多路生物传感诊断平台检测结直肠癌相关抗原自身抗体的新技术

工程7（2021）1393研究肿瘤诊断和治疗的新技术-文章多路生物传感诊断平台检测来自CRC细胞和组织释放的外来体的肿瘤相关抗原的自身抗体显示出对结直肠癌的Ana Montero-Callea，Itziar Aranguren-Abeigona，María Garranzo-Asensioa，b，CarmenPovesc，María Jesús Fernández-Aceñerod，Javier Martínez-Userose，Rodrigo Sanzc，JanaDziakovác，Javier Rodriguez-Cobosf，Guillermo Solís-Fernándeza，Eloy Povedanog，MariaGamella g，Rebeca Magnolia Torrente-Rodríguezg，Miren Alonso-Navarroa，Vivian de los Ríosh，J. Ignacio Casalh，Gemma Domínguezf，Ana Guzman-Aranguezb，Alberto Peláez-Garcíai，José Manuel Pingarrong，Susana Campuzanog，Rodrigo Barderasa，慢性病项目（UFIEC），卡洛斯三世健康研究所，马德里E-28220，西班牙b马德里康普顿斯大学光学和验光学院生物化学和分子生物学系，马德里E-28040，西班牙c西班牙马德里圣卡洛斯临床医院胃肠科，E-28040d西班牙马德里圣卡洛斯临床医院外科病理科，E-28040e西班牙马德里Jimenez Diaz基金会大学医院肿瘤健康研究所转化肿瘤科E-28040fAlberto Sols生物医学研究所医学院生物化学系，CSIC-UAM，Madrid E-28029，西班牙g马德里康普顿斯大学化学科学学院分析化学系，马德里E-28040，西班牙h西班牙国家研究委员会生物研究中心，马德里，E-28040，西班牙i分子病理学和治疗靶点小组，拉巴斯大学医院（IdiPAZ），马德里E-28046，西班牙A R T I C L EIN F O文章历史：接收日期：2020年2021年2月5日修订2021年4月27日接受在线提供2021年8月14日关键词：自身抗体诊断结直肠癌外泌体肿瘤微环境-体液免疫应答-护理生物传感器A B S T R A C T结直肠癌（CRC）是全世界癌症相关死亡的第二大原因CRC患者的5年存活率取决于诊断的阶段，当CRC在早期诊断时，存活率高于80%，但当CRC在晚期诊断时，存活率低于10%。已广泛证明患者血清中针对特异性CRC自身抗原（肿瘤相关抗原（TAAs））的自身抗体有助于早期诊断。[10]因此，我们的目标是通过液体活检的方式确定具有显著能力来区分CRC患者和健康个体的CRC特异性自身抗体最后，我们通过免疫沉淀结合质谱分析的方法检查了由5个CRC细胞系释放的外来体的蛋白质含量和来自CRC患者的组织样品。共有103种蛋白质被鉴定为对CRC特异的潜在自身抗原。经过生物信息学和荟萃分析，我们选择了15种最有可能成为CRC自身抗原的蛋白质，以便通过Western印迹（WB）和免疫组织化学（IHC）评估它们在CRC预后中的我们在患者的组织和血浆外泌体样本中发现了其中11种蛋白质的蛋白质水平失调，以及其中9种蛋白质与CRC预后的相关性。经过验证，除一个外，所有显示出统计学上显著的高诊断能力，以区分CRC患者和具有癌前病变的个体与健康个体，无论是通过发光Halotag基珠，还是通过涉及使用磁性微载体作为固体载体的多路生物传感平台，用共价固定Halotag融合蛋白修饰以进行CRC检测。综上所述，我们的结果突出了本文定义的方法在识别慢性疾病特异性TAAs方面的有效性;它们还表明，针对本文识别的TAAs的血浆自身抗体水平的测量可以集成到具有高诊断能力的CRC检测的床旁（POC）设备中©2021作者.由爱思唯尔有限公司发表于中国工程院和高等教育出版有限公司。这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。*通讯作者。*电子邮件地址：r. isciii.es（R. 理发师）。https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.04.0262095-8099/©2021作者。由爱思唯尔有限公司在中国工程院和高等教育出版社有限公司网站上发布。这是CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放获取文章。ScienceDirect上提供的内容列表工程日记本主页：www.elsevier.com/locate/engA. 蒙特罗-卡勒，我。阿朗古伦-阿贝贡，M. Garranzo-Asensio等人工程7（2021）139313941. 介绍性结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因[1，2]。超过60%的CRC患者在晚期被诊断出来，此时肿瘤已经扩散到淋巴结附近（III期）或远端器官（IV期），主要是肝脏和肺部。在这些阶段诊断CRC可使5年生存率分别降低至70%以下和10%以下，如果患者在早期诊断为CRC，则5年生存率可增加至80%以上[3]。目前用于诊断CRC的技术是侵入性的或对疾病没有特异性的，例如分别是结肠镜检查或粪便闭塞性血液试验。此外，目前的生物标志物可用于预后，但不能用于诊断，例如检测血浆样本中的癌胚胎抗原（CEA）[4，5]。因此，有必要允许新的生物标志物用于疾病的早期、特异性和非侵入性诊断。CRC从局限于肠粘膜的息肉（腺瘤）发展为腺癌（adeno-carcinoma）。首先，肿瘤进展至肠粘膜下层（I期），然后进展至固有肌层（II期）;最后，扩散至其他器官（III期和IV期）[4，6]。突变和表观遗传学和遗传学改变导致蛋白质改变和失调，贯穿CRC的不同阶段其中一些改变的自身蛋白成为肿瘤相关抗原（TAAs），在CRC患者中诱导体液免疫应答[7，8]。因此，抗TAAs的自身抗体（免疫球蛋白G（IgG））可用作生物标志物，用于通过液体活检的方法在其早期阶段特异性检测疾病[9，10]。在过去的几年里，已经出现了各种各样的蛋白质组学技术用于鉴定TAAs，重点是微阵列的使用，如噬菌体或天然和重组蛋白微阵列[11然而，这些技术受到在同一时间分析的样品的数量或印在阵列上的蛋白质的数量的限制。蛋白质阵列仅包括所有人蛋白质的50%-最近，我们开发了一种新的方法，通过使用来自CRC细胞的蛋白质提取物来鉴定TAAs来解决这些问题。该方法包括免疫沉淀法和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）程序的组合，随后进行外泌体是大小为30由细胞分泌。它们通过血液或淋巴囊介导周围细胞和位于远端器官中的细胞之间的细胞间通讯[15，16]。据报道，肿瘤衍生的外泌体（TDEs）参与癌症发展和转移的几个阶段，诱导上皮-间充质转化的激活、转移前间隙的形成和受体细胞免疫应答的由于TDEs在体液中的组成、功能和位置，TDEs是一个有趣的和几乎没有探索过的来源，用于识别应该是CRC特异性的TAAs肿瘤微环境（TME）包括癌细胞和各种驻留和浸润的宿主细胞、分泌因子和细胞外基质蛋白（EMT）。基质滋养癌细胞并促进肿瘤的发展、侵袭和转移。[10]此外，TME还有助于TAA表达和免疫细胞浸润的调节[20]。因此，对包含癌细胞和肿瘤基质的CRC肿瘤组织的分析应该能够识别在培养中癌细胞的分析中遗漏的肿瘤基质新抗原[14]。由于在电化学生物传感器和生物传感器方面取得了巨大进展在最近几年的生物传感方法中，这些技术作为非常合适的高性能和负担得起的工具正在艰难地获得基础。这些方法很容易操作，几乎不需要训练，并且它们可以进行多路复用和/或多组学训练。现场分析（即，现场分析）。在非实验室环境或资源有限的地区），以使用少量的真实世界生物样本和最短的可采取行动的时间提供准确和可靠的定量结果[21，22]。这些设备最近大多被用于探索癌症生物标志物，特别关注流行的和高死亡率的肿瘤，如CRC，以帮助在早期诊断和分期中使用传统的方法学[10][11]。仅在过去的两年中，基于电化学亲和性的生物传感器已经证明了鉴定CRC相关的转录生物标志物（microRNA）的独特机会;表观遗传生物标志物（即，5-甲基胞苷（5-mC）和5-羟基甲基胞苷（5-hmC）在DNA中的全局和区域水平以及RNA中的全局N6-甲基腺苷（m6 A），甚至具有单碱基敏感性）;和蛋白质组学生物标志物（即，与CRC的存在相关的蛋白质、受体或蛋白酶，以及参与肿瘤侵袭性和进展的缺氧和转移事件）[23]。在这里，我们的目的是通过使用免疫预印本（IP）和质谱法（MS）来研究CRC TAAs的两种互补和粗略研究的蛋白质来源的蛋白质含量，以增加具有诊断价值的CRC特异性TAAs的数量：①早期（I期和II期）CRC患者的TMS组织样本; ①晚期（III期和IV期）CRC患者的TMS组织样本;以及①具有不同转移能力的CRC细胞系分泌的exosomes。共有103种不同的蛋白质被鉴定为被来自CRC患者的IgGs特异性识别其中15个被进一步选择用于验证：①生物信息学和荟萃分析，以确定其潜在的失调和与CRC的关联;㈡血清活性试验，以检测其自身抗体，并使用不同阶段CRC患者、结直肠癌前病变个体和健康个体的血清作为对照来确定其诊断价值; ㈢蛋白质印迹（WB）和免疫组织化学（IHC），以分析其作为CRC预后标志物的作用。最后，开发了一种电化学生物传感多路复用平台，该平台被封装为能够检测血浆中所有这些自身抗体的床旁（POC）装置。2. 材料和方法2.1. 结直肠癌细胞系等基因CRC细胞系SW480和SW620从美国类型培养物收藏细胞库获得。同源细胞系KM12C、KM12SM和KM12L4a来自Fidler根据既定 方案，在 补充了10% 胎牛血 清（ FBS; Sigma Aldrich ，USA ） 、 1 × L - 谷 氨 酰 胺 （ Lonza ） 和 1 × 青 霉 素 / 链 霉 菌 素（ Lonza ） 的 Dulbecco 改 良 Eagle 培 养 基 （ DMEM; Lonza ，Switzerland）中培养CRC细胞2.2. 组织和血浆样本圣卡洛斯临床医院（马德里）卡洛斯三世卫生研究所的机构伦理审查委员会批准了这项关于生物标志物发现和验证的研究（CEI PI45）。 组织和血浆样本来自San Carlos Clinical Hospi- tal生物库，该生物库属于西班牙国家生物库网络，与欧洲区域发展基金FEDER基金共同资助，经机构伦理审查委员会批准后。获得了所有患者的书面知情同意书。使用标准化样本采集方案采集血浆和组织样本，并在-80 °C下储存直至使用[9，13，26]。对于IP，12份血浆样本来自术前获得的III期和IV期CRC患者，12份血浆样本来自结肠镜检查阴性且病理学未知的健康个体患者。A. 蒙特罗-卡勒，我。阿朗古伦-阿贝贡，M. Garranzo-Asensio等人工程7（2021）13931395×××××××表1本研究中使用的CRC患者和健康个体的血浆样本的信息。样品数量（n）年龄平均值± SD（年）年龄范围（年）性别（n）舞台男性女性我IIIIIIV血浆样本IP健康的个人1263.1± 20.835-8348----CRC患者1269.1± 8.756-8575--93血清反应性测定健康的个人3860.115.323-881424----低级别腺瘤个体化1961.8± 7.240-73116----高级别腺瘤个体化1760.7± 8.249-79136----CRC患者3870.3± 12.339-812216341516WB（外来体）健康的个人461.8± 8.352-7031----Premalignant伤害个体459.8± 14.738-7022----组织样本的数量CRC患者968.3± 7.361-85524122IP阶段CRC患者677.0± 9.060-862451--IP阶段CRC患者778.0± 8.265-8743--61WBCRC患者1774.3± 13.139-88985651ICHCRC患者7265.7± 8.741-824725-4365SD：标准偏差。所用（表1和表S1（附录A）），以及来自I-IV期CRC患者的13个光学μ m切割温度（OCT）化合物嵌入冷冻组织样本（对于发光和生物传感血清反应性试验，使用了来自术前获得的I-IV期CRC患者（n =38）、来自恶性肿瘤前病变（低度或高度腺瘤）个体（n = 36）以及来自结肠镜检查阴性且病理未知的健康个体（n = 38）的总共112份个体血浆样本（表1和表癌前病变和恶性结直肠病变由具有胃肠道病理学专业知识的病理学家按照国际推荐的标准进行评估。[10]根据发育不良的结构和细胞学分级，恶性病变被分类为低级别或高级别腺瘤中的一种。恶性转化也被注意到，并在杜克斯或菊池的系统之后分期来自17例I-IV期CRC患者的OCT嵌入冷冻肿瘤和配对非肿瘤组织样本2.3. 外泌体分离和纯化为了分离和纯化由CRC细胞分泌的外来体，每个细胞系接种8个175cm2细胞培养烧瓶（康宁，美国）。细胞在37 °C和5%二氧化碳（CO2）下生长至90%汇合。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）1×清洗细胞3次，并在37 °C和5%CO2下用20mL不含FBS的DMEM孵育1小时，以去除FBS和外源性外泌体。接下来，用PBS 1×清洗细胞三次，并用20 mL不含FBS的DME在37 °C和5% CO2下孵育48小时。 然后，从每个细胞系中离心160 mL条件培养基。在500g下，在4 °C下持续5分钟，以去除细胞碎片（颗粒），然后再次以2000 g在4 °C下离心10分钟，以去除大于1lm的囊泡（颗粒）。然后收集澄清和调节的介质并储存在-8 0 ° C 下直至使用。外泌体的纯化，然后通过差异离心法进行分离。将条件培养基以10，000 g离心（Beckman-Coulter超速离心机，XL-100 K，美国）在4 °C下30分钟，以去除尺寸为1 μ m的细胞外微泡（MV）。接下来，将条件培养基在4 °C下以100，000 g进一步离心70分钟，以进行外泌体沉淀。将上清液分离，将外泌体（颗粒）分 离 。重悬于最终体积1 mL PBS中，每细胞线1个然后，使用20 mL PBS1洗涤每个外来体制剂，并在4 °C下以100 000 g再次离心样品70分钟。最后，将上层清液分离，并将含有外来体的颗粒重悬于500μL或fPBS1×中，并储存在–80在IP之前分析了两份10L的样品以避免对样品进行连续冷冻和储存的问题。为了分离和纯化人血浆外泌体，首先将3 mL每个血浆样品在4°C下以17000g离心30分钟，以去除细胞外MV。最后一个是fil-通过0.22lm过滤器进行过滤，并采用超速过滤器进行再干燥在120，000 g下持续90分钟，用于外泌体收集（图附录中的S2A）。最后，将细胞培养外泌体样品在PBS 1中稀释至1：50至1：100 ， 将 人 血 浆 外 泌 体 样 品 在 PBS 1 中 稀 释 至 1 ： 1000 ， 并 使 用NanoSight NS300（Malvern Panalytical，United Kingdom）分析两者，以验证发生了外泌体的适当分离和纯化。2.4. 电子显微镜和低温电子显微镜。通过电子显微镜（EM）和冷冻电子显微镜（cryoEM）对外来体颗粒进行分析，并首先，将外来体样品在PBS 1和4%多甲醛中固定5分钟;将它们应用于发光放电的碳涂层网格5分钟，并用2%水溶性铀酰乙酸酯进行负染色。然后在配备有LaB6灯丝的FEI Tecnai 12电子显微镜上分析样品，该显微镜在120kV下操作。图像是用FEICeta数码相机记录的或者，通过cryoEM分析所指示的外来体制备物。为此，将外来体制备物收集在先前亲水化的Rhodium网格上，并将样品快速冷冻在乙烷中。然后使用在120 kV下操作的FEI Tecnai 12显微镜对样品进行分析。图像被记录在电荷耦合器件（CCD）1000 Gatan相机上。2.5. 蛋白质提取和定量CRC 细 胞 系 在 37 °C 和 5% CO2 下 生 长 至 90% 汇 合 ， 用 含 有 4mmol·L-1的乙二胺四乙酸（EDTA），在室温下以1200r·min-1离心5分钟进行收获。然后，将细胞重悬于500μL裂解缓冲液（放射性免疫测定法（RIPA）;Sigma Aldrich）中，并补充1-刺激酶和磷酸酶抑制剂（MedChemExpress，USA），并使用16号和18号仪器通过机械解离进行裂解A. 蒙特罗-卡勒，我。阿朗古伦-阿贝贡，M. Garranzo-Asensio等人工程7（2021）13931396××××××××××针头注射器（Needle Syringes）最后，将样品在10，000g和4 °C下离心10分钟，并将蛋白质提取物（上清）储存在本研究使用了来自OCT包埋的CRC组织样本的蛋白质提取物。首先，在干冰上将组织样品切成小块，并用500L或fPBS1清洗两次，其中在4 °C下以10，000 g离心5分钟，随后分离。然后将组织样品重悬于300μL或补充有1种蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA使用TissueLyser II（Qiagen，Hilden，Germany）进 行 机 械 裂 解（在30Hz下进行两次循环，每次2分钟）。接下来，200L或fRIPA补充1蛋白酶和磷酸酶抑制剂将其添加到每个样品中，并使用TissueLyser II再次对样品进行机械解聚集（在30 Hz下进行两次循环，每次2分钟）。最后，将样品在4 °C下以10，000 g离心10分钟，并储存蛋白质提取物（上清）。在-8 0 ° C 下 使 用 。通过Trp定量测定方法[27]，并在还原条件下通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-AGE）后通过考马斯蓝染色进行证实使用MicroBCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，USA）定量外来体样品的蛋白质浓度，并在10% SDS-Page后通过Coomassie蓝染色和WB确认。对于SDS-Page，用补充有0.15%b-硫醇乙醇（5）的加载缓冲液裂解外来体。在冰上5分钟和在95 °C下5分钟的循环）。对于IP，外来体用补充有1-蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA通过机械解聚集的方式裂解它。然后将样品在4 °C下以10，000 g离心10分钟，收集蛋白质提取物（上清）并储存至使用。2.6. SDS-AGE和蛋白质印迹通过考马斯亮蓝染色和WB分析蛋白质表达。在还原条件下使用10%SDS-Page分离每种蛋白质提取物5μg，然后转移至硝基-细胞膜在100V下保持1小时。在室温下用0.1% Tween PBS 1补充3%撇去的牛奶（阻断缓冲液）阻断膜1小时，然后在4°C下用优化稀释度（表S2）的一抗体在阻断缓冲液中过夜（O/N）并摇动。接下来，用0.1% TweenPBS清洗膜三次。1并与适当指示的马过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体（附录A中的表S3）孵育，该第二抗体在室温下在封闭缓冲液中稀释1小时，同时摇动。然后用0.1% Tween PBS洗涤膜三次。使用PCL Pico Plus化学发光试剂（Thermo Fisher Scientific）开发信号，在Amersham成像仪680（GE Healthcare，USA）上检测。用ImageJ软件对蛋白质条带强度进行定量，并根据相应条带的总蛋白质含量进行标准化（PonceauRed staining，Sigma Aldrich）。2.7. 免疫沉淀作用对于包含在外来体中的蛋白质的IP，使用总共200μg或每种外来体蛋白质提取物（1 mg总蛋白质），其中2 mg的总等分子蛋白提取物用于CRC TME组织的研究（阶段I-II和阶段III-IV，分别为9月蛋白质池通过与以下物质孵育进行预清洁：20L或f蛋白G琼脂糖珠（SCBT），预处理和平衡用RIPA，在4 °C下旋转1小时。首先，来自III期和IV期CRC患者（n= 12）血浆样本池和来自III期和IV期CRC患者血浆样本池的健康个体（n= 12）被隔离（表1和表S1）。将200μL或f蛋白G琼脂糖珠分别与50μL或f每组血清和350μL或f200mmo l·L-1磷酸钠在pH 7.0下孵育90分钟。珠子被洗了两次。用1 mL 200 mmol·L-1磷酸钠在pH 7.0下孵育5分钟，并再次与另一个 50mL或f 每 组 血 清 和350mL或f200mmol·L-1 磷酸 钠 在pH7.0下孵育90分钟。然后，The珠子是的洗过的四时代与1mL的200mmol·L-1磷酸钠，pH 7.0，持续5分钟。最后，用 pH 2.7 的300μL或f0.1mol·L-1甘氨酸洗脱结合的IgGs两次，持续4分钟。用pH 8.8的30μL或f1mol·L-1Tris缓冲液中和洗脱的蛋白质，并用Nanodrop 2000 C（Thermo）定量浓缩的或分离的IgG。费希尔科学公司）。接下来，如前所述，将来自CRC患者和健康个体作为对照的分离IgG与蛋白G琼脂糖珠共价结合[14]。Inbrief，100lLof珠子先前平衡-在含有150mmol·L-1 NaCl的100mmol·L-1 Tris-HCl中pH值7.4（TBS1）将其与200μg或f从CRC患者或对照中分离的IgG在TBS 1中分别孵育2小时。 接下来，用TBS 1清洗珠粒，并孵育三次。用200 mmol·L-1三乙醇胺在pH 8.9（Sigma Aldrich）下孵育5分钟，以从先前的缓冲液中去除所有痕量的Tris。之后，用含有50mmol·L-1二甲基戊二酸酯（DMP，Sigma Aldrich）的200 mmol·L-1三乙醇胺在pH 8.9下孵育两次，持续1小时，以检测有效的IgG-蛋白G交联。然后用200mmol·L-1三乙醇胺在pH 8.9下洗涤珠，并用乙烷胺（Sigma Aldrich）封端15分钟。最后，用含有2mol L-1 尿 素的0.1mol L-1甘氨酸在pH 2.7下洗涤非交联IgG珠两次，持续5分钟，并在与蛋白质提取物孵育之前用RIPA平衡珠。最后，将预清洁的蛋白质提取物与蛋白质G珠在4 °C下与O/N对照的IgGs共价结合并旋转，随后与蛋白质G珠在4 °C下与CRC患者的IgGs共价结合并旋转。与蛋白质提取物孵育后，用TBS 1清洗珠粒11次，用来自对照组和CRC患者的IgG重新结合的用100lL或f0.1mol l·L-1甘氨酸在pH2.7下洗脱两次，持续5分钟。用2mol·L-1 ammo-中和洗脱的蛋白质碳 酸铵 （ABC ） 缓冲 液 pH 8.0， 使用 Nanodrop 2000C （ ThermoFisher Scientific）定量蛋白质浓度。所有孵育物均在室温下破碎，并通过在13 200 r·min-1和4 °C下离心5分钟的方法除去所有上层清液。在10% SDS-Page后通过考马斯亮蓝或银染色进行分析（附录A中的图S2）。2.8. 液相在免疫沉淀的洗脱蛋白中，50%通过10% SDS-Page分离，并用考马斯亮蓝G-250染色。然后，将整条车道切成小块，分别用50 mol·L-1ABC/50%腈（ACN）脱染，用ACN脱水，干燥。 然后用10 mol·L-1二硫苏糖醇（DTT）在25 mol·L-1ABC中还原样品，并用碘乙酰酰胺烷基化至最终浓度为50 mol·L-1。接下来，将凝胶片干燥，用12.5ng·mL-1 猪 胰 蛋 白 酶 （ Thermo Fisher Scientific ） 在 50 mol·L-1ABC中复溶，并在37 °C。使用100% ACN和0.5%TFA提取肽，使用带有0.6l或fC18树脂（Millipore，Sigma Aldrich Química SL，Spain）的Zip Tip纯化，并干燥。最后，样品在5lL或f0.1%甲酸/2%ACN中复溶。A. 蒙特罗-卡勒，我。阿朗古伦-阿贝贡，M. Garranzo-Asensio等人工程7（2021）13931397×××生物研究中心（CIB-CSIC，西班牙）蛋白质组学和基因组学设施中的纳米LC-MS/MS分析肽分离在Easy-nLC 1000纳米系统（Thermo Fisher Scientific）上进 行 。 为 了 进 行 分 析 ， 将 样 品 加 载 到 Acclaim PepMap 100 预 柱（Thermo Fisher Sci-entific）中，并在50 cm长的RSLC PepMapC18中进行洗脱，其中内径为75lm，颗粒尺寸为2lm（Thermo）费希尔科学公司）。移动相流速为300nL·min-1使用0.1%甲酸水溶液（溶剂A）和0.1%甲酸和100% ACN（溶剂B）。梯度曲线设置如下：5%-35%溶剂B 90分钟，35%-100%溶剂B 4分钟，100%溶剂B 8分钟。每种样品进样4微升。使用Q-Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行MS分析。对于电离，使用1900V的液体结电压和300 °C的毛细管温度。该全扫描方法采用m/z 400 -1500质量选择，Orbitrap分辨率为70，000（m/ z 200），目标自动增益控制（AGC）值为3e 6（即，3 106），最大注入时间为100 ms。在勘测扫描之后，选择15个最高强度的离子用于MS/MS碎片化。用27 eV的标准化碰撞能量穿透碎裂，并且用m/z200的起 始 质 量 、 2 e5 的 AGC 目 标 （ 即 ， 2 105 ） ， 分 辨 率 为 17 ， 500（m/z200），强度阈值为8 e3（即，8 103），隔离窗口为2.0m/z单位，最大IT为100 ms。电荷状态筛选能够拒绝未分配的、单电荷的和等于或大于7个质子化离子。使用20秒的动态排除时间来区别对待先前选择的离子（100秒）。2.9. Mess-Specrometry数据分析使 用 蛋 白 质 组 发 现 器 （ 版 本 1.4.1.14 ） （ Thermo FisherScientific）使用标准化工作流程分析MS数据。Mass Spectra *.raw文件针对SwissProt_2016_10.fasta进行了搜索，人智人（人）使用Mascot搜索引擎（版本2.6，Matrix Science，United Kingdom）检索数据库（20，121个序列蛋白条目）。前体和裂解物的质量耐受性分别设定为10 ppm和0.02 Da，允许两个缺失的裂解，半胱氨酸的氨基甲酰胺甲基化作为固定修饰，N-末端的甲硫氨酸氧化和乙酰化作为可变修饰。使用q值阈值为0.01的Percolator算法[28]2.10. 生物信息学和元分析使用亲和纯化MS数据库（CRAPome）的污染物残留物对鉴定为CRC特异性潜在自身抗原的蛋白质进行了首次筛选[29]。在该数据库中报告的IP实验中出现超过15%的蛋白质，从进一步分析中排除。然后，对蛋白质进行分析。利用TheSTRING（版本11.0）和DAVID（版本6.8）数据库，用于研究蛋白质富集和识别涉及这些蛋白质的改变的网络和途径[30STRING设置被固定为马尔可夫聚类算法（MCL）聚类丰富度- ment 2和置信度分数0.4。通过分析与CRC相关的遗传改变以前是否与这些蛋白质相关，对所选蛋白质进行了广泛的荟萃分析。为此，使用了UALCAN[33]和cBioPortal[34]数据库，因为它们分别提供了关于CRC和配对健康组织样本之间基因表达失调和肿瘤组织样本中鉴定的遗传改变的信息。除此之外，infor-使用来自人蛋白质图谱[35，36]和GEPIA 2[37，38]的信息，分别使用最佳临界值或四分位数检查先前鉴定的蛋白质是否与CRC患者的预后2.11. 免疫组织化学（ImmunoOrganochemistry）对 于 MHC 分 析 ， 使 用 手 动 组 织 阵 列 -1 （ MTA-1 ） 组 织 阵 列（Beecher Instruments，USA）构建包含来自72例CRC患者的88个核心样本的组织微阵列（附录A中的表1和表S4每个细胞核（直径：1mm）从预先选择的肿瘤区域穿刺至近端。嵌入式和D型组织。 染色是在2lm的部分进行的。幻灯片通过在60 °C下孵育15分钟进行去石蜡化，然后在 PT-Link （ 丹麦 ） 上 ，在 95 °C 的 低 pH 缓 冲溶 液（ EnVisionFLEX Target Retrieval Solution，Dako，丹麦）中孵育20分钟。为了阻断内源性过氧化物酶，用过氧化物酶阻断剂（Dako）孵育载体。使用指示抗体的优化稀释液，在4°C下过夜孵育活检组织（表S3）。将组织与适当的抗-Ig-horseradish过氧化物酶结合聚合物（EnVisionFLEX-HRP，Dako）孵育以检测抗原抗体所有抗体和抗Ig-HRP-conjugated抗体均表现出高特异性，且这些抗体均未产生阳性结果。然后用3，3-O-二氨基联苯胺作为显色剂对切片进行7分钟显色，并用血色素进行复染。根据既定方案[14，39]，对可视化和免疫反应性进行了检测。2.12. 网关克隆和蛋白质表达含有TP 53、TGM3、ACTR3、PSPH、MT-CO2、SPDL1、HMGCS2、CYB 5 R1、RAB 25、FABP 5、SDF 2L1、S100 A8、SERPINB 12、SER-的序列柔性pDONR 221、pDONR 223或pENTR 223载体系统中的PINB3 、 RAB 2A 和 DEFA 1 基 因 从 公 开 可 用 的 DNASU 质 粒 库（https://dnasu.org/DNASU/Home.do）获得[40]。随后，按照制造商的说明，将开放阅读框（ORF）转移到pANT7_cHalo载体中，通过LR克隆酶反应（Invitrogen，USA）进行体外表达，以获得表达为融合蛋白的全长蛋白质，在TOP10大肠杆菌（E.用LR反应的产物转化大肠杆菌）细胞以分离感兴趣的表达质粒（质粒）。根据制造商的说明，使用Miniprip（Neobiotech，USA）纯化供体和表达质粒，并在使 用 1 步 人 偶 联 IVT 试 剂 盒 海 拉 细 胞 裂 解 物 （ Thermo FisherScientific）表达融合蛋白。toThe制造商的发光度说明书免疫测定法。如前所述，WB分析蛋白质表达，使用每孔0.67L或f蛋白质表达，a老鼠单克隆主要的抗体抗Halotag（1/2500，Promega ， USA ） 和 HRP-labeled 山 羊 抗 小 鼠 （ GAM ， SigmaAldrich）作为第二抗体。2.13. 血清反应性发光测定法p53、TGM 3、ACTR 3、PSPH、MT-CO2、SPDL 1、HMGCS2、CYB 5 R1、RAB 25、FABP 5、SDF 2L 1、S100 A8、SER-的血清反应性PINB 12 、 SERPINB 3 、 RAB 2A 和 DEFA 1 蛋 白 通 过 基 于 发 光Halotag珠的免疫测定进行分析，如先前所述[42后续行动The制造商的指示。第一，MB在500lL或f清洗缓冲液中平衡三次(0.1%吐温20，0.05% Triton X-100，PBS 1×），室内5分钟A. 蒙特罗-卡勒，我。阿朗古伦-阿贝贡，M. Garranzo-Asensio等人工程7（2021）13931398××××在温度和旋转下。然后，将体外表达的蛋白质与MB O/N在4 °C下旋转孵育，比例为0.67Lof蛋白和0.5LofMB悬浮液。每次反应，最终体积为600lL或fPBS1。在添加中，96孔板（Bio-Plex Pro平底板，Bio-Rad，USA）用300L或0.1%吐温PBS1封闭。在4 °C和120 r·min-1下补充3%牛血清白蛋白（BSA）O/N。在蛋白质固定化之后，MB被洗涤三次。在室温下旋转清洗缓冲液5分钟，然后在室温下旋转用SuperBlock阻断缓冲液（Thermo Fisher Scientific）阻断1小时。之后，MB被转移到96孔板（Bio-Plex Pro平底板，Bio-PlexPro平底板）。Rad），并分别与50l lL或f的112在0.1%吐温PBS 1中以1/400稀释的血浆样品补充-在4 °C和150 r·min-1下用3% BSA O/N处理（表1和表S1）。接下来，将孔清洗三次，并用50μL或fHRPs标记的抗人IgG第二抗体（ Dako ） 孵 育 ， 在 补 充 有 3% BSA 的 0.1% 吐 温 PBS 1 中 稀 释1/3000，在室温和150 r·min-1下孵育1小时。最后，对孔进行三次冲洗，并使用PCL Pico Plus化学发光试剂（ThermoFisher Scien-tific）产生信号，并记录在Spark多模式微孔板阅读器（Tecan Trading AG，Switzerland）上。作为试验的对照，将用融 合 蛋 白 共 价 固 定 的 MBs 与 抗 Halotag 抗 体 和 适 当 的 HRP-conjugated第二抗体孵育（表S3）。2.14. 血清反应性生物传感测定法用于血清反应性生物传感测定的方案之前已被报道和优化[41，42]，因此此处对其进行了跟踪。蛋白质在体外表达，锚定于MB，并与血浆样品孵育[41，42]。为了验证正确的蛋白质免疫活化，用抗Halotag单克隆抗体（Promega）检测Halotag融合蛋白，然后用1/3000稀释的HRP-conjugated抗小鼠IgG（Sigma Aldrich）孵育1小时。在氢醌（HQ）/H2 O2系统存在的情况下，使用可处置的丝网印刷碳电极进行电流测量，碳电极位于工作电极上携带免疫复合物的MB的磁捕获上方[41，42]。生物识别事件通过HQ介导的H2O2酶还原（HRP）产 生 的 阴 极 电 流 变 化进行监测，并在-0.20 V（相对于Ag假射频电极）下测量2.15. 统计分析[编辑]使用Microsoft Excel 2019和GraphPad Prism 5 pro-gram获得图、平均值、平均值的标准误差和t检验。使用R（v3.6.2，Austria）计算非参数Mann-WhitneyU检验值。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。使用ModelGood和Epi软件包，用R （v3.6.2）构建受体操作特性（ROC）曲线，以确定每个蛋白质单独或组合的诊断能力。3. 结果在这项工作中，我们分析了CRC TDEs和TME作为互补的和粗略分析的来源，以识别CRC特异性TAAs，这可能是用于早期检测这种疾病。对于TAAs的鉴定，我们使用了最近描述的方法，包括IP和LC-MS/MS的组合，使用外来体和CRC肿瘤组织，随后进行血清反应性测定[14]。用于TAA鉴定的外泌体是从作为原发性肿瘤模型的SW480和KM12C CRC细胞的分泌体，以及作为CRC转移模型的SW620、KM12SM和KM12L4a细胞的分泌体，分别转移到淋巴结、肝脏和肝脏和肺。从不同阶段患者的血浆样本中分离出的CRC组织样本和外泌体被用于验证TAAs在疾病过程中的失调性[10]。最后，我们将TAAs整合到基于Halotag技术的电化学免疫传感平台中，以构建POC设备，用于区分CRC患者和携带癌前病变的个体与健康个体[41，42]。图1详细说明了本研究的工作流程。3.1. CRC细胞系分泌的外泌体的表征（英文）由CRC细胞释放的细胞外囊泡是通过条件培养基的差异离心来