肿瘤演变的多模态单细胞追踪技术揭示出详细的进化树

文章来自同一细胞的多个谱系测量的整合重建了平行的肿瘤演变图形摘要亮点d在数千个单细胞d这种多模态跟踪允许构建高度详细的进化树d应用于结肠癌类器官显示复发性染色体丢失d染色体18和4的顺序丢失与适应性优势作者Lennart Kester，Buys deBarbanson，Anna Lyubimova，.，雅诺·德罗斯特，耶罗恩·德·里德尔，亚历山大·范·奥德纳登对应j.deridder-umcutrecht.nl（J.d.R.），a.hubrecht.eu（A.v.O.）简言之Kester等人使用单细胞全基因组测序结合谱系追踪来追踪结直肠癌类器官中的肿瘤演变。基于在单细胞中同时测量的CNV、SNV和病毒谱系条形码的多模式追踪使得能够构建详细的进化树并描绘在肿瘤进化期间发生的Kester等人，2022，细胞基因组学2，1000962022年2月9日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100096会会开放获取文章来自同一细胞的多个谱系测量的整合重建了平行的肿瘤演变Lennart Kester，1，4Buys de Barbanson，1，2，4Anna Lyubimova，1Li-Ting Chen，1，2Vale' rie van der Schrier，1Anna Alemany，1Dylan Mooijman，1Josi Peterson-Maduro，1Jarno Drost，3Jeroen de Ridder，2，*and Alexandervan Oudenaarden1，5，*1Oncode Institute，Hubrecht Institute-KNAW（Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences），3584 CT Utrecht，the Netherlands2Oncode Institute，Center for Molecular Medicine，University Medical Center Utrecht，3584 CX Utrecht，the Netherlands3Oncode Institute，Princess Ma 'xima Center for Pediatric Oncology，3584 CS Utrecht，the Netherlands4作者贡献相等5引线触点* 通信：j.deridder-umcutrecht.nl（J.d.R.），a. hubrecht.eu（A.v.O.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100096总结类器官进化模型与整合的单细胞测序技术相结合，为表征肿瘤内异质性（ITH）和肿瘤进化提供了一个强大的平台。在这里，我们进行了一个平行进化实验，通过进化结肠癌类器官模型超过100代，跨越6个月的时间来模拟肿瘤进化过程。我们使用单细胞全基因组测序（WGS）结合12个时间点的病毒谱系追踪，同时监测1，641个单细胞的克隆大小，CNV状态，SNV状态和病毒谱系条形码我们整合这些测量构建克隆进化树的高分辨率。我们描述了染色体畸变发生的顺序，并鉴定了在同一肿瘤亚群中多次复发的畸变我们在四个独特的肿瘤克隆中观察到18号染色体丢失后4号染色体的反复顺序丢失。在我们的类器官实验中鉴定的SNV和CNV也经常在结直肠癌样品中报道，并且在Memorial Sloan Kettering结直肠癌队列中具有18号染色体丢失的334名患者中，99名（29.6%）也具有4号染色体丢失。我们的研究以高分辨率重建了结肠癌类器官模型中的肿瘤演变，证明了一种鉴定肿瘤演变中潜在的临床相关基因组畸变的方法。介绍癌症的发生是由于致癌物质暴露和DNA复制的保真度而导致细胞逐渐获得遗传改变的结果。1一些改变赋予生长优势，导致肿瘤形成，其中DNA修复和基因组完整性越来越受到破坏，导致进一步的遗传改变。因此，出现了表现出单核苷酸变体（SNV）、插入/缺失（indel）和拷贝数变体（CNV）的不同遗传组成的肿瘤克隆。这种肿瘤内异质性（ITH）2肿瘤克隆可以例如具有不同的增殖和转移潜能。此外，ITH在癌症的治疗抗性和频繁的致死结果中起关键作用，因为一些肿瘤克隆可能对治疗具有内在抗性。6 ， 7 由 于 这 个 原 因 ， 已 经 通 过 使 用 肿 瘤块 的 全 基 因 组 测 序（WGS）绘制肿瘤中的克隆进化来进行实质性的努力。然而，在没有时间分辨率的情况下，这种方法仅提供了对ITH的有限视图例如，很难推断遗传损伤发生的顺序，以及亚克隆的数量，可以识别的是有限的。812为了以高克隆和时间分辨率表征ITH，需要获得单个细胞和多个时间点的遗传学改变。这是由单细胞DNA测序实现的，单细胞DNA测序于2011年首次引入，此后在许多研究中被用于研究肿瘤异质性和肿瘤演变。13-需要对来自相同单细胞的CNV和SNV进行这种组合分析，以区分相同样品中的复发性染色体扩增或缺失。此外，CNV被建立的事件的顺序只能通过将CNV数据与SNV数据组合来以高确定性确定。此外，基于多个独立谱系追踪策略构建树通过评估跨多个独立谱系标记的一致性来提供内部验证。最无性系CellGenomics 2，100096，February 9，2022？作者。1这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics2，100096，2022基于单细胞分析的进化研究在被询问的细胞数目和/或SNV数目方面受到限制，并且不包括多个时间点。一些现有的研究确实结合了来自肿瘤中相同单细胞的然而，这些研究依赖于有限数量的SNV和低分辨率CNV数据，导致克隆进化树较浅，缺乏获得这些肿瘤克隆进化全貌的在这项研究中，我们将高分辨率CNV数据与来自数千个单细胞的高质量SNV相结合，以提高描绘准确克隆进化树的能力。为了进一步提高克隆进化树的准确性，我们添加了基于病毒条形码的谱系追踪策略，并将其与我们基于单细胞DNA测序的SNV和CNV检测的分析相结合。这提供了三个（CNV、SNV和谱系条形码）互补水平的谱系追踪，其可以被整合以获得肿瘤进化的完整视图，并且允许对所得克隆进化树进行内部验证此外，我们引入了一个时间轴的数据，在克隆进化过程中采取多个时间点。我们利用结肠癌类器官模型，选择作为表征ITH和肿瘤演变中SNV和CNV的相关系统结肠癌通常由Wnt、表皮生长因子受体（EGFR）、P53和转化生长因子（TGF）-b信号通路的突变引发。此外，结肠癌通常与染色体不稳定性（CIN）相关，导致广泛的CNV。21最近的研究表明，结肠癌的形成可以使用类器官模型在体外准确模拟。[22]这种类器官模型使用CRISPR-Cas9诱导APC、TP 53、KRAS和SMAD 4的顺序突变。APC-/-TP 53-/-KRASG12 DSMAD 4-/-（APKS）类器官在形态学和表型上类似于癌期结直肠肿瘤，并具有明显的CIN。CIN导致遗传异质性培养物模拟在结肠直肠癌（CRC）的临床样品中观察到的ITH在APKS类器官和CRC患者中发现的拷贝数变化24-28在实验开始时将病毒条形码引入类器官模型后，类器官经历26周的体外进化期，在此期间在12个时间点进行单细胞DNA测序以检测CNV、SNV和病毒谱系条形码。平行地，通过谱系条形码的批量测序每周分析每个肿瘤克隆的相对量。这种谱系测量的组合允许构建前所未有的详细克隆进化树。此外，三种标志物（CNV、SNV和病毒谱系条形码）的组合提供了构建的树的内部验证，因为基于两种标志物构建的树可以通过第三种来验证我们使用这种组合的方法来构建克隆进化树，并从这些，表征染色体缺失和扩增发生的事件的顺序，并确定染色体畸变发生多次独立，在同一个细胞群中值得注意的是，我们的克隆进化树在多个独特的肿瘤克隆中显示了顺序的D4和D18在我们的实验中，D4和D18的这种组合提供了强大的增殖优势，并且与纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）结直肠癌队列中的结直肠癌患者中与仅具有单一D18的患者相比降低的无复发患者存活率相关。虽然这种方法强调了这些基因组改变的潜在相关性，但需要在其他队列中进行进一步的临床研究以评估临床意义。结果结肠癌类器官中的谱系追踪揭示了克隆动力学为了追踪结肠癌的克隆进化，我们使用早期传代的人源性APKS结肠类器官培养物，一式三份（下文称为重复1、重复2和重复3）。在建立类器官系之后，引入了具有约60，000个独特条形码的病毒系龄文库类器官随后经历了26周（25次传代）的体外进化期（图1）。每周通过谱系条形码的批量测序（第4周至第26周）分析每种病毒条形码的相对通过评估所有三个重复中的相对条形码丰度，我们观察到相对少量克隆的快速扩增（图S1）。一个重要的问题是观察到的动态是否可以用文化中的中性漂移来解释为了排除这种可能性，我们进行了类器官培养的随机模拟（STAR方法），考虑了类器官的增殖速率、实验开始时的单个细胞的数量（起始群体大小）和类器官传代后留下的细胞的数量（瓶颈大小）。我们观察到，实际实验中熵的下降明显快于模拟，表明这些克隆动力学不能用培养物中的中性漂移来解释（图S2），表明克隆动力学背后存在选择过程。此外，我们在多个重复中观察到相同克隆的扩增高分辨率CNV检测允许识别52种独特的CNV状态与病毒谱系条形码的批量分析平行，以规律的间隔收获单细胞，并使用基于NLA-III限制酶的技术处理单细胞DNA测序29、30（图2A）。将含有独特分子标识符（UMI）的衔接子连接到NLA-III切割位点，允许定量每个单细胞中独特分子的绝对数量，并在测序前使用体外转录（IVT）扩增分子。在使用500 kb箱将映射的读数分箱并过滤具有太少读数或片段化基因组的细胞后，总共保留了1，641个细胞，每个细胞的平均数目为326，000个独特分子（图2B）。拷贝数谱通过除以Cell Genomics2，100096，2022年2月9日3会开放获取文章基于NLA-III限制性内切酶的技术可以精确定量每个单细胞的CNV谱。例如，我们观察到多个独特的CNV影响染色体18，这不能通过批量WGS检测到（图2D;例如，拷贝数状态2、6和11）.与单细胞NLA-III测序平行，我们在体外进化的第一天和最后一天进行了标准批量WGS。在这些批量数据中，我们在实验结束时在重复1中观察到完整的D4然而，B等位基因频率（BAF）显示两种等位基因仍然存在，尽管数量不等（图S5）。这表明一部分细胞丢失了4号染色体的一个等位基因，其余细胞丢失了另一个等位基因。为了在单细胞中证实这一点，我们首先获得了4号染色体的二倍型，该二倍型是基于来自同一供体的另一个类器官系，该供体完全丢失了4号染色体的一个等位基因。然后使用该二倍型来评估每个单细胞中4号染色体的哪个等位基因（如果有的话）丢失。事实上，在重复1中，我们观察到314个单细胞具有D4等位基因A，96个细胞具有D4等位基因B.也可获得18号染色体的双倍型。在这里，我们观察到18号染色体上的所有独特缺失都涉及相同的等位基因。观察到的4号和18号染色体的单细胞BAF是三峰的，峰值在0、0.5和1附近，表明细胞是二倍体而不是四倍体（图S5B）。这些观察结果表明，单细胞NLA-III测序和WGS的组合允许在单细胞中进行等位基因特异性CNV检测。在类器官培养物中观察到的大多数缺失和扩增也经常在CRC患者中观察到，这强调了类器官模型与研究结直肠癌的相关性（图2C）。我们总共在1，641个单细胞中鉴定了25个独特的CNV，具有52个独特的CNV状态（我们将CNV状态定义为由至少两个单细胞共享的全基因组CNV谱;STAR方法），大小范围从434个细胞到3个细胞（图2D）。在重复1中，我们观察到具有D4和D18的细胞的大量扩增，而在第二（重复2）和第三（重复3）实验中，我们观察到具有D8p的细胞的扩增图1. 实验装置使用基于CRISPR-Cas9的策略转化野生型人结肠直肠类器官。用引入谱系条形码的慢病毒文库转导22个转化的类器官。类器官经历了26周的体外进化期，在此期间，定期进行单细胞WGS，每周评估培养复杂性。从单细胞WGS，获得拷贝数状态、sSNV状态和谱系条形码，从而允许构建和验证高度详细的克隆进化树。再乘以2对中位数归一化均值使用主成分分析的离散性降低表明，细胞通过重复和时间点聚集，而对于早期时间点，各种重复的细胞更相似（图S3）。不同拷贝数区域之间的重复断裂点通过分层聚类然后循环二进制分割（STAR方法）检测。的高分辨率和低噪声（图S4）高分辨率克隆进化树为了构建基于CNV的初始克隆进化树，我们使用CNV状态来创建有向编辑距离图。由于相同的CNV状态可能存在于多个时间点，因此将每个时间点添加为图中的单独节点。这使得能够实施时间一致性（即，较早的时间点不能从较晚的时间点导出）。用Edmonds算法从有向CNV编辑距离图中生成生成树形图. 使用ToverBoom可视化克隆进化树（图3C所得到的克隆进化树指示肿瘤沿着其进化的最可能的例如，复制1的树指示CNV状态3是CNV状态2的后代，考虑到CNV状态2具有D18并且CNV状态3具有D18和D4，这是合乎逻辑的（图2D）。总之，高分辨率CNV调用允许构建具有时间分量的详细克隆进化树。4Cell Genomics2，100096，2022会开放获取文章一BCD（图例见下页）Cell Genomics2，100096，2022年2月9日5会开放获取文章克隆进化树的验证需要整合CNV状态和独立的尽管上述基于CNV状态导出的克隆进化树表明了最可能的进化轨迹，但我们不能排除两个看似相关的CNV状态独立出现的可能性，特别是考虑到拷贝数变化在该遗传背景中频繁发生。为了消除两种CNV状态之间的关系，我们可以利用病毒谱系条形码提供的信息。这在图3A和3B中示意性地表示。对于在实验期间引入的新CNV状态，新CNV状态的细胞及其亲本细胞必须由相同的病毒谱系条形码标记。例如，新的CNV状态k源自亲本CNV状态1，因为两种状态共享病毒谱系条形码1（图3A）。另一方面，在与其推定亲本不共享病毒谱系条形码的细胞中观察到的CNV状态最有可能在引入谱系标志物之前出现（由图3A中的CNV状态m类似地，包含具有多个谱系标志物的细胞的CNV状态最可能也在条形码引入之前出现（图3A中的CNV状态1具有多个谱系标志物的处于特定CNV状态的克隆是特别令人感兴趣的，所述谱系标志物也存在于其推断的亲本CNV状态（例如，图3B中的CNV状态y和CNV状态z）中。在该实施例中，CNV状态z和CNV状态y均具有病毒谱系条形码1和2，表明这些CNV状态密切相关并且在谱系标志物引入后出现。由于病毒谱系条形码标记独特的谱系，这意味着染色体A的丢失独立地发生两次，一次在具有谱系条形码1的细胞中，一次在具有谱系条形码2的细胞中。观察到共享谱系条形码的CNV状态的另一种解释是，这些CNV状态在实验开始时已经存在，并且相同的谱系条形码被多次引入具有这些CNV状态的细胞然而，由于病毒谱系文库中存在大量条形码，这是非常不可能的（基于模拟，起始培养物中两个细胞接收相同病毒条形码的概率小于0.0001）。为了检测单细胞中的病毒谱系标志物，使我们能够消除歧义并验证克隆进化树，我们采用了富集含有病毒谱系条形码的读段的实验策略（STAR方法，图S7）。这使我们能够检测293个测序的单细胞的谱系条形码谱系条形码信息可以叠加在克隆进化树上，这允许我们区分先前描述的情况（图3A和3B）。事实上，我们观察到几个CNV状态之间共享的病毒谱系条形码，这些状态彼此一致，基于CNV的克隆进化树。例如，CNV状态2（D18）和CNV状态3（D18和D4）共享病毒谱系条形码BC1（图3C）。这证实了在体外进化过程中，具有属于CNV状态2的BC1的单个细胞丢失了染色体4的A等位基因，从而建立了在CNV状态3、5、16、20和21之间也观察到另一个共享的病毒谱系条形码BC2，所有这些都共享D18。这表明，即使在CNV状态2中未观察到该特定病毒谱系条形码，但它一定存在，并且很可能由于采样而未观察到在体外评价期间出现的新CNV状态的其他实例包括来自重复2中CNV状态1的CNV状态7、17、22和27（图3D）和来自重复3中CNV状态2的 CNV状态9（图3E）。有趣的是，在重复2中，基于CNV的克隆进化树表明CNV状态17和22独立于CNV状态1出现基于病毒谱系条形码，我们可以得出结论，这是错误的，并且CNV状态17和22从CNV状态1下降。这说明了整合多个谱系测量以实现肿瘤演变的更准确图像的重要性。除了观察到共享相同病毒谱系条形码的多个CNV状态之外，我们还观察到相同CNV状态内的多个病毒谱系条形码（例如，CNV状态1、2、4和6）。对此最可能的解释是这些CNV状态在病毒谱系条形码引入时已经存在（图3A）。CNV状态1、2、4和6在实验开始时已经存在的观察结果通过这些状态都存在于多个重复中的事实此外，我们已经在来自实验开始时采集的样品的本体WGS中观察到亚克隆D18（CNV状态2）（图S5D）。体细胞SNV提供了一个额外的信息层来提高树的分辨率体细胞SNV（sSNV）可以用作谱系标记，因为它们从一个细胞遗传到其后代。因此，共享的sSNV指示共享的共同祖先，并且sSNV可用于消除先前鉴定的CNV状态之间的系统发育关系的歧义。尽管拷贝数改变可能具有适应性效应，但大多数sSNV是乘客突变，对细胞的适应性没有任何影响，因此提供了受选择影响较小的谱系标记此外，不像病毒谱系标记，sSNV随时间积累，因此提供了在进化实验期间启动的克隆的谱系标记出于这些原因，除了病毒条形码和拷贝数概况之外，我们还评估了所有三个重复的细胞内的sSNV。该额外的信息层允许我们鉴定具有相同拷贝数状态的细胞群体内的额外异质性，基于拷贝数验证推断的谱系树的边缘，图2. 克隆进化过程(A) 单细胞WGS策略的示意图。(B) 从其获得单细胞WGS数据的1，641个单细胞的CNV谱。(C) Memorial Sloan Kettering结直肠癌数据集中常见的染色体畸变。(D) 概述了在类器官中鉴定的52种独特的CNV状态每条线代表一种CNV状态;图的左侧部分显示了在不同时间点三次重复中CNV状态的丰度图的右侧部分显示了在每个CNV状态中检测到的缺失和扩增4号染色体被分成等位基因A和B。6Cell Genomics2，100096，2022会开放获取文章一个CBDE图3.基于CNV的克隆进化树上的病毒谱系条形码（A和B）可以通过CNV状态和病毒谱系条形码信息的组合来解释的CNV事件的实例。（每个树右侧的数字表示CNV状态。10表示CNV状态已经灭绝。并鉴定多次发生的拷贝数异常事件。从单细胞测序数据调用的sSNV遭受大量的假阳性调用。为了鉴定可靠的sSNV，我们因此在可以在批量文库中验证的实体突变上训练随机森林（RF）分类器，并使用训练的分类器来鉴定可靠的sSNV（STAR方法）。通过RF过滤器的每个变体被定相为至少一个杂合种系变体或以其他方式被丢弃。阳性变体调用通过细胞内位置的所有序列读段中替代等位基因阴性变体调用通过与发现的种系变体同相的参考等位基因的存在来鉴定。与另一个等位基因相连32，33这个程序允许我们从用于树推断的所有细胞中提取106个高质量sSNV。sSNV可以覆盖在从拷贝数调用推断的谱系树上。图4A和4B显示了所有三个重复中两个示例sSNV的这一点。sSNV可以是存在的（红色标记）、不存在的（检测到参考等位基因，蓝色标记）或未确定的（检测覆盖度不足，灰色标记）。该实施例表明D18克隆的亚克隆总是携带该变体，而包括亚克隆的D8p克隆不携带。这证实了这两个SNV与具有相似拷贝数谱的克隆存在强关联。Cell Genomics2，100096，2022年2月9日7会开放获取文章B一C（图例见下页）8Cell Genomics2，100096，2022会开放获取文章通过基于所有检测到的sSNV进行聚类，细胞分成两个主要组。第一组细胞以D18为特征，而第二组主要携带D8p （图4C）。大多数变异体在多个重复中被检测到，这表明变异体可能在重复分离之前就存在在单细胞中整合sSNV与CNV表明拷贝数状态除了拷贝数状态和体细胞变体的强共分离之外（图4C），我们还观察到两个谱系标志物之间更复杂的关系我们在两个拷贝数状态的分支点处定义了三类sSNV（图5）。在第一类中，拷贝数畸变发生在sSNV之后。这将与以下情况一致，其中在早期时间点，克隆被sSNV标记，并且在CNV诱导的分叉之后，新衍生的克隆仅含有携带替代等位基因的细胞（图5A，顶部）。我们在染色体8和染色体18上分别发现了重复2和1的第一类的例子（图5A，底部）。在第二类中，在创建CNV之后引入sSNV。在此，在早期时间点，克隆不包含任何具有sSNV的细胞在分支到新拷贝数状态后，仅观察到新CNV状态下细胞的sSNV，表明它一定是在获得CNV后引入的（图5B，顶部）。这类sSNV可用于验证与病毒谱系标志物类似的拷贝数树中的边缘第二类的例子显示了在D18亚克隆内出现的重复1（图5B，底部）。在第三类也是最有趣的一类中，相同的CNV独立地发生两次。这种情况将与在早期时间点含有具有和不具有sSNV的细胞的单一CNV状态的克隆一致。如果在引入CNV之后，新克隆还包含具有和不具有sSNV的细胞，则这一定意味着拷贝数畸变必须发生至少两次：一次在具有sSNV的克隆中，一次在不具有sSNV的克隆中（图5C，顶部）。这种平行进化事件的一个例子可以在多个变体中找到，这些变体在D18状态和D18 D4A状态中显示参考和突变等位基因（图5C，底部）。这同样适用于D18到D18D4B状态（图5C，底部）。准确识别前两类是具有挑战性的，因为由于单细胞数据中的缺失，总是可能无法检测到特定sSNV的存在或不存在。然而，将第三类与前两类区分开来，不太容易受到抽样误差的影响。如果在CNV启动之前和之后检测到sSNV的存在和不存在，则排除第一和第二场景，特别是当这由几个sSNV支持时。综上所述，对sSNV如何在拷贝数状态之间分离的综合分析表明，这些拷贝数状态可以独立地出现多次。D18之后是D4三次重复中丰度最高且生长最快的克隆的特征在于D18和D4的组合。虽然我们观察到495个细胞有D18和没有D4（30.2%），分为20个CNV状态，但我们没有观察到任何细胞有D4和没有D18，这表明D4只在D18存在的情况下才产生增殖优势在总共449个单细胞（27.3%）中检测到这种组合的D18和D4，分为11个CNV状态。D18和D4偶然同时出现的概率p值1 e-100）为了观察是否有任何证据支持临床样本中的这一假设，我们转向来自MSKCC的结肠直肠34MSKCC数据显示，在结肠直肠癌患者中，染色体18和4经常丢失（32.5%和13.8%分别显示染色体18和染色体4的对数拷贝比为~ 0.4）（图2C）。然而，与基于18号染色体和4号染色体拷贝比所预期的相比，在同一患者中4号染色体拷贝数比低于18号染色体的肿瘤发生的频率较低;仅在27.7%的肿瘤中，18号染色体的拷贝比低于4号染色体（p值0.00001，基于置换策略，STAR方法，图6A）。因此，存在18号染色体的拷贝数比低于4号染色体的肿瘤富集（72.3%的肿瘤18号染色体的拷贝数比低于4号染色体），表明D18最常发生在D4之前（基于排列策略，p值0.00001）。引人注目的是，这与我们在APKS类器官培养物中观察到的事件顺序一致。我们还发现，在MSKCC队列中，与D18和无D4的患者相比，D18和D4的组合与降低的无复发生存期相关（对数秩p值0.035）（图6B）。这表明，与单独缺失相比，在先前D18的背景下D4为了以更系统的方式研究这一点我们定义了一个“启动事件”，这是第一个畸变，和一个“条件事件”，这是第二个畸变，在特定的启动事件的背景下。然后，我们比较了任何给定的引发和条件事件对的拷贝率与条件事件相对于单独的引发事件的风险比之间的绝对相关性（图6C）。该分析发现，在MSKCC结直肠癌队列中，第18天作为启动事件，随后第4天作为条件事件，在所有可能的条 件 事 件 中 具 有 最 高 的 风 险 比 （ Cox 比 例 风 险 比 0.78 ，Benjamini-Hochberg校正p值=0.012）。这些分析突出了我们的类器官系统作为结直肠癌模型的相关性此外，根据器官中的观察结果，我们发现D4以D18为条件与患者无复发生存率降低相关。据我们所知，图4. 基于CNV的克隆进化树上（A和B）投射到三个重复的CNV树上的一个sSNV的存在每个标记物指示单个细胞，并且其颜色和形状指示是否检测到替代等位基因（红色，圆形）或检测到参考等位基因（蓝色，正方形）或sSNV未被覆盖（灰色，三角形）。(C)单细胞sSNV矩阵。细胞根据其拷贝数状态分组。Cell Genomics2，100096，2022年2月9日9会开放获取文章图5.在两个拷贝数状态的分支点处的三类sSNV第1-3类的示意图位于顶行。下面的两行显示了每个类的标识实例。每个标记表示单个细胞。其颜色和形状指示是否检测到替代等位基因（红色，圆形）或参考等位基因（蓝色，正方形），或者sSNV未被覆盖（灰色，三角形）。(A) 在类别1中，拷贝数畸变发生在sSNV出现之后。(B) 在类别2中，拷贝数畸变发生在sSNV出现之前。(C) 3类是平行进化事件的一个实例，其中sSNV之后是两个独立的拷贝数畸变。这是与相应的单一畸变相比，条件性染色体畸变与降低的存活率相关的第一个实例讨论描绘肿瘤形成的克隆进化轨迹以来肿瘤内的每个细胞都是独特的，这需要一种具有单细胞分辨率的方法在这里，我们使用单细胞WGS结合病毒谱系追踪来获取1，641个单细胞的CNV状态、SNV状态和病毒谱系条形码在类器官中鉴定的几乎所有CNV也经常出现在CRC样品中，表明类器官是CRC的基于对单细胞中CNV的分析，我们在器官中鉴定了52种独特的CNV状态来自52一BC10Cell Genomics2，100096，2022会开放获取文章A BC图6.MSKCC患者队列中18号染色体丢失后4号染色体丢失与生存率降低相关(A) MSKCC患者队列中D18和D4之间的关系红色和蓝色阴影表示与随机背景分布相比的富集和贫化(B) Kaplan-Meier曲线比较了D18和D4患者与D18和无D4患者之间的生存率(C) 染色体改变之间的绝对相关性与单独预激事件与预激事件和条件性事件相比的危害差异的p值相比。点的阴影和大小指示危险差异的方向和大小。CNV指出，我们推导出了高度详细的克隆进化树，进而可以基于病毒系龄标记和SNV进行内部验证由于同时存在多个独立的谱系标志物，因此这种内部验证才是可能的。我们对克隆进化树的分析鉴定了在类器官培养中多个独立事件中发生的特异性CNV。观察到的最常见事件是D4，至少有4起独立事件。频繁的D4表明该事件为类器官提供了增殖优势。事实上，病毒谱系条形码显示，丢失4号染色体的克隆在体外进化期间扩增。SNV的聚类鉴定了两个主要组，其与数据中的两个主要CNV克隆完全重叠，即D18组和D8p组。然而，对SNV的更详细的调查确定了几个SNV，这些SNV只能被排除在外。一种特定的CNV多次出现这证实了D4在体外进化期间多次发生的观察结果。在我们的数据中，仅在D18的背景下观察到D4这表明，在这种情况下，染色体畸变的顺序对进展很重要对来自MSKCC结直肠癌数据集的患者数据的分析发现，在患者中，D4也非常频繁地发生在D18的背景下。此外，D18和D4的组合导致比单独D18更高的死亡率。引人注目的是，对MSKCC结肠癌数据集中的背景依赖性缺失或扩增的进一步系统性探索发现，与单独的初始扩增或缺失相比，仅在D18背景下的条件性D4这表明，与突变相似，染色体畸变的组合影响肿瘤的侵袭性。Cell Genomics2，100096，2022年2月9日11会开放获取文章该研究由于类器官培养实验的劳动密集型性质，在本研究中仅产生三个对于我们的主要发现之一，我们只在三个重复中的一个中观察到连续的D18和D4。然而，我们在临床样本中也发现了类似的观察结果需要进一步的研究来估计这些染色体丢失事件在平行进化实验中的概率。 为此，具有大量平行进化实验的研究将是有用的，例如，通过使培养程序自动化。这也将允许研究特定突变和拷贝数变化的机械后果。尽管我们提供了MSKCC研究中单个临床队列中D18和D4频率的初步检查使用MSK-IMPACT靶向测序组生成MSKCC结直肠癌队列，因此拷贝数变异的分辨率有限。更高分辨率的数据集可能会提供更多的了解节段性染色体畸变。需要在其他队列中进行进一步研究，以确定潜在的临床相关性，并确认观察到的与患者生存期的相关性。目前基于体细胞突变和拷贝数谱检测克隆在我们的研究中，拷贝数谱具有约500 kb的分辨率，并且我们不能准确地分辨所有细胞的较小特征。此外，由于在体细胞SNV附近缺乏杂合种系SNV，体细胞SNV的定相并不总是可能的未来的研究，提高体细胞突变和拷贝数谱检测的灵敏度将提高分辨率，因此可以允许构建更详细的进化树。更详细的进化树可以更精确地理解肿瘤的进化对此，一种目前可行的方法是使用长读段WGS，与切割频率较低的限制性内切酶组合，以增加可以定相为杂合种系变体的sSNV的数量。此外，每个重复的初始细胞群体可能不是纯克隆群体。我们观察到重复之间的共享体细胞突变表明，一些异质性存在于初始文化。因此，在实验开始时，可能用已经含有有益变体的克隆引发重复先前的实验已经表明，即使从单个细胞生长的类器官仍然含有亚克隆畸变。检测同一细胞中的多个谱系标记可以区分预先存在的突变和进化实验期间发生的突变。例如，当特定sSNV存在于两个不同的拷贝数状态，相关的畸变很可能发生在进化实验期间。总之，我们基于通过CRC类器官的单细胞WGS获得的三个独立谱系测量构建了高度结构化的克隆进化树。细胞系年龄测量鉴定了4个独立事件，其中在D18的背景下4号染色体丢失。该组合D18和D4，在类器官中鉴定，在CRC患者的单一研究中发现与生存率降低STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统BAPKS类器官培养B病毒文库构建d方法样本B病毒文库复杂性评估BAPKS类器官转导BDNA提取、条形码扩增和条形码测序B全基因组测序和批量变异识别B单细胞全基因组测序B单细胞全基因组数据处理B拷贝数分段和状态定义B拷贝数树推断B拷贝数树绘图B体细胞单核苷酸变体检测B体细胞单核苷酸变体插补B中性漂移模拟d量化和统计分析BMSKCC结直肠癌数据集分析B条件性染色体畸变分析补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2022.100096。致谢这 项 工 作 得 到 了 欧 洲 研 究 委 员 会 高 级 资 助 （ ERC-AdG 742225-IntScOmics ） 、 Nederlandse Organislavoor Weten-schappelijk Onderzoek（NWO）TOP奖（NWO-CW 714.016.001）和Ko- ningin Wilhelmina Fonds（ KWF ） 资 助 （ 10158 ） 的 支 持 。 J.d.R 得 到 了 NWO VIDI 赠 款（639.072.715）的支持J.D. 由KWF（10218）和ERC（ERC- StG 850571）资助。这项工作是Oncode研究所的一部分，该研究所部分由荷兰癌症协会资助。此外，我们感谢乌得勒支大学医学中心、乌得勒支研究所和乌得勒支大学资助的乌得勒支排序设施、乌得勒支测序设施;以及鲁本·范·博克斯特尔和埃德温·库彭对类器官系批量WGS的帮助和建议作者贡献A.V.O. 和L.K.构思并设计了这个项目。B.d.B. 和L.K.分析了数据。A.L.，V.V.D.S.，D.M. J.P.- M. 协助实验。L-T.C.和A.A.协助数据分析。J.D.建议进行类器官培养J.d.R. 和A.V.O.监督工作。L. K.，B.D.B.，J.d.R. 和A.V.O.我写了手稿。L.K.和B.D.B.对这项工作作出了同样的贡献。12Cell Genomics2，100096，2022会开放获取文章申报利益作者声明没有竞争性的经济利益。J.d.R.是Cy- clomics B. V.的创始人投稿时间：2020 - 12 -修订日期：2021接受日期：2022发布时间：2022引用1. 费伦急诊室汉密尔顿，SR，Vogelstein，B.（1987年）。人结直肠肿瘤的克隆性分析Science238，193-197.https://doi.org/10.1126/science.2889267.2. Gerlinger ， M. ， Rowan ， A.J. ， Horswell ， S. ， 数 学 MLarkin ， J. ，Endesfelder ， D. ， Gronroos ， E. ， Martinez ， P. ， 马 修 斯 ， N. ，Stewart，A.，等人（2012年）。多区域测序揭示的肿瘤内异质性和分支演 变 。 N. Engl. J.Med.366 ， 883-892 。 https://doi.org/10.1056/nej-moa1113205.3. Izumchenko，E.，张，X.，Brait，M.，Fertig，E.，Kagohara，L.T.，Bedi，A.，马尔基奥尼湖Agrawal，N.，拉维河琼斯，S.，等（2015年）。靶向测序揭示了早期肺肿瘤进展中的克隆遗传学变化和成对的循环DNA。国家通信68258 https://doi.org/10.1038/ncomms9258网站。4. P.C.诺埃尔（1976年）。肿瘤细胞群的克隆进化。科学194，23-28。https://doi.org/10.1126/science.959840网站。5. 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