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软件X 10(2019)100285原始软件出版物scburst:用于分析和排序单通道突发的R包布莱尔河克里斯蒂安·德拉蒙德作者:Mathieu F. Corrie J.B. Dextraze 达科斯塔渥太华大学理学院化学与生物分子科学系化学与合成生物学中心,渥太华,安大略省K1N 6N5,加拿大ar t i cl e i nf o文章历史记录:收到2019年收到修订版2019年7月4日接受2019年7月5日保留字:单分子分析单通道分析爆发离子通道动力学拟合a b st ra ct单通道活性的分析提供了对离子通道结构、功能和机制的无与伦比的洞察。 分析管道中的一个重要步骤是分配和分类可归因于单个离子通道的活动突发。在这里,我们提出了scburst,一个R包用于单信道突发的分析和排序。使用scburst,可以将来自各种单通道分析软件包的理想化数据直接读入R,并根据用户定义的临界闭合持续时间解析成burst可以基于各种参数对突发进行分析和分类,包括突发打开概率和每次突发打开的数量。然后可以以标准格式导出排序的突发,用于下游动力学拟合。我们提供了一些例子来说明scburst的实现和实用性,以及scburst如何将R的统计能力和多功能性带到单通道分析中。©2019作者由爱思唯尔公司出版这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)中找到。代码元数据现行法规版本1.6永久链接到代码/存储库使用的此代码版本https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX_2019_79法律代码许可证LGPL-2.1代码版本控制系统使用git软件代码语言R编译要求,操作环境&依赖R,readxl,tibble。用于编译文档:Pandoc,LaTeX, rmarkdown,如果可用,链接到开发人员文档/手册https://cran.cnr.berkeley.edu/web/packages/scbursts/scbursts.pdf问题支持电子邮件blair.robert. gmail.com软件元数据当前软件版本1.6此版本可执行文件的永久链接https://CRAN.R-project.org/package=scbursts法律软件许可证LGPL-2.1计算平台/操作系统Linux,OS X,Microsoft Windows安装要求依赖关系R,readxl,tibble如果可用,用户手册链接-如果正式出版,请在参考列表中引用该出版物https://cran.cnr.berkeley.edu/web/packages/scbursts/vignettes/scbursts.pdf问题支持电子邮件blair.robert. gmail.com1. 介绍膜片钳技术仍然是单分子实验的黄金标准,无论是时间分辨率,*通讯作者。电子邮件地址:cdacosta@uottawa.ca(C.J.B. daCosta)。https://doi.org/10.1016/j.softx.2019.100285[1]与信号噪声比该技术开发于20世纪70作为结果的模拟信号被数字化,然后理想化,以便通道打开和关闭的顺序可以适合描述潜在活动的动力学方案[5]。这导致了对离子通道结构,功能和机制的深刻理解[1,6]。2352-7110/©2019作者。 由Elsevier B.V.出版。这是一篇开放获取的文章,使用CC BY许可证(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页:www.elsevier.com/locate/softx2B.R. 德拉蒙德,C.J.G.Tessier,M.F.Dextraze等人粤公网安备44010802000018号分析管道中的重要步骤之一是确定可归因于单个通道活动的紧密间隔的打开和关闭的突发[7]。爆发由临界闭合持续时间(τcrit)定义,其规定由比τcrit短的闭合分开的开口是同一爆发的一部分,并且源自同一通道,而由比τcrit长的闭合分开的开口来自不同的爆发。换句话说,突发是所有源自相同通道的紧密间隔的开口和闭合的集合,并且两侧是长于τcrit的扩展闭合[7]。τcrit通常在单通道数据理想化后通过检查闭合驻留时间的分布来确定[8一旦识别出爆发,通常在动力学拟合之前对其进行排序[12突发基于诸如每个突发的最小打开数量或通道在给定突发期间打开的概率(即,P打开)[15]。在某些情况下,这种分类是手动完成的,实验者任意决定哪些突发包括下游分析。在其他情况下,使用了无法访问的自制在这里,我们描述scburst,一个开源和免费提供的R包,设计用于分析和排序单通道突发。我们展示了在开源R环境中分析突发事件的实用性,展示了如何调用现有的R软件包来客观和透明地对突发事件进行排序,以进行下游动力学分析。2. 软件框架scbursts包在R中运行[16]。它包括一组功能,用于将理想化的单通道数据解析为脉冲串,以便可以对它们进行分类和导出以进行动力学分析。该软件包还包含将理想化数据从许多流行的单通道分析套件导入R环境的功能(表1),从而统一跨平台和分析套件的理想化单通道数据。为了说明scburst的实用性,以及在R中处理单通道数据所提供的灵活性,我们提供了scburst实现的具体示例所有相关的数据文件以及使用不同软件包理想化的事件的类似工作流程都可以在线获得(GitHub,CRAN),并作为补充文件。3. 实施和说明性示例3.1. R中的理想化事件和定义爆发scburst中的突发分析从理想化的单通道数据导入R开始。根据用于检测单通道事件的方法和软件,理想化数据可以是(a)一系列打开或关闭的停留时间,或(b)一系列表示通道何时在非导通(关闭)和导通(打开)状态之间转换的转换时间(表1)。考虑到后一种情况代表了两种情况中更复杂的一种,因为它涉及到额外的步骤,这里我们提供了一个分析示例,以电导转变时间形式的理想化数据开始。图图1显示了在激动剂(30 μ M乙酰胆碱;图2)存在下,含有人成人肌肉型乙酰胆碱受体(AChR)的细胞附着贴片的单通道活性的连续延伸。1A)。对于所描述的示例,使用检测打开和关闭的TAC单通道分析软件包基于50%阈值交叉标准的过渡时间。为了进行比较,TAC理想化事件显示在原始数据下方(图1)。1B)。TAC将理想化的过渡时间保存为1.zip>evtfile<-'' path / example1 _ tac. evt′′(1)其中TAC事件文件包含与单通道记录相关的标题信息,这些信息对于scburst内的burst分析来说是不必要的。要仅提取过渡时间,请输入以下内容:>transitions<-evt. read(evtfile)(2)所得到的“转换"将是通道从关闭转换到打开(即打开= 1)的时间列表,或者从打开到关闭(即,关闭= 0)。由于信道是开的或闭的,每一个开之前必须有一个闭,类似地,每一个闭必须在一个开之后。为了确保遵守这一标准,scburst具有一个内置功能,它将标记包含两个或多个具有相同电导水平的连续事件(即打开或关闭)的理想化数据集。在定义突发时,可以从下游分析中移除违规突发为了将过渡时间转换为一系列打开和关闭的驻留持续时间,scburst具有内置的evt.to_dwells函数。考虑到转换是打开还是关闭,该功能从当前转换时间中减去先前的转换时间,以确定相关打开或关闭停留的持续时间。要将过渡时间转换为停留时间,只需输入:>dwells<-evt. to_dwell(transitions)(3)产生的1.zip为了将一系列驻留分为单通道活动的爆发,有必要指定临界关闭持续时间(τcrit)。图中所示的单通道记录。1包含相对较少的突发,并且出于说明的目的,任意指定100 ms的τcrit要指定τcrit为100 ms并定义猝发,请输入以下内容:>bursts<-bursts。defined_by_tcrit(驻留,100,单位=(四)其中输入100 ms的临界关闭持续时间(τcrit)。默认单位是秒,但可以如上所述指定表1与scburst兼容的单通道分析软件包。软件检测标准过渡或停留文件扩展名URLClampfit50%阈值居住*.xlshttps://www.moleculardevices.com/products/axon-patch-clamp-system/acquisition-和分析软件/pclamp软件套件QUB分段k均值居住*.dwthttps://qub.mandelics.com/扫描时间进程居住*.txt文件https://github.com/DCPROGSTAC50%阈值过渡*.evthttps://www.bruxton.com/TAC/index.htmlB.R. 德拉蒙德,C.J.G.Tessier,M.F.Dextraze等人粤公网安备44010802000018号3==-∼∼Fig. 1. 单通道活动的爆发。(A)在存在30 μ M乙酰胆碱的情况下,膜片钳记录成人肌肉型乙酰胆碱受体的连续拉伸。记录包含多个单通道活动的突发,从左到右编号为[1]、[2]、[3]和[4]。开口是向上的偏转,下面放大显示的方框区域突出显示了单独的爆发。方框本身表示比例尺,其“y”和“x "轴分别表示20 pA和250 ms。表示临界关闭持续时间(即τ crit)的比例尺100 ms)在本示例中用于定义突发,显示在中间的放大图中以供参考。将迹线数字滤波至10 kHz。(B)所示膨胀爆发的理想打开和关闭事件在“A”中。在理想化下方突出显示在爆发内(即,Δt< τcrit;左)或爆发之间(即,Δt> τcrit;中)的选择关闭。(C)scburst表示法B中描述的理想化脉冲群。每个脉冲串都被编号(例如[[1]])并存储为交替打开(状态1)和关闭(状态0)的集合,持续时间以秒表示。请注意,脉冲串[1]、[2]、[3]和[4]包含281、1、117和57个事件(包括打开和关闭),但仅包含选定事件 由于空间的限制,由此产生的爆发都以一个开口开始和结束,并且通过一个比指定的τcrit更长的闭合彼此分开。请注意,如果τcrit为20 ms(或更小),则脉冲串#1将被定义为两个单独的脉冲串。或者,如果τcrit为150 ms(或更大),则脉冲串#2和#3将具有组合成一个单一的爆发。因此,即使是这个小数据集也说明了选择适当τcrit的一些重要细微差别。此外,离子通道的行为通常是分层的,突发嵌套在突发的“簇”中 在scburst中定义簇和超级簇就像指定越来越长的临界闭合持续时间一样简单。上面定义的突发可以基于根据不同的标准。例如,定义的“突发”之一 图1是孤立的单个开口(爆破#2)。若要丢弃> =2)}(五)> bursts_twoplus<-bursts。select(burst,twoplus)结果3.2. 基于突发P打开前一个例子包含相对较少的爆发,并且不构成足够的数据以包括在标准动力学中分析.对于较大的数据集(包括许多爆发),τcrit通常根据闭合留置持续时间的分布和闭合留置持续时间直方图的检查确定(图2)[10]。在AChR的情况下,τcrit通常由拟合至最慢激活分量的指数与拟合至最快失敏分量的指数之间的交叉点指定[11]。将τcrit定义为两个分量之间的交叉点可以最大限度地减少错误分类的事件数量[9]。为了说明τcrit的赋值, 停留时间直方图以及scburst对burst进行2.zip对于本实施例,使用10 kHz高斯滤波器对单通道数据进行数字滤波,以提高信噪比,并确保使用50%阈值交叉标准可靠检测开口和开口。数字滤波与膜片钳的内置响应时间相结合,产生限制单通道数据的时间分辨率的阶跃响应。实际上,这意味着比由滤波阶跃响应的上升时间指定的持续时间更短的事件不会越过50%阈值,并且因此不会被阈值越过标准检测到。此外,测量的持续时间接近该“死区时间”的打开和关闭的持续时间scburst可以基于滤波后的4B.R. 德拉蒙德,C.J.G.Tessier,M.F.Dextraze等人粤公网安备44010802000018号=·=·=·=图二. 存在30 μ M乙酰胆碱时人体肌肉型乙酰胆碱受体的闭合持续时间直方图。 (A)未校正(黑色填充)和校正(白色填充)闭合持续时间直方图都覆盖在同一图上,该图具有线性y轴,以便于比较校正和未校正的闭合停留持续时间。停留时间校正主要影响其持续时间接近仪器死区时间。(B)与“A”中相同的校正闭合停留时间直方图已关闭的持续时间直方图用指数之和(虚线)拟合(实线)。y轴的平方根标度使闭合脱敏状态下长时间逗留(即爆发之间的闭合)产生的次要闭合分量可见,从而便于识别τcrit,τ crit定义为可归因于激活的最长闭合分量与可归因于脱敏的最短闭合分量之间的交点[11]。根据Colquhoun和Sigworth [5]描述的以下关系,具有给定上升时间的阶跃响应:图三. 基于突发Popen的突发分析和排序。(A)每个突发内花费的打开时间的比例被分箱到突发P打开直方图中。extremevaluesR包根据其Popen确定哪些突发是部分(wt2 3)1正态分布(黑线)。不属于正态分布的离群值(黑色条),以及其P开放大于平均值的两个标准偏差的那些爆发(灰色条),从下游动力学其中,w0是实际的停留持续时间(即,停留为了简单起见,上升时间(Tr)和比例因子被组合并由系数表示a1 、 a2 和 a3 ( a10 的 情 况 。 5382Tr;a20.837Tr−2;a31.120Tr−3)。为了在scburst中实现这种校正,是滤波阶跃响应的10%-90%上升时间的精确测量值,应在用于理想化的相同滤波器条件下获取。要根据上述关系校正测量的停留持续时间,请输入以下内容:>dwells_c<-上升时间。correct_gaussian(Tr=35. 0,驻留,单位=(六)、其中上升时间(Tr35. 0µ s),默认单位为秒,但可以如上所述指定如前所述,持续时间接近死区时间的短暂停留受上述校正的影响最大。因此,通过比较未校正和校正的停留时间直方图中最快的打开和关闭的持续时间,可以很容易地确认校正(图2)。 2A)。为了用这个更大的数据集定义爆发,根据校正后的闭合停留时间直方图(图2B),并且如以上步骤(4)中概述的那样定义爆发, 但是τcrit为92 ms。为了确定当前突发的均匀性,我们确定了通道在每个突发内打开的时间比例(即突发P打开),并将其分组以绘制突发P打开直方图(图11)。第3A段)。从该直方图中可以明显看出,大多数爆发的P开口分布在平均值接近0.7的为了基于P开放来去除异常爆发,我们实现了用于识别和客观地丢弃离群值的R协议。extremevaluesR包确定数据集中的哪些数据符合正态分布,从而确定哪些数据点属于正态分布分析. (B)具有P开放的单通道活动的选定突发,把它们放在“A”中指定的箱子里开口是向上偏转,并且迹线被数字滤波到10 kHz。正态分布[18]。为了确保下游动力学分析中爆发的均匀性,我们使用极值来确定哪些爆发是基于其P开放正态分布的,并删除P开放与平均值的标准差超过两个的爆发(图2)。 3;参见补充文件2.zip以实现极值,以及本示例的完整工作流)。生成的均匀爆发可以导出为“dwt "文件,用于QUB/MIL中的动力学分析。一些斑块表现出异质爆发活动[19]。 在这种情况下,隔离爆发的不同子群体可能是有益的,使得它们可以被单独分析。补充图1描绘了具有至少两个爆发亚群的场景,所述爆发亚群具有不同的平均P开放。为了在这些亚群中分离爆发,我们再次转向现有的R包。mixtools包包含用于近似复杂分布中每个分量的统计参数的函数[20]。作为一个初始近似,mixtools被用来估计的平均值和标准差的两个组成部分的爆发与发散P开放。基于这些初始估计,去除了在高或低P开放爆发的两个标准差内的爆发,并且在每种情况下,剩余的爆发然后经受上述极值方案以识别离群值。尽管上述示例仅包括两个电导水平(即0或1),但某些通道在单个突发内显示多个电导水平[21]。可以使用scburst将包含任意数量电导水平的理想化单通道数据导入R(详细示例参见补充图2,以及包含“exam-ple 4. dwt”的补充文件4.zipwo=wt+a1exp-一个- a2wt −a3wt,wt> 0(方程10)。第一章B.R. 德拉蒙德,C.J.G.Tessier,M.F.Dextraze等人粤公网安备44010802000018号54. 影响R和scbursts包是开源的、跨平台的、可扩展的,并且是免费的,从而促进了单通道突发排序的透明性和客观性。通过允许将单通道数据导入R环境,scburst将R的统计能力和多功能性引入单通道分析。R环境在不断发展,具有新应用和单通道分析潜在用途的包事实上,为了根据它们的P开放来选择爆发,我们转向了R中的现有软件包(极值和混合工具),这允许我们在动力学分析之前根据它们的P开放来这些例子直接证明了在R中实现单通道突发分析的容易性突发排序过程的完整性,以及因此的整体单通道分析。由于能够从各种不同的数据中读取理想化的数据,作为单通道分析软件包的一部分,scburst在R环境中以通用格式统一了单通道数据。我们预计,这将有助于不同的理想化算法和软件包之间的有意义的比较,确保最大的信息是从宝贵的单通道数据中提取。考虑到用于解释单通道活动的机械方案的复杂性增加[22-5. 结论我们已经介绍了scburst,一个R软件包,用于将理想化的单通道数据解析成脉冲串,然后分析和排序脉冲串用于下游动力学分析。来自各种单通道分析软件包的理想化数据可以使用标准R脚本直接读入R环境。表示为关闭到打开和打开到关闭过渡时间的数据可以转换为相应的打开和关闭停留持续时间系列由于过滤而系统性改变的测量持续时间可根据以下内容进行校正一个已知的上升时间,然后被解析成由用户指定的临界关闭持续时间(τcrit)定义的单通道活动的突发。然后可以基于各种参数(例如每个突发的开口数量或突发开口概率(Popen))来分析和分类所得到的突发。最后,尽管scburst是专门为单通道数据设计的,但它也可以用于分析其他单分子数据,以及任何表现出突发样活性的多状态随机过程。竞合利益作者声明,他们与其作者身份或本文的发表没有利益冲突CRediT作者贡献声明布莱尔河概念化,方法论,软件,写作-评论&编辑. 克里斯蒂安·J·G Tessier:形式分析,方法论,验证,写作-评论&编辑。马修·F Dextraze:方法学,软件,验证,写作-审查&编辑. Corrie J.B.daCosta:概念化,资金获取,方法论,监督,写作-原始草案,写作-审查&编辑。致谢我们感谢Remigijus Lape对SCAN的帮助这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会发现资助(RGPIN-2016-04801)和加拿大卫生研究院研究项目资助(377068)的部分支持。附录A. 补充数据与本文相关的补充材料可以在https://doi.org/10.1016/j.softx.2019.100285上找到。引用[1]Sivilotti L , Colquhoun D. 单 通 道 动 力 学 的 赞 美 。 J Gen Physiol 2016.http://dx.doi.org/10.1085/jgp.201611649网站。[2]Neher E , Sakmann B. 青 蛙 失 神 经 肌 肉 纤 维 膜 记 录 的 单 通 道 电 流 。Nature1976;260:799-802.[3]放 大 图 片 作 者 : J. 在 培 养 的 大 鼠 肌 细 胞 中 观 察 到 单 一 Na+ 通 道 电 流 。Nature1980;287:447-9.[4]Hamill OP,Marty A,Neher E,Sakmann B,Sigworth FJ.改进的膜片钳技术用于细胞和无细胞膜膜片的高分辨率电流记录。Pflugers Arch1981;391:85-100.[5] Colquhoun D,Sigworth FJ.单道记录的拟合与统计分析In:Sakmann B,Neher E , editors. 单 通 道 录 音 第 二 版 Boston , MA : Springer; 1995 ,http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4419-1229-9_19.[6] 正弦SM。终板乙酰胆碱受体:结构、机制、药理学和疾病。Physiol Rev2012;92:1189-234。http://dx.doi.org/10的网站。1152/physrev.00015.2011。[7]Colquhoun D,Hawkes AG.论单离子通道开放脉冲群和脉冲群的随机特性。Phil Trans R Soc Lond B1982;300:1-59.[8]Colquhoun D,Sakmann B.乙酰胆碱及其类似物激活蛙肌终板单通道电流的快速事件。J Physiol1985;369:501-57.[9]Jackson MB,Wong BS,Morris CE,Lecar H,Christian CN.同一乙酰胆碱受体通道的连续开放与开放时间 相关。生物物理学杂志1983;42:109-14.http://dx.doi.org/10.1016/S0006-3495(83)84375-6.[10]Magleby KL,Pallotta BS.培养大鼠肌肉单一钙激活钾通道的爆发动力学。JPhysiol1983;344:605-23.[11]Sine SM,Claudio T,Sigworth FJ.小鼠成纤维细胞中表达的鱼雷乙酰胆碱受体 的 激 活 。 单 通 道 电 流 动 力 学 揭 示 了 不 同 激 动 剂 结 合 亲 和 力 。J GenPhysiol1990;96:395-437.[12]奥尔巴赫A,林格尔CJ。非洲爪蟾肌细胞大电导和小电导胆碱能离子通道主要动力学模式的激活。JPhysiol1987;393:437-66.[13]Sine SM,Steinbach JH.高浓度激动剂对克隆哺乳动物BC 3 H-1细胞上乙酰胆碱受体的激活。J Physiol1987;385:325-59.[14]Wang HL,Auerbach A,Bren N,Ohno K,Engel AG,Sine SM.乙酰胆碱受 体 α 亚 单 位 M1 结 构 域 的 突 变 降 低 激 动 剂 解 离 速 率 。 J Gen Physiol1997;109:757[15]Bouzat C,Barrantes F,Sine S.烟碱受体第四跨膜结构域:保守苏氨酸的氢键作用促进通道门控动力学。普通生理学杂志2000;115:663-72.[16]R核心团队R:统计计算的语言和环境。奥地利维也纳:R Foundation forStatistical Computing; 2019,URLhttps://www.R-project.org/网站。[17]Sigworth FJ,Sine SM.数据转换,用于改进单通道驻留时间直方图的显示和拟合。生物物理学杂志1987;52:1047-54. 网址://dx.doi.org/10.1016/S0006-3495(87)83298-8.[18]van der Loo MPJ。极值:单变量数据中的离群值检测。2010,http://www.r-project.org。[19]奥尔巴赫A,林格尔CJ。非洲爪蟾肌细胞乙酰胆碱受体通道的不均一动力学特性。J Physiol1986;378:119-40.[20]Benaglia T,Chauveau D,Hunter DR,Young DS. mixtools:用于分析有限混合模型的R软件包。统计软件杂志2009;32:1[21]张伟,李晓,刘晓波.突变型NMDA受体通道动力学、钙离子和电压依赖性的亚电导状态。JGenPhysiol1997;109:181-9.http://dx.doi.org/10.1085/jgp.109.2.181网站。6B.R. 德拉蒙德,C.J.G.Tessier,M.F.Dextraze等人粤公网安备44010802000018号[22]Lape R,Colquhoun D,Sivilotti LG.关于烟碱受体超家族中部分激动作用的性质。Nature 2008;454:722-7. http://dx.doi.org/10.1038/nature07139.[23] Mukhtasimova N,Lee WY,Wang H-L,Sine SM.检测和捕获引发烟碱受 体 通 道 开 放 的 中 间 状 态 。 Nature2009;459 : 451-4.http://dx.doi.org/10.1038/nature07923网站。[24]Gupta S,Chakraborty S,Vij R,Auerbach A.基于结构、偶联、phi和flip的乙 酰 胆 碱 受 体 门 控 机 制 。 JGenPhysiol2017;149 : 85-103.http://dx.doi.org/10.1085/jgp.201611673网站。[25]Mukhtasimova N,daCosta CJB,Sine SM.单通道停留时间分辨率的提高揭示了结合、引发和门控的机制肌肉乙酰胆碱受体J Gen Physiol 2016;148:43-63.http://dx.doi.org/10.1085/jgp.201611584.
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