柱前衍生RP-HPLC法测定芦笋加热前后氨基酸含量

© 2013由Elsevier B.V.发布。信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.comwww.sciencedirect.com上在线获取ScienceDirectIERI Procedia 5（2013）351 - 3562013年农业与自然资源工程国际会议柱前衍生RP-HPLC法测定芦笋加热前后氨基酸含量Zhihong Shi，Hui Li，Zhimin Li，Junda Hu and Hongyi Zhang*河北大学化学与环境科学学院河北省分析科学与技术重点实验室，保定071002摘要建立了柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定芦笋炮制前后12种氨基酸的含量。PITC用作柱前衍生试剂。所得氨基酸衍生物在C18柱（250 × 4.6mmi.d.，5 m），采用梯度洗脱，流动相A为0.1 mol/L pH6.5醋酸盐缓冲液-乙腈（93：7，v/v），流动相B为乙腈-水（4：1，v/v）。在254 nm波长处，流速为0.9mL/min，40 min内可同时测定12种氨基酸，线性范围为0.5 ~ 500 g/mL，平均回收率为75.4%~100.1%。实验结果表明，芦笋经加热处理后，其氨基酸含量降低。© 2013作者。 由Elsevier B. V.在CC BY-NC-ND许可下开放获取。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：氨基酸，天冬，柱前衍生，PITC，HPLC1.介绍天冬（AsparagiRadix）为天门冬科植物Asparaguscochinchinensis（Lour.）Merr.为百合科植物，具有润肺、清热、益肾的药理作用[1]。芦笋富含葡萄糖、果糖、多种低聚糖、天冬酰胺及近20种氨基酸。芦笋的加工方法之一是炒黄[2]。* 通讯作者。联系电话：电话：0312 -5079357传真：0312 -5079525电子邮箱：hyzhang@hbu.edu.cn。2212-6678 © 2013作者由爱思唯尔公司出版 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究所负责的选择和同行评审doi：10.1016/j.ieri.2013.11.115352Zhihong Shi等人/ IERI Procedia 5（2013）351但据我们所知，目前还没有关于芦笋加热前后氨基酸含量的比较研究。对于氨基酸的测定，已经采用了几种方法，例如氨基酸分析仪[3]、毛细管电泳[4]和高效液相色谱[5]。柱前衍生化和HPLC分离，然后进行荧光检测或UV检测的组合是最方便和常用的方法。近10种氨基酸的衍生化试剂有邻苯二甲醛（OPA）[6]、2，4-二硝基氟苯（DNFB）[7]、异硫氰酸苯酯（PITC）[8]和芴甲氧羰基（FMOC）[9]等，本文以PITC为衍生化试剂，采用高效液相色谱法测定了芦笋中12种氨基酸的含量。比较了芦笋不同温度炮制前后氨基酸含量的变化。2. 实验2.1 仪器和试剂使用LC-20 AD色谱仪进行分析，其配备有UV/VIS检测器和CBM-10Avp plus LC Solution Lite软件（Shimadzu，Japan）。12种氨基酸对照品（天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸）为生化试剂（Sigma）; PITC（国药集团化学试剂有限公司，有限公司、中国）、三乙胺（中国天津富辰试剂厂）、乙腈为HPLC试剂（天津科梅尔化学试剂有限公司，有限公司、中国）。除非另有说明，否则所用试剂为分析纯。水经过两次蒸馏。天冬根从当地药店（中国保定）获得。2.2 溶液的制备2.2.1 流动相流动相A：将15g乙酸钠溶于1700mL水中，用乙酸调节pH至6.5，加水至1850mL，最后加入140mL乙腈。将充分混合的溶液通过0.45 μ m膜过滤。流动相B：乙腈-水（4：1，v/ v），通过0.45 m膜过滤。2.2.2 衍生试剂1.0 mol L-1三乙胺的乙腈溶液：将417 L三乙胺与2583 L乙腈混合。0.1 mol L-1 PITC的乙腈溶液：将36 L PITC与2164 L乙腈混合。2.2.3 氨基酸标准品溶液精密称取每种氨基酸0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解氨基酸，并将溶液稀释至刻度。将获得的1 mg/mL标准储备溶液保持在4 ℃。2.2.4 芦笋根的治疗Zhihong Shi等人/ IERI Procedia 5（2013）351353将芦笋切成1mm的小块。准确称取15g样品一式六份，其中一份在80 ℃下干燥4h，另五份分别在110、120、140、160、170 ℃下加热20min。然后将样品粉碎并过80目筛。1.0精确称量10g样品并放入离心管中。加入10 mL水后，离心管涡旋15 min。然后以10000 r/min离心20 min。分离上清液用于衍生化。2.2.5 衍生化将200 L标准品溶液或样品溶液置于试管中。100 L 0.1 mol·L-1 PITC和加入1.0 mol · L-1衍生化反应持续1h。 最后加入400 L己烷并充分振摇。静置10 min后，吸出下层溶液，通过0.45 m滤膜过滤。进样5 L用于HPLC测定。2.3 色谱条件色谱柱：Atlantis dC18柱（250 × 4.6mm i.d.，5 μ m，Waters）;检测波长：254 nm;柱温：36 ℃;进样体积：5 L;梯度洗脱程序如表1所示。表1.流动相梯度洗脱程序最小时间流速mL/min流动相A%流动相B %00.9100070.9919170.9919250.97030350.97030400.95050450.90100500.910003. 结果和讨论3.1 氨基酸提取方法为比较涡旋振荡法和超声波辅助法提取氨基酸的效果，进行了以下实验：取芦笋粉样品（1.0g），离心管中加入两个平行样品。加10 mL水后，将其中一个离心管放入超声浴槽中浸提15 min;另一个离心管涡旋15 min。结果表明，与超声辅助提取法相比，涡旋振荡法提取氨基酸的效率更高。因此，选择涡旋振荡提取法作为氨基酸的提取方法 来自芦笋根。3.2 衍生试剂354Zhihong Shi等人/ IERI Procedia 5（2013）351用于RP-HPLC测定氨基酸的常用柱前衍生试剂是OPA、PITC和FMOC。OPA衍生化反应速度快，但衍生产物不如PITC稳定，FMOC衍生产物适合荧光检测。而PITC与氨基酸反应生成单一的、稳定的苯的硫氨基羰基衍生物，该衍生物可容易地用常规紫外检测器检测。因此，选择PITC作为衍生试剂进行进一步的研究。3.3 校准曲线根据积分峰面积（Y）与浓度进行线性回归分析（g mL-1，X）。校准图的数据如表2所示。表2校准图样品回归方程R线性范围（g mL-1）ASPY=4725.6x-2090.70.99990.5100GluY=9609.4x-2166.80.99990.5100SerY=19366.2x+9107.10.99991.0100GlyY=29626.3x+11335.20.99990.5100ThrY=14943.9x-726.10.99990.5500AlaY=24474.9x+71340.99990.5500ValY=20073.2x-2166.80.99990.5100遇到Y=18231.6x-3238.40.99990.5100IleY=19021.2x-4519.20.99990.5100PHEY=15000.3x+5126.30.99990.5100尝试Y=13403.1x+2187.50.99990.5100LysY=23089.7x-9673.10.99990.51003.4 精密度和重现性实验取200 L 100 g/mL氨基酸溶液，用2.2.5中所述的衍生化方法处理，所得最终溶液重复进样5次。Glu、Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Met、Ile、Phe和Lys峰面积的相对标准偏差分别为2.4%、2.7%、2.4%、2.7%、2.1%、1.9%、2.2%、1.7%、2.1%和1.7%。Asp和Try峰面积的相对标准偏差均大于3.0%。用建立的方法处理了5个重复的芦笋样品（140 ℃）。Glu、Ser、Thr、Ala、Val、Met、Ile和Lys峰面积的相对标准偏差分别为1.6%、1.2%、2.1%、2.7%、1.5%、3.3%、2.6%、2.7%和3.8%。Asp、Gly和Phe峰面积的相对标准偏差均大于5.0%。3.5 稳定性试验1.0 g天冬样品（在140 ℃下处理） C）按既定方法处理。的Zhihong Shi等人/ IERI Procedia 5（2013）35135536A时间/分钟4 512789101112分别在0、4、6和8h分析获得的样品溶液。Asp、Glu、Ser、Gly、Thr、Ala、Val、Met、Ile、Phe、Lys和Try峰面积的相对标准偏差分别为0.3%、1.2%、15.1%、10.6%、11.2%、0.5%、2.8%、7.5%、10.7%、4.4%、0.5%和5.1%。3.6 恢复实验将1.0g的三个重复的天冬样品（在140 ℃下处理）分别加入50、100和1.0 mg/mL氨基酸标准品溶液各500 L。然后根据样品制备程序处理加标样品，并采用已建立的HPLC方法进行分析。平均回收率为：天冬氨酸100.1%、谷氨酸96.5%、丝氨酸81.4%、甘氨酸75.4%、苏氨酸96.8%、丙氨酸96.2%、缬氨酸96.5%、蛋氨酸97.6%、异亮氨酸98.5%、苯丙氨酸97.7%、色氨酸99.9%、赖氨酸87.8%。3.7 芦笋炮制前后氨基酸含量的测定典型的高效液相色谱法为正宗的标准和加工芦笋根样品显示在图1。加热前后芦笋中12种氨基酸的HPLC测定结果见图2。结果表明，芦笋中含有丰富的氨基酸。当加热温度高于120 ℃时，12种氨基酸含量均显著下降。当加热温度达到170 ℃时，只能检测到3种氨基酸，且含量很低。2000001500001000005000002000000 5 10 15 20 25 30 35 401500001000005000000 5 10 15 20 25 30 35 40B时间/分钟Fig. 1. 50 g/mL氨基酸标准品和在140 ℃下处理的天冬的HPLC色谱图1. Asp 2.Glu 3.Ser 4.Gly5.Thr 6.Ala 7. Val 8. Met 9. 10号岛。Phe 11. 12个吧Lys469357810121211UVUV356Zhihong Shi等人/ IERI Procedia 5（2013）3511200110010009008007006005004003002001000-10080 100 120 140 160180500040003000200010000708090100110120130140150160170180图二. 加热温度对氨基酸含量的影响4. 结论本文以PITC为衍生试剂，采用高效液相色谱法测定了芦笋中12种氨基酸的含量。实验结果表明，芦笋中含有丰富的氨基酸，但在高温条件下，氨基酸含量下降。为控制芦笋的质量，保证其功效，不建议采用高温炮制。确认感谢国家自然科学基金（20575016，20875020，）和河北省自然科学基金（B2013201234）的资助。作者还感谢河北省人力资源和社会保障厅对2011年度海外华人学者科技基金引用[1] 中国药典委员会。《中国药典》第一部;化学工业出版社：中国北京，2010年; p. 52.[2] M.X.跑了郭俊明《现代中药炮制手册》，中国中医药出版社，北京，中国，2002年，第100页。265.[3] 杨文忠，王文忠.农业生物化学1987; 51：2479[4]谢敏明，陈SM. Talanta 2007;73（2）：326[5] 谭F，谭C，赵A，李M.农业食品化学杂志2011; 59（20）：10839[6] 杨伟，冼胜，李德兴，万晓春. J Tea Sci 2011;31（3）：211[7] 张晓莉，赵婷，程婷，刘晓艳，张宏欣. J Chromatogr B 2012;906：91[8] 作者：J. J. J Am Oil Chem Soc 2010; 87：127[9] 莫尔纳-珀尔岛J Chromatogr B 2011; 879：1241天冬氨酸AlMetlePheTry谷氨酸丝氨