互作用。然而，对接模型并没有显示 RPL9和LIAS之间相互作用的任何强可靠的docling模型。考虑到STRING分析预测的弱相互作用，这并不奇怪。RPL Pro分析确实预测了RPL 6（与RPL 9的已知相互作用物）和HSPA9之间相互作用的更可靠的对接模型。然而，在使用UCSF Chimera的对接模型中，两种蛋白质之间的键预测揭示了Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006988小细胞肺癌的淋巴细胞和柱状上皮细胞。(400×放大倍数）。图五.肺癌组织和正常肺组织中rpl9和lias的原位杂交定位使用BCIP染色和Mayerrpl9在肺鳞状细胞癌和腺癌中的染色最强。在所有三种类型的肺癌中，lias的染色同样强烈。在这两种情况下，与正常肺组织相比，在肺癌组织中检测到更高水平的rpl9和lias染色还允许在组织内的某些细胞类型中以更高水平检测转录本。例如，在I型pneu中检测到rpl9巨噬细胞和淋巴细胞肺鳞状细胞癌的淋巴细胞、小细胞肺癌的淋巴细胞样细胞和肺腺癌的支气管腺的柱状纤毛细胞。 LiasmRNA的表达在见图6。通过RT-qPCR在肺细胞中的RPL 9和LIAS基因表达水平。相对于原代正常成纤维细胞MRC-5细胞，RPL 9和LIAS基因在腺癌细胞中均显示上调表达在5 π范围内存在至少SIXH键。还指出了静电相互作用的存在（数据未显示）。这再次证实了通过STRING分析预测的中等强度相互作用。原位杂交显示，在正常和癌性肺组织切片中均存在rpl9和lias这两种基因靶标，特别是rpl9的定位强度在癌症中比在正常组织中更大rpl8 mRNA在小细胞肺癌中的表达水平较高，其次是腺癌，然后是鳞状细胞肺癌。LiasmRNA也存在于细胞质中，文献表明LIAS在胞浆中表达[1，2，4，5，35]，RPL 9作为核糖体蛋白定位于细胞质中[13]。共定位研究对于确定和确认RPL9和LIAS的共定位将是有趣的而lias在小细胞癌中的转录水平最高，其次是腺癌和鳞癌。总的来说，RP19的转录水平是相对于lias来说更高。定量实时PCR证实肺癌中rpl9和lias的转录相对于其正常对应物增加。还证实rpl9mRNA水平高于lias的那些。这可能与RPL 9执行的生命功能有关。已知HSPA9在下调p53的肿瘤抑制活性中起作用。还报道了在快速增殖细胞中异常LIAS表达水平与上调的甘氨酸生物合成途径之间的相关性[2]，并且这种较高的表达与高乳腺癌死亡率相关[36]。LIAS产生硫辛酸，其是五种多酶复合物的活性所需的必需辅因子。这五种复合物包括四种2-氧代酸脱氢酶;即丙酮酸脱氢酶（PDH）、支链酮酸脱氢酶（BCKDH）、2-酮戊二酸脱氢酶（2-KGDH）和2-氧代己二酸脱氢酶（2-OADH）。这些复合物在以下方面发挥着重要作用：Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）1006989见图7。RPL9和LIAS在肺癌中的作用概述。RPL9和LIAS基因表达的增加可促进代谢、细胞存活和细胞增殖。通过p53的转录调节作用，这些促存活机制可能被抑制，从而导致细胞增殖减少和/或细胞死亡。RPL9和LIAS还可以通过抑制p53来促进代谢途径，例如糖酵解，p53起到增加氧化磷酸化的作用线粒体能量代谢[37]。第五种复合物是2-氧代酸脱氢酶复合物。此外，甘氨酸裂解系统（GCS）也在线粒体能量代谢中发挥重要作用[38]。通过增加的营养摄取和利用显示的代谢重编程已被认为是癌症的标志[36，39，40]。虽然各种研究已经揭示了rpl9和lias都作为细胞凋亡抗性基因并且在癌症中低甲基化，但是可能参与相似的生物学和病理生理学途径并且可能一起相互作用的基因及其产物并不奇怪。Wang et al.（2018）在PPI蛋白质网络中发现了RPL 9和p53，这些蛋白质在静脉血栓栓塞（VTE）中发挥作用值得注意的是，这两种基因在肺癌中的表达上调值得进一步研究，特别是通过核因子信号通路和甘氨酸生物合成通路。本研究有望成为肺癌潜在的生物标志物和5. 结论异常增殖的细胞如癌细胞更喜欢过量的葡萄糖摄取和较少的氧化磷酸化，这种情况称为Warburg效应[41]。为了快速增殖和一致的细胞存活，癌细胞需要重新编程代谢途径，特别是与包括脂质和蛋白质的大分子相关的代谢途径。RPL9和LIAS在蛋白质和脂质Meta中起重要作用。尽管Wang等人（2018）等几项研究使用生物信息学方法揭示了RPL 9和p53在血管疾病中的潜在相互作用，但缺乏p53-RPL 9/LIAS相互作用的实验和验证结果，需要进一步研究。在这里，我们提出，改变信号转导途径，有利于细胞的生存和减少整体氧化状态的细胞，是潜在的诱导RPL 9和LIAS的异常表达。这些蛋白质表达的改变可能有利于肺癌中不受控制的细胞增殖。此外，RPL9和LIAS似乎都发挥了重要作用。在肺癌中的促存活或抗凋亡作用。这些结果进一步证实了这些蛋白质在癌症进展中的重要性，通过它们与p53的预测相互作用，如图1B所示。7.第一次会议。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认我们要感谢国家卫生实验室服务（NHLS），Wits病理学系提供组织切片。附录A. 补充数据本 文 的 补 充 数 据 可 在 https ： //doi 网 站 上 找 到 。org/10.1016/j.imu.2021.100698。资金南非医学研究委员会（SAMRC）和国家研究基金会（NRF）资助了该项目。作者贡献Zodwa Dlamini-概念化，资金收购，写作，重新查看和编辑。形式分析，写作，审查和编辑。形式分析，写作，评论和编辑。Konstantinos SyrigosGeorgios Lolas-形式分析，写作，审查和编辑。Lebogang Mphahlele -形式分析，写作，审查和编辑。Zukile Mbita-形式分析，写作，审查和编辑。Z. Dlamini等人医学信息学解锁25（2021）10069810同意作者声明没有利益冲突，没有图像需要同意使用。引用[1] Fitzmaurice C等人，《全球癌症负担》，2013年。JAMA Oncol 2015;1：505-27.[2] BartaJA，et al. 全球肺癌流行病学85 .第85章.[3] Jemal A，et al. Global Cancer Statistics. CA CanccJ Clin 2011;61：69-90.[4] ThunMJ，et al. 美国吸烟相关死亡率的50年趋势新英格兰医学杂志2013;368：351-64。[5] YouldenDR，et al. 国际肺癌流行病学：地理分布和长期趋势。J Thorac Oncol2008;3：819-31.[6] Goss PE，et al. Challenges to effective cancer control in China，India，andRussia. 柳叶刀肿瘤学2014;15：489[7] Bearz A等人，HIV阳性患者的肺癌：GICAT经验。Eur RevMed Pharmacol Sci2014;18：500-8.[8] Travis WD，et al.国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会国际肺腺癌多学科分类2011;6：244[9] 3，026例肺腺癌中EGFR和KRAS突变的分子流行病学：女性对吸烟相关KRAS突变型癌症的易感性更高。临床癌症研究2012;18：6169-77。[10] 克梅托维奇英国电子烟的使用在两年内增加了两倍，调查发现2014;348。[11] PendharkarD，et al. 肺癌分子生物学研究进展。 印度外科肿瘤杂志2013;4：120-4.[12] ShiY，et al. 一项关于亚洲腺癌组织学晚期非小细胞肺癌患者EGFR突变的前瞻性分子流行病学研究（PIONEER）。J Thorac Oncol 2014;9：154-62.[13] BaikIH，et al. 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