肝细胞癌（HCC）的微流控介电电泳（DEP）技术以及细胞凋亡的区分及应用

3R工程科学与技术，国际期刊25（2022）100990完整文章细胞毒药物Sakunie Sawaia，Nursyahirah Ahmad Shukria，Mas Sahidayana Mohktara，Wan Safwani Wan Kamarul Zamanba马来西亚吉隆坡50603马来亚大学工程学院医学工程创新中心b马来西亚吉隆坡50603马来亚大学工程学院生物医学工程系阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2021年3月16日修订2021年4月19日接受2021年5月08日网上发售保留字：肝细胞癌（HCC）介电电泳（DEP）细胞凋亡微流控技术A B S T R A C T肝细胞癌（HCC）的一个主要缺点是缺乏对异常肝细胞检测的进展本研究的目的是利用微流控介电电泳（DEP）技术区分恶性细胞和正常细胞，以及凋亡细胞和活细胞。在用植物基细胞毒性剂葡甘聚糖（KGM）处理后，进行活的和非活的HCC细胞的区分。人正常肝（WRL68）细胞的DEP分析这种广泛的介电差异是由于HepG2细胞中的致瘤性改变暴露于细胞毒性剂显示从负DEP到正DEP的显著转变，表明细胞毒性诱导的膜负性降低结果表明DEP方法在癌症筛查中的可行性©2021 Karabuk University. Elsevier B.V.的出版服务。这是CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍据世界卫生组织（WHO）报道，近年来，肝癌已成为全球第四大癌症死亡原因[1]。肝细胞癌（HCC）是肝脏恶性肿瘤的主要形式。HCC患者的预期寿命取决于诊断时的癌症阶段。早期发现肝癌有助于提高生存率和增加干预机会[2]。然而，大多数诊断方法未能检测到异常的肝细胞，直到它们变成恶性和转移，导致HCC的晚期诊断目前肝癌的诊断血清学标志物甲胎蛋白（AFP）是HCC检测中常用的生物标志物.尽管如此，血清学检测缺乏特异性和敏感性，这可能导致假阳性结果，因为AFP在其他情况下也高度表达，如肝炎、酒精性肝硬化和妊娠[3]。更先进的技术，如计算机断层扫描（CT）扫描和一种具有成本效益的工具，以取代目前的实验室为基础的诊断方法被认为是至关重要的。因此，在本研究中，使用基于介电泳（DEP）的微电极区分HCC细胞与正常肝细胞，然后在用细胞毒性剂葡聚糖（KGM）处理后区分存活和非存活HCC细胞[5]。DEP是一种微流体技术，其允许基于细胞膜电荷的差异来区分和分离细胞。当施加非均匀电场时，介电颗粒或细胞变得极化并经历介电泳力，该力驱动细胞朝向或远离DEP微电极的负场区域移动，称为DEP效应。细胞的运动是细胞与其悬浮介质之间极化率差异的结果[6]。颗粒位移的大小与施加在球形颗粒上的DEP力（FDEP）相关，可以表示为等式（1），磁共振成像（MRI）是高度敏感的，可以在早期发现异常，但这些技术FDEP 1/2preoemRejKxjrE2;1贵[4]。 因此，开发一种快速、可靠、*通讯作者。电子邮件地址：mas_dayana@um.edu.my（M.S.Mohktar）。由Karabuk大学负责进行同行审查其中r是粒子的半径，eo是自由空间的介电常数，em是介质介电常数，是施加电场E上的Del算子（梯度），Re [K（x）]是克劳修斯-莫索蒂因子的实部The Clausius–Mossotti分析了两种介质的介电常数之间的关系并定义为方程（2），https://doi.org/10.1016/j.jestch.2021.04.0092215-0986/©2021 Karabuk University.出版社：Elsevier B.V.这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程科学与技术国际期刊杂志主页：www.elsevier.com/locate/jestchS. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009902Xð Þ¼;ð Þ-≥1/4EFF¼eωr11212 ;4002R1-e1-e2=e12e2Kxepω-emω2epω2emω其中ep * 和em * 分别是颗粒和介质的复折射率。介电常数是一种静态特性，意味着-确保电介质材料的电阻（在这种情况下，粒子或介质）。由于粒子和介质的折射率都是电场角频率的复函数，因此它们被称为粒子和介质的复折射率[32]。复介电常数由等式（3）给出，eωe-jr;3其中e是介电常数，x是角频率，j是1的平方根，r是电导率。因此，颗粒的介电常数和电导率可以从测量中导出作为频率函数的粒子运动[8]。DEP力表达式（等式（1））对于均匀球体的介电泳力成立。由于生物细胞由具有不同极化率的细胞质和细胞膜组成，因此它们不是同质的。因此，必须对方程进行修改。最常见的方法是将模型分成半径逐渐增大的同心球。每个球体都是悬浮在介质中的均匀粒子，介质具有下一个最大球体的特性。该模型的最简单形式，即整个粒子的有效复介电常数是每个单独球体的特性的组合。内外球的有效复介电常数可以用一个表达式来表示，该表达式结合了每个球体的特性，有效地从模型中删除了同心球，并用组合壳代替[33]。这由等式（4）给出。.r232..eωeω=eω2eω膜，这是在癌细胞中高度可观察到的特征由于DEP基于表面形态学区分细胞，因此DEP在识别早期癌细胞和区分具有不同电生理特性的两种不同细胞方面具有很大的诊断潜力[32]。有几项基于细胞的癌症研究利用微流体技术进行癌细胞检测、分离、分析和富集[7]。迄今为止，在微流控装置中使用DEP被广泛用于操纵和分析在施加非均匀电场时细胞中的电生理变化。癌症研究中最早的DEP分离之一是由德克萨斯大学的Gascoyne和他的团队于1997年进行的。该研究旨在从血液中分离乳腺癌MDA-231细胞，通过DEP电极有效保留MDA-231细胞，同时在80 kHz信号频率下将血细胞与电极一起洗脱[34]。Antfolk et al.（2017）将DEP集成到电活性微孔阵列（EMA）中，用于从外周血单核细胞（PBMC）组分中分离前列腺癌细胞（DU 145）在进入EMA芯片之前，靶细胞被预先对准并与不需要的细胞分离将分离的靶细胞浓缩并基于各自的介电性质收集在EMA芯片中的特定DEP介导的微孔在10.7V的电位和5MHz的恒定信号频率下，在DEP微孔中分离并回收了71%的DU 145细胞，PBMC污染率低至0.03%。DEP集成EMA高度适用于单细胞形式的癌细胞的无标记直接分离和鉴定，因为它有效地消除了样品损失发生率和污染率[33]。在另一项研究中，Yafouz等人（2016）根据DEP装置检测到的交叉频率区分登革热感染的肝细胞WRL68和未感染的肝细胞交叉频率是负DEP（n-DEP）和正DEP（p-DEP）力的净平衡导致细胞保持停滞的频率。使用微阵列点电极进行DEP实验。结果表明，登革感染的正常肝WRL68细胞的交叉频率显著降低在健康的同行中，从220 kHz增加约36%1有效二、R-3.. ωωΣω ωΣ140 kHz。这表明DEP在直接表征中的能力-仅通过细胞电泳检测细胞感染前和感染后的变化，其中下标“eff”指的是有效复介电常数。下标因此，克劳修斯eω1effeω3国际地位[13]。在最近的一项研究中，Zhao等人（2019）开发了一种交流DEP（ac-DEP）设备，该设备允许基于细胞的介电特性连续分离和表征活的和死的酵母细胞。活酵母细胞在较高频率（≥100kHz）下经历n-DEP行为，并向kxeω2eω;5大孔处电场较弱，而死酵母细胞经历了p-DEP力，并向小ori移动，其中下标“3”对应于悬浮介质。因此，膜和细胞质的电导率和介电常数值可以通过曲线拟合模型来确定，数据[33]。每单位面积的有效膜电容（CEFF）由等式（6）给出。电场不均匀性最强的区域[37]。Ettehad和Wenger（2021）的另一项研究表明，和死酵母细胞分离在100 kHz和小于1000kHz使用互补酵母细胞由于缺乏介电常数而保持在p-DEP区域，Ce2r2- r1ð6Þ与其悬浮缓冲液相比，其电导率降低，而活酵母从p-DEP通道排出[38]。CEFF是细胞膜的介电常数和厚度的函数。据估计，一个完全光滑的细胞膜具有约6 mF m-2的值[33]。CEFF假设具有光滑膜的球体，因此通过膜折叠增加表面积将导致表面的不均匀性。CEFF值的增加因此，由此可见，CEFF也是高的CEFF值与细胞中大量的水泡、褶皱、皱褶和微绒毛在微观水平上施加电力使我们能够根据细胞的电表型来识别细胞上产生的力。这在基于电导率和介电常数确定细胞的电特性时是有用的，主要是通过它们的总净电荷和极化率。此外，电表型与细胞中的生物学变化相关，例如在细胞坏死和坏死期间[8]。因此，组织电导率在确定电磁能量在组织上的位移时是有价值的。1有效3eωS. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009903细胞膜，并可能能够诊断区分正常和肿瘤细胞[9]。2. 材料和方法2.1. DEP装置在[10]中介绍了本研究中使用的DEP装置，其中该装置由5层组成，包括顶层和底层、制造的镀金载玻片微电极、间隔物和夹在其间的氧化铟锡（ITO）层。简而言之，有16个点充当颗粒的通道。单个点具有200m m的内径和300m m的外径。16个点被聚类为4组，每组4个点，每组具有用不同信号频率同时激励的能力间隔物是包含用于毛细流体流动的微通道的微流体垫圈。ITO玻璃载玻片充当反电极，其透明性最适合于基于DEP的实验的细胞的显微镜监测。DEP微电极的中空中心圆形几何形状使光能够穿过并易于对细胞运动进行显微观察。感应偶极子与非均匀电场的相互作用将导致DEP的发生。DEP力的强度和方向当细胞比介质更易极化时，细胞的运动将在高场强区域的方向上并被吸引到电极边缘。这被称为阳性DEP（p-DEP）。另一方面，如果细胞比悬浮介质更不易极化，则细胞将远离高场强区域移动并被排斥远离电极。这被称为负DEP（n-DEP）。此外，如果细胞的极化能力等于介质的极化能力，则来自高场强区域的吸引力和排斥力将彼此抵消，并且细胞将保持静止。发生这种情况的频率称为交叉频率（fCROSS，fC，fX或fX0）[32]。这些现象表明，在这项研究中使用的DEP微电极的负面性质。细胞相对于DEP的运动如图所示。1.一、在图1（a）中，在施加电信号之前，细胞均匀分布在虚线区域上，其中没有DEP效应。该状态被称为参考状态，其将用于分析施加电信号之前和之后之间的差异。在图1（b）中，其显示随着细胞向电极边缘移动到具有较高电场梯度的区域在这种状态下，细胞正在经历p-DEP.在图1（c）中，细胞被收集在中心，其中电场梯度处于最低水平，细胞正在经历n-DEP[10]。2.2. 细胞培养所有细胞培养工作均在严格的无菌条件下在层流组织培养罩中进行，并遵循美国典型培养物保藏中心（ATCC）的标准细胞培养方案。新鲜制备用于细胞培养的完全生长培养基（CGM），其中Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与热灭活的10%胎牛血清（FBS）以10：1的比例混合。将含有人正常肝（WRL 68）和肝癌（HepG 2）细胞系（获自马来亚大学医学院分子医学系）的小瓶通过在水浴中轻轻搅拌立即解冻在37 °C下保持1分钟。然后将小瓶从水浴中取出，并用70%乙醇进行去污。将解冻的冷冻保存的细胞悬液（1mL）转移到含有4mLDMEM的无菌离心管中，并以1，500rpm离心10分钟以除去冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）.弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于1 mLCGM中。将细胞悬液转移至含有4 mL CGM的无菌25 cm 2培养瓶中，并在37 ℃下于5%二氧化碳（CO 2）培养箱中孵育。每天在相差倒置显微镜下观察细胞汇合情况、形态学和培养基条件。2.3. 用于形态学评价和DEP分析的在形态学评价中，制备浓度范围为1 - 5 mg/mL的细胞毒性剂KGM，用CGM将10 mg/mL的初始储备液稀释至1 mL的最终体积本研究中使用标准化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）作为阳性对照，浓度为2 - 10mg/mL，每个浓度用CGM从20mg/mL的初始储备液稀释至最终体积1 mL对于DEP分析，从我们先前研究[5]中细胞活力百分比对浓度的图中获得的KGM和5-FU的半数最大耐受浓度（IC50）用于处理HepG 2细胞。将贮备液制备至最终体积2 mL。2.4. 形态分析将约1×104的HepG2和WRL 68细胞接种于12孔板中，在37 °C、5%CO2培养箱中培养24 h。然后用所有浓度的药物处理细胞，KGM和5-FU的混合物，并进一步孵育24小时。的观察处理后的形态学变化，并在24小时时使用NikonECLIPSETi-S倒置显微镜捕获图1.一、DEP效应的图示：（a）在施加电信号之前，细胞均匀地分布在虚线区域上;（b）在经历p-DEP效应之后，细胞移动到虚线区域的边缘;（c）经历n-DEP并且在虚线区域的中心收集的细胞S. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009904×××2.5. 显微DEP分析将WRL68细胞以100 μ l接种到无菌6孔板的一个孔中。2 ×106细胞/孔，而剩余的3个孔用相似体积的HepG 2细胞接种。将WRL68和一孔HepG 2细胞不处理，其余孔的HepG 2细胞分别用各处理的IC50 ： 4.00mg/mL 5-FU （ 阳 性 对 照 ） 和 3.60mg/mLKGM 处 理 ， 在5%CO2培养箱中孵育24 h。在我们之前的研究中，从细胞活力百分比对浓度的图中获得半最大抑制浓度（IC50）[5]。处理后，将细胞悬浮液预悬浮，但将细胞沉淀物重悬于DEP培养基中用于DEP分析。通过将12.7g D-甘露醇溶解在250 mL去离子水中来制备DEP培养基。然后使用无菌巴斯德移液管将100 mM氯化钾（KCl）溶液小心滴入D-甘露醇溶液中，直至培养基电导率达到100m S/cm。100 m S/cm的低电导率允许 电 池 经 历 正 和 负 DEP 效 应 。 如 果 DEP 介 质 的 极 化 率 高（>100mS/cm），则细胞将仅经历一种DEP效应（正或负），这取决于细胞和悬浮介质之间的相对极化率。将约10mL（2 × 104个细胞）细胞悬浮液加载到DEP装置的间隔物应用相差倒置显微镜技术观察DEP作用前后细胞的运动情况使用Nikon ECLIPSE Ti-S显微镜照相软件捕获原始细胞位置（前电流细胞图像）然后将金微电极和ITO（接地电极）连接到函数发生器GFG-8255 A（Good Will Instrument，Taiwan），其向DEP装置提供20 Vp-p正弦电信号以产生DEP所需的非均匀电场和在小于5秒内的更快微粒响应[8]。内径为200μ m的微米级DEP电极并且在本研究中使用的外径为300μm，为细胞聚集提供了大的捕获区域，并且不需要高驱动电压。这有助于降低温度升高并防止焦耳加热造成的损坏[8]。使用220 kHz的人肝细胞系WRL 68的DEP交叉频率[13]作为标准频率，以确定治疗前后DEP对肝细胞癌细胞系HepG2的影响DEP交叉频率是指细胞响应于DEP力而不在相差倒置显微镜下放大4倍观察DEP作用下细胞的运动，并拍摄后电流细胞图像2.6. MATLAB DEP图像分析细胞经历的DEP力不能使用显微镜分析直接因此，为了进一步评估每个细胞的DEP效应，使用MATLAB分析从实验获得的显微图像以确定总黑色像素并量化DEP效应。图像中的总黑色像素表示微电极区域的点中心中存在的细胞数量将显微图像分割成感兴趣区域（ROI），其中DEP微电极的点区域[14]。点区域被分割成正方形形状，其尺寸为90所有图像的90像素。然后，通过使用MATLAB软件（Mathworks，Natick，MA，USA）中的内置函数“im2bw”将分割的图像转换成由黑白对应物组成的二值图像。该函数接受两个参数，图像本身（格式为无符号整数）和一个“水平”值。使用Otsu方法确定“水平”值，其中选择阈值（范围从0到1）。然后使用该值来确定强度级别边界，其中任何小于值的值都转换为（黑色）和任何更多的是最后，通过使用MATLAB计算每个图像的黑色像素3. 结果3.1. 处理前正常（WRL68）和癌性（HepG2）肝细胞的形态如图2（A）所示的WRL68细胞显示出其以多边形顺序排列的明确的上皮结构部分细胞呈梭形和圆形。细胞核内还含有一个或多个突出的圆形核仁。而图2（B）中的HepG2细胞与正常肝细胞（WRL68）相比显示出不规则的形状和更大的尺寸相比之下，HepG2细胞核数量增加，导致细胞质不足。3.2. HepG2的处理后形态图 3. KGM和5-FU处理的HepG 2细胞均表现出凋亡特征，细胞体积变小，细胞膜不规则或膜泡状，核碎裂，凋亡小体出现。与阴性对照图二.显示（A）WRL68和（B）HepG2细胞预处理之间的形态学差异的相差图像。使用相差倒置显微镜（Nikon ECLIPSE Ti-S）在200×放大倍数下捕获预处理细胞的形态变化。S. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009905图3.第三章。用（A）4.00 mg/ mL KGM、（B）4.00 mg/mL 5-氟尿嘧啶处理24 h后HepG 2细胞的相差图像凋亡HepG2细胞用箭头指示使用相差倒置显微镜（NikonECLIPSE Ti-S）在200×放大倍数下捕获处理后细胞的形态变化图2（B）中的HepG2细胞（未处理的HepG2细胞），其中细胞保持具有明确限定的细胞膜的上皮样结构。3.3. 正常（WRL68）和癌（HepG2）肝细胞在本实验中，使用DEP方法来观察两种肝细胞系的介电特性 图图4通过评估微电极的虚线区域周围的细胞的运动说明了在施加220kHz信号后正常（WRL68）和癌肝细胞（HepG2）之间DEP响应的差异。在施加电信号之前，如图4（A、C和E）所示的WRL68细胞和图4（G、I和K）中的HepG2细胞均匀分布在虚线区域（微电极的中心在施加电信号后，观察到WRL 68细胞稍微远离中心移动，如图4（B、D和F）所示。据说这些细胞正在经历p-DEP。然而，观察到HepG 2细胞经历n-DEP，这通过细胞向中心移动来证明，如图1B所示。 4（H、J和L）在施加电信号之后。3.4. HepG2细胞处理后如图5所示，还评估了用KGM和5-FU处理后HepG 2细胞的DEP效应。在施加电信号之前，两种细胞群均均匀分布，如图1B所示。 5（A、C、E、G、I和K），并继续远离见图4。显微图像显示在施加20 V p-p、220 kHz信号之前（A、C、E、G、I、K）和之后（B、D、F、H、J、L），正常肝细胞系WRL 68和HCC细胞系HepG 2在微电极上的运动。细胞运动表明施加电信号后的DEP响应。使用倒置显微镜（Nikon ECLIPSE Ti-S）在40 ×放大倍数下观察并捕获DEP对细胞的影响箭头指示在施加电信号时细胞的移动。从点中心，并吸引到高电场强度区域（微电极的边缘）后，施加信号（图1）。 5 B、D、F、H、J和L）。因此，在施加电信号时，两种细胞群都经历3.5. 正常（WRL68）和癌性（HepG2）肝细胞预处理为了定量确定ROI中DEP效应时细胞的运动，计算初始图像（施加220 kHz电信号之前）和最终图像（施加220 kHz电信号之后）的总黑色像素之间的差异施加电信号后，当细胞经历n-DEP时，总黑色像素增加，因为所有细胞都聚集在ROI的中心。同时，当细胞经历p-DEP时，相应区域S. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009906-图五. DEP在施加20 V p-p，220 kHz信号之前（A，C，E，G，I，K）和之后（B，D，F，H，J，L）对肝细胞癌细胞系HepG 2的作用。用IC50处理细胞：（a）3.60 mg/mLKGM ， （b ） 4.00mg/mL 5-FU （ 阳性 对照 ） ，持 续 24 h 。 使用 倒置 显微 镜 （NikonECLIPSE Ti-S）在40×放大倍数下观察并捕获DEP对细胞的影响。箭头表示在施加电信号时细胞的运动。因为细胞远离中心而减少[16]。基于表1，WRL 68细胞群的总黑色像素为阴性（1 7 4），表明细胞经历了p-DEP，而HepG 2细胞显示出阳性值（2 5 7），表明细胞在施加电信号后经历了n-DEP3.6. HepG2细胞处理后表2显示，在施加电信号后，HepG 2、KGM和5-FU处理的细胞都经历了正DEP效应。对于KGM和5-FU处理的细胞，两种处理的细胞群的总黑色像素分别为阴性（-1991，-98）。4. 讨论在本研究中，WRL 68细胞在交叉频率下的定量和定性DEP分析显示轻微的p-DEP效应而未处理的HepG2细胞显示为高度阴性，在两种类型的肝细胞之间具有宽的介电差异这可以通过哺乳动物细胞的细胞表面电荷来解释，所述细胞表面电荷在生理pH下是负的，由此其在肿瘤发生期间增加在表面上表达更多负电荷的细胞，例如肿瘤细胞（HepG 2），经历n-DEP，其中它们远离DEP微电极的负场另一方面，凋亡或坏死细胞随着其表面负电荷减少而经历p-DEP，使其更容易被吸引到负场区域[17]。当将正常肝细胞WRL 68的交叉频率的电信号施加到未经处理的癌细胞HepG 2上时，由于癌细胞的形态改变，DEP响应也影响细胞的介电性质，因此差异很癌细胞的电导率和电容率通常高于正常细胞[18]。细胞膜和细胞密度水平的增加导致癌组织的高介电常数[19]。这一因素也得到了癌细胞形态学变化的支持，如图1所示。图2（B）描绘了细胞大小和细胞核数量的增加。它证明了交叉频率可以用于由于细胞电特性的独特差异而对细胞群体进行分类[5]。同时，如图5和表2所示，在施加信号后，KGM和5-FU处理的HepG 2细胞均表现出阳性DEP应答。这种响应反映了细胞凋亡诱导引起的细胞膜和细胞质的生化成分和离子浓度的变化，从而影响细胞的介电特性。此外，凋亡过程中的细胞皱缩如图所示。 3可能导致剩余的离子集中在细胞质中，改变其电导率[20]本研究中KGM处理的HepG2细胞中的凋亡样形态学和DEP变化进一步支持了我们先前研究中KGM的选择性抑制作用[5]。在HCC细胞系中，KGM诱导的程序性细胞死亡导致细胞失去表面负电荷，导致DEP力与对照相比从n-DEP转变为p-DEP与HepG 2细胞不同，未处理的WRL 68细胞仅经历轻微的p-DEP效应，主要是由于存在来自生物凋亡的死细胞或细胞生长期间的细胞死亡。养老金准备这些膜电荷的变化可能与膜结构蛋白和离子转运的改变有关。在生理状态下，质膜和下面的肌动蛋白细胞骨架通过连接蛋白ERM（埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白）紧密连接，所述连接蛋白ERM对于维持整体细胞完整性和细胞内和细胞外区室之间的信号转导是必需的[21]。在细胞凋亡过程中，由于ERM蛋白连接的消耗和减弱，质膜与肌动蛋白皮质分离，导致形成半球形、水泡样疝，称为膜泡[22]。然后，细胞失去其绝缘特性以及细胞内和细胞外空间之间的阻抗，导致组织电导率降低[9]。此外，据报道，在起泡阶段降低的膜负性也与细胞内钙离子（Ca2+）内流有关，这有助于产生斑马鱼生殖细胞中膜-皮质分离所需的肌球蛋白收缩力[23]。此外，磷脂跨膜分布的不对称性使膜水解酶磷脂酶A2（PLA2）的底物进入增加。通常局限于磷脂双层内叶的阴离子膜脂质（如带负电荷的磷脂酰丝氨酸）暴露于外表面[24]。PLA2酶对负电荷高度敏感，被刺激水解膜，最终导致S. Sawai，N. Ahmad Shukri，Mas Sahidayana Mohktar等.工程科学与技术，国际期刊25（2022）1009907表1在施加220 kHz信号之前和之后，WRL68和HepG2细胞中的总黑色像素和DEP效应细胞黑色像素（之前）黑色像素（之后）黑色像素总数（后-前）DEP效应WRL68HepG2485487311744-174257p-DEPn-DEP表2在施加220 kHz信号之前和之后处理的HepG2细胞中的总黑色像素和DEP效应细胞黑色像素（之前）黑色像素（之后）黑色像素总数（后-前）DEP效应KGM处理的HepG 25-FU处理的HepG 24577255125862453-1991-98p-DEP降低膜负性和细胞凋亡的进展[25]。简而言之，DEP是指当施加非均匀电场时，由于粒子的偶极子和电场的多维梯度的相互作用，包括细胞在内的可极化粒子的运动在哺乳动物细胞中，细胞的导电细胞质通过绝缘（介电）脂质双层与其水性细胞外环境分开。在DEP中，当施加非均匀电场时，电荷将与细胞脂质双层上的偶极子相互作用，产生驱动细胞运动的DEP力有趣的是，细胞在生理上或病理上的介电特性是不同的因此，通过应用适当的电频率，DEP能够将一种类型的细胞与另一种细胞分离和区分开来[36]。例如，在本研究中使用220 kHz作为标准频率，因为已证明其为正常肝细胞系WRL 68的交叉频率[13]。抗氧化剂诱导的细胞损伤被发现是KGM处理的凋亡HepG2细胞中膜负性耗尽的另一个因素在癌症中，肿瘤抑制基因和致癌基因（如p53和BRCA 1）的突变促进氧化应激和活性氧（ROS）水平过高，从而减弱抗氧化剂信号传导，导致肿瘤细胞的凋亡抗性和存活[26]。癌细胞强烈依赖于这些突变，这些突变增强了其抗氧化适应机制，以承受持续的压力并最大限度地减少氧化损伤[27]。令人惊讶的是，大多数天然化合物衍生的化疗药物抑制内源性抗氧化剂活性以提高ROS产生，从而通过氧化损伤根除癌症人们一直在争论这些药物应该靶向癌症中的抗氧化防御信号[28]。有趣的是，[29]的一项研究表明，天南星科的葡甘露聚糖有助于体内N-亚硝基二乙胺（NDEA）诱导的肝细胞癌（HCC）中抗氧化酶的恢复。然而，确切的机制仍然未知。葡甘露聚糖可以像多酚化合物一样，作为核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的抑制剂，Nrf2是癌症中Nrf2氧化还原破坏途径的重要蛋白质[30]。通过抑制Nrf2途径，ROS依赖性癌细胞中的ROS水平将被破坏，导致细胞死亡。此外，还发现Nrf2抑制剂下调癌细胞中的药物排泄转运蛋白和解毒蛋白，增加肿瘤细胞中的细胞毒性。对化疗和放疗的敏感性[31]。总之，与对照WRL68相比，HepG2中的显著DEP变化表明DEP方法与现有生物化学和分子分析互补的可行性在癌症研究中，用于区分癌细胞和健康细胞。此外，DEP分析进一步支持KGM的细胞毒性和肿瘤抑制潜力，我们前期报道的肝癌的临床资料证明了DEP技术在抗癌筛查中的可行性。然而，该装置受限于装置的耗时和未对准的组装，这可能影响装置上的细胞加载体积和重要细胞活性，并且缺乏同时检测多种细胞亚型的能力因此，解决这些局限性的未来改进对于提高设备功效和产生高通量结果至关重要另一个未来的兴趣是细胞运动所花费的时间，这可以通过实时延时成像来捕获此外，DEP对膜完整性和基因表达的影响也可以作为未来工作的一部分。5. 结论本研究表明，基于DEP的微电极技术是一种可行的补充方法，可与其他生物化学和分子生物学方法一起应用于癌症研究和抗癌筛选。该技术能够区分HCC细胞与正常肝细胞，并且能够在用天然产物衍生的细胞毒性剂KGM处理后区分活的和非活的HCC细胞。总体而言，来自我们先前和当前研究的发现强烈表明，在细胞毒性剂诱导的细胞凋亡期间，癌细胞经历膜和遗传改变，其共同改变癌细胞的膜导电性和介电常数。本研究为进一步探索KGM抗肝癌的分子机制和免疫机制之间的联系奠定了基础竞争利益作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作。致谢这项研究得到了马来亚大学研究资助（项目编号：RP 022 C-14AFR和RP 040 B-15 HTM）和研究生研究资助（PG 072 - 2016 A）的支持。 我们感谢来自医学工程创新中心、生物医学工程系和分子医学系的同事，他们提供的见解和专业知识极大地帮助了我们的研究。引用[1] 世卫组织癌症报告：确定优先事项，明智投资，为所有人提供护理; 2020年，日内瓦。S. 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