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工程5(2019)140免疫学研究综述从药物开发角度看陈芳a,b,刘晓,陈晓.Fraiettaa,b,c,Carl H.六月a,b,c,d,中卫徐e,J. Joseph Melenhorsta,b,c,Simon F.莱西a,b,ca病理学和实验室医学系,宾夕法尼亚大学,费城,PA 19104,美国b细胞免疫疗法中心,宾夕法尼亚大学,费城,PA 19104,美国c宾夕法尼亚大学帕克癌症免疫治疗研究所,费城,PA 19104,美国d宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心,费城,PA 19104,美国e北京大学免疫学系,北京100871阿提奇莱因福奥文章历史记录:2018年7月3日收到2018年10月19日修订2018年11月15日接受在线提供2018年保留字:工程化T细胞疗法嵌合抗原受体药物开发过程生物标志物CD19特异性嵌合抗原受体抗CD19嵌合抗原受体T细胞A B S T R A C T癌症是全球主要的死亡原因之一。细胞治疗的最新进展表明,该平台有可能为某些癌症患者提供第二次生命机会。与化合物和蛋白质不同,细胞是活的、自我复制的药物,可以被设计成具有精确的特异性。例如,T细胞可以被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR),赋予它们识别和杀死肿瘤细胞的能力,并形成一个记忆库,随时准备反击持续存在的恶性细胞。抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART19)已证明对某些恶性肿瘤具有显著的临床疗效开发CART 19的过程基本上遵循传统的“一个基因,一种药物,一种疾病”的范式,来自保罗·埃利希的“魔术子弹”概念。随着制药行业的主要参与者联合起来将这种新类别的“活性药物”商业化,使用CART 19作为一个例子来检查其开发中的相似性和差异是有用的,与传统药物相比。通过这种方式,我们可以吸收现有的知识,并确定推进类似战略的最有效方法。本文综述了使用基于生物标志物的测定来指导CAR构建体的优化、临床前研究以及临床疗效评价、不良反应(AE)和CART 19细胞动力学。还讨论了能够发现最佳靶标、新型CAR结合结构域和预测临床应答和AE的生物标志物的先进技术和计算我们相信,CART 19的成功将导致其他工程T细胞疗法的发展,就像发现阿司那明开创了合成药物时代一样。©2019 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版,高等教育出版社有限公司。这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。1. 介绍自从1796年和1928年分别发现和开发出第一种疫苗和第一种抗生素以来,天花或霍乱等传染病的死亡率显著下降。在发达国家,预期寿命已从平均47岁大幅增加到80岁[1因此,癌症已经上升为世界上最具灾难性的疾病之一在美国-一个拥有最先进的癌症治疗方法的国家*通讯作者。电子邮件地址:chenfang@pennmedicine.upenn.edu(F. Chen)。疾病仍然是第二大死亡原因; 2015年有595930人死于疾病,仅比死于心脏病的人数少37912人[4]。尽管在尼克松总统宣布对癌症宣战之前和之后,最近,已经开发了几种新的治疗方法,为改善癌症提供了前景,包括免疫调节和工程重定向细胞疗法(图1)。来自临床试验NCT00924326的数据显示,自体抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART19)能够诱导晚期肿瘤的消退。https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.11.0102095-8099/©2019 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页:www.elsevier.com/locate/engF. Chen等人 /工程5(2019)140-149141Fig. 1.根据作用机制对各种癌症疗法进行分类。* :通过靶向肿瘤特异性基因衍生的治疗功能; **:与癌细胞表面靶结合并导致癌细胞死亡的单克隆抗体(mAB),例如,曲妥珠单抗; *:检查点抑制剂,例如,派姆单抗;阿瑟:抗体; immTAC:针对癌症的免疫动员单克隆T细胞受体; BiTE:双特异性T细胞受体; TIL:肿瘤浸润淋巴细胞; CAR:嵌合抗原受体;TCR:T细胞受体。滤泡性淋巴瘤患者。与临床结果平行,B系细胞在治疗后至少39周被根除,这归因于CART 19治疗[6]。2011年,我们在宾夕法尼亚大学的研究小组和我们的同事发表了两篇论文,描述了使用自体CART19疗法成功治疗复发性难治性慢性淋巴细胞白血病(R/R CLL)患者[7,8]。这些报告首次证明了靶向CD19恶性肿瘤的工程化T细胞可以在人类中具有持久的治疗效果。为了清楚地定义和区分CART 19疗法与其他治疗方式,图图1显示了基于药物靶标的作用机制分类的当前癌症治疗的示意图。癌症治疗可以分为非免疫疗法和免疫疗法。免疫疗法是直接调节患者自身免疫系统以实现有益临床结果的治疗与免疫疗法相比,所有其他癌症疗法都被归为非免疫疗法类别。溶瘤病毒(OV)治疗具有两组的特征,因为它们直接杀死细胞并诱导抗肿瘤免疫。因此,考夫曼等人[10]已经将OV治疗描述为一类新的免疫治疗药物。每组可进一步分为靶向治疗和非靶向治疗。靶向治疗是基于分子水平上的癌症特异性靶点开发的治疗,其由于靶点接合而导致特异性癌细胞杀伤[11,12]。与靶向治疗相反,所有其他药物均属于非靶向治疗组。在靶向免疫疗法的类别下,存在称为过继细胞疗法的亚组,其由离体扩增的未修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、工程化T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)T细胞组成[13]。癌症的连续性T细胞转移疗法旨在增强T细胞对抗癌细胞的活性靶向CD 19的CART19疗法由工程化的自体/同种异体T细胞组成,所述T细胞已经特异性地定向靶向在大多数B细胞上表达的CD 19蛋白。这些T细胞经过识别和杀死B细胞。在最近对20项已发表的CAR T细胞临床试验的回顾中,11项是CART 19试验。11项试验中有10项证明了B细胞恶性肿瘤患者的一些临床获益[14]。来自NCT 02435849的数据已导致美国食品药品监督管理局(FDA)批准该疗法用于治疗25岁以下难治性或二次或更晚复发的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患者。现在被称为Kymriah(tisagenlecleucel)[15]。此后不久,FDA批准Yescarta(axicabtagene ciloleucel)用于治疗患有某些类型的大B细胞淋巴瘤的成人患者,这些患者对至少两种其他类型的治疗没有反应或在至少两种其他类型的治疗后复发[16]。随后,基于NCT 02030834的数据,Kymriah获批用于治疗大B细胞淋巴瘤[17]。CART 19疗法的成功已经作为工程化T细胞疗法的概念证明。它也象征着现代医学工程T细胞疗法新前沿的开始,可以直接攻击癌细胞或其他致病细胞,以治疗癌症或其他疾病[18CART 19疗法基本上通过遵循“一个基因、一种药物、一种疾病”的概念来开发,关于CD19特异性CAR(CAR 19)构建体的产生,其是活性药物成分(API)(图1A和1B)。2和3)[21,22]。然而,这是非常规的,因为CAR 19需要包装在减毒慢病毒或其他类型的载体中,并转导到患者自身的T细胞中这与常规药物制剂非常不同,常规药物制剂将API与其他惰性成分结合。常规药物制剂的目标是改善化合物的吸收、分布、代谢和消除(ADME),以最大限度地提高疗效并最小化不良反应(AE)[25]。由于CAR转基因永久整合到T细胞基因组中,因此与ADME等同的是细胞输注、运输、增殖、持续和凋亡[26]。从收集患者自身的T细胞开始,到最终制造CAR T细胞产品结束的过程涉及许多复杂的步骤和质量控制,这些步骤和142F. Chen等人/工程5(2019)140图2. 药物开发过程和技术影响:将工程化T细胞疗法开发过程融入传统药物发现和开发范式。目前未用于T细胞疗法的元件以灰色斜体表示PK:药代动力学; PD:药效学; AE:不良反应; CK:细胞动力学。图3.第三章。通过潜在客户优化周期识别API:将CAR构建完善程序融入潜在客户优化周期。目前未用于T细胞疗法的元件ID:鉴别; TV:靶标验证; HTS:高通量筛选; SAR:建立能够生产最终临床级CAR T细胞产品的制造中心与确定正确的药物靶标以构建用于临床开发的优化CAR一样重要[27]。这对制药行业来说是一个非常新的过程。本文主要以CART 19为例,阐述了CAR作为工程化T细胞治疗药物的活性成分,其临床前和临床开发与传统药物发现模式的异同。我们还强调了生物标志物在指导药物开发过程中的关键作用。此外,我们还讨论了先进技术和计算工具在识别更好的癌症特异性靶点、新型CAR结合结构域和生物标志物方面的影响,这些生物标志物可用于最大限度地提高临床结局并最大限度地降低毒性[28,29]。2. 工程化T细胞疗法的临床前阶段开发2.1. 目标识别与常规药物开发类似,靶点识别是基因-药物反向药理学方法的第一步(图2)2和3,表1)[30,31]。良好的靶点是实现最高药物疗效和最低AE发生率的最关键因素。在传统的药物开发过程中,理想药物靶点的确定是有一般规律的。药物靶点必须与疾病相关,这意味着靶点的调节可以产生有益的临床结果。它必须是靶点与理想的相应物质的结合将启动生物学作用,从而在临床环境中产生高获益和低AE从传统的角度来看,药物的可药性主要涉及可以与小分子化学品相互作用的药物靶点然而,随着科学和技术进步使单克隆抗体疗法得以成功开发,很明显,药物可药性实际上是由技术可用性决定的[32关于CAR T疗法,CAR构建体的结构域结构通常含有胞外域、跨膜(TM)结构域和胞内结构域。胞外域包含抗原结合区和铰链区,而胞内域由共刺激区和活化区组成(图4)[19,35]。CAR构建体的结合位点/特异性通常来源于CAR构建体的结合位点/特异性。F. Chen等人 /工程5(2019)140-149143表1传统药物发现和开发过程与基于CAR的活性药物发现和开发过程的比较。发展阶段常规工艺基于CAR的过程目标识别与疾病相关、可用药且有益与疾病相关、可用药且有益目标类酶、受体和细胞外分子细胞外分子靶标验证药物可药性、特异性、疾病相关性和临床获益药物可药性、特异性、疾病相关性和临床获益电极导线识别优化点击率、销售线索和销售线索优化基于域函数临床前生物学试验体外活性、体内PK和PD体外活性、体内CK和PD0期测试概念验证分子不落实一期安全性评价安全性/疗效二期疗效/安全性疗效/安全性,III期获益/风险不落实FDA审查/IV确认安全性和有效性,上市后监测确认安全性和有效性,上市后监测图4.当前CAR19构建体之一中的主要元件。scFv:单链片段可变区; EF-1a:延伸因子-1a; hCD 8a:人CD 8a; 4-1BB:人CD 137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF 9);CD 3f:T细胞表面糖蛋白CD 3f链或T细胞受体T3f链;VH:重链可变区;VL:轻链可变区。抗体的单链片段可变(scFv)区,其可接近所选靶标,例如CAR19的抗人B细胞抗体(FMC63)的scFv区[36,37]。因此,所有细胞外分子在CAR的背景下都是可药物化的,只要可以针对这些靶抗原产生抗体CAR的理想癌症药物靶标是癌症特异性的、细胞外的并且与抗体相互作用。CAR已被工程化以靶向细胞表面上的蛋白质、糖肽和神经节苷脂[38 与基于CAR的工程化T细胞疗法不同,基于工程化"转基因”TCR(tgTCR)的方法不限于膜抗原[41]。然而,基于CAR的疗法不依赖于靶细胞的抗原加工或主要组织相容性复合体(MHC)表达[35,42]。已使用以下标准选择工程化T细胞疗法的癌症靶标:①新抗原-即肿瘤特异性突变,如表皮生长因子受体变体3(EGFRvIII)[43-睾丸癌/睾丸(CT)抗原,例如NY-ESO-1,一种胞质蛋白,其在MHCI类的背景下被加工和呈递以用于TCR识别[48,49];以及抗肿瘤病毒癌基因,例如HPV-16 E6[50]。迄今为止,CAR T疗法最成功的应用是将T细胞重定向到靶向CD19。自20世纪80年代以来,已知CD19是一种95 kDa单一TM糖蛋白,是治疗B细胞恶性肿瘤的理想靶点[51]。氨基酸残基1-残基274在一个复杂的,除了细胞膜上的CD 21和CD 81外,CD 19作为B细胞受体(BCR)的共受体发挥作用,极大地增敏/增强BCR活性[53,54]。除了造血干细胞(HSC)和某些浆细胞外,CD19在所有阶段的B细胞上普遍表达它也在大多数B系白血病和淋巴瘤细胞上表达[51,55]。预期成功的过继性CART 19转移将消除B系恶性肿瘤和正常B细胞,导致B细胞发育不全。由于治疗不能根除重要的HSC,并且B细胞再生障碍可通过静脉内免疫球蛋白替代治疗,CD19是通过CART细胞过继转移消除B系恶性肿瘤的极好靶标,因为其抗体可及性、肿瘤特异性和非致死性正常器官组织分布[46,56]。2.2. 靶标验证在过去的几十年中,基于基因的药物开发中的常规药物靶点验证过程在制药工业中已经非常系统。该过程开始于评估目标的一般信息,诸如目标类(即,受体、酶等),不同物种、基因家族和组织/细胞分布之间的序列同源性。药物靶标的疾病关联通过天然存在的突变来揭示,这可能是某些靶标的情况,例如硬化蛋白[57]。 通过遗传模型(如基因敲除小鼠模型)证明了药物靶点疾病相关性,该模型在缺乏药物靶点的情况下将显示出有益或AE[30,58]。接下来,需要在动物模型中使用候选药物通过增加或降低其活性来操纵药物靶标时证明有益的治疗结果。该药物靶点在临床试验中得到进一步验证目标验证过程与活性药物成分的开发同步。FDA对药物的批准是对相应药物靶点的最终验证144F. Chen等人/工程5(2019)140由于工程改造的T细胞疗法通过消除靶基因特异性CAR识别的靶细胞来发挥其临床益处,因此靶基因敲除模型与这种药物靶标验证模式无关此外,药物靶点选择集中在对需要去除的细胞(如癌细胞)具有特异性的分子上。因此,工程化T细胞疗法的靶标验证是证明工程化T细胞可以在基于细胞的测定中选择性裂解预期靶细胞并消除/抑制异种移植小鼠模型中靶细胞生长例如,已经显示用各种CAR19构建体转导的T细胞裂解表达⑶ 19的细胞。使用免疫缺陷小鼠异种移植模型进一步证明CART 19细胞表现出抗B细胞恶性肿瘤[37,59]。2.3. 候选药物开发经过100多年的合成药物开发历史,已经建立了一种称为结构-活性关系(SAR)药物先导物优化过程的常规程序,通过广泛的体外试验筛选,在动物模型中测试具有所需生物活性和药代动力学(PK)特征的选定化合物,以进一步验证其体内PK和药效学(PD)。PD包括来自测试化合物的功效和AE的测量。这是一个严重依赖现有技术和生物标志物的过程,可以测量这些生物标志物以揭示化合物的活性。目前这一代CAR构建体已经使用合理的设计原理进行了工程化,这已经产生了用于在基于细胞的测定和小鼠模型中验证的主要候选物(表1)[37,60在小鼠模型和患者中评价工程化T细胞的输注后PK特征也很重要;然而,由于药物是活细胞的形式,因此目前在此背景下采用术语细胞动力学(CK)正如我们最近的研究所讨论的,许多传统的PK分析概念,如最大血浆药物浓度(Cmax)、血浆浓度-时间曲线下面积尽管工程化T细胞疗法仅处于商业化的早期阶段,但从靶基因的选择到候选药物的产生的过程对于目前报道的靶点来说是非常在先导化合物优化和筛选药物阶段,实施的测定和技术平台与用于靶标验证的相同。候选药物开发的步骤如下:首先,鉴定识别所选药物靶标的抗体第二,通过将scFv插入到建立的CAR骨架中来制备CAR构建体。我们使用的CAR骨干之一组包含4-1BB/CD3 f信令域对于co-刺激和激活功能,CD8a铰链区,和TM域(Fig. 4)。细胞外结构域含有对药物靶标具有特异性的CD 8α和scFv[37,59第三,在慢病毒包装和转导到活化的人T细胞中之前进行构建体的DNA序列确认;这与离体细胞扩增相结合[27]。最终CAR T细胞的活性在临床前模型中进行了广泛研究Milone等人[37]报告了关于CAR 19构建体优化的详细研究,其作为工程化T细胞疗法的候选药物/API优化过程的教科书针对其表达启动子和细胞内共刺激/活化结构域优化最终的CAR 19构建体(图1B)。 4)。在体外研究中,他们首先评估了不同启动子对基因表达的影响,以选择一种在细胞中提供CAR19高和稳定表达的启动子。CD 4和CD 8 T细胞;他们选择了延伸因子-la(EF-la)启动子。其次,他们通过流式细胞术/蛋白质印迹和使用含有EF-1a启动子和各种共刺激/活化结构域的构建体的离体细胞扩增来这些结果证实了由相同启动子调节的各种CAR 19的相似表达水平,但在活性方面没有区分含有不同共刺激/活化结构域的构建体如细胞毒性或细胞因子产生。第三,通过细胞毒性测定评估CART19的细胞功能CART19与K562野生型(Kwt)和表达⑶ 19的K562(K19)的孵育证明,含有4-1BB/⑶ 3 f结构域的CART 19在裂解K19方面效果最好,在⑶ 19阴性Kwt细胞中具有最小的细胞溶解活性。该构建体还有效地裂解表达生理水平的CD19的人原代前B ALL细胞第四,通过测量相应CART 19的细胞因子产生来进行各种CAR 19构建体的进一步分析将表达不同CAR 19的CART 19 CD 4+和CD 8+ T细胞与K19/Kwt孵育,并测量和分析细胞上清液中白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-c、IL-4和IL-10的水平。这些结果清楚地表明,不同的CAR 19具有不同的细胞因子产生活性。第五,他们继续评估CART19与K19细胞结合引发的T细胞增殖。在该测定中清楚地揭示了共刺激/活化结构域的差异,并且含有4-1BB/CD 3f结构域的CART19细胞显示出CD 19抗原非依赖性增殖能力。使用人前B ALL的免疫缺陷小鼠模型对用不同CAR 19转导的CART19进行进一步评估体内数据再次揭示了各种CART 19产品之间的功能差异,并证明了含有4-1BB/CD 3f结构域的CART 19细胞的优异的体内抗白血病功效。关于各种CART 19产物的体外和体内数据导致最终选择含有EF-1a_4-1BB/CD 3/ CAR 19构建体的CART 19患者特异性T细胞产物作为候选药物。2.4. CAR 19的scFv和信号结构域选择的历史预览在CART 19工程化时代之前已经描述了几种小鼠抗人CD19单克隆抗体(CD19)。Uckun等人[51]广泛表征了B43单克隆抗体(mAB),一种通过用分离自伯基特淋巴瘤的肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠而衍生的a此外,克隆FMC63、HIB19和4G7是在临床方法和研究中广泛使用的针对CD19的抗体。通过用B细胞CLL(B-CLL)免疫BALB/c小鼠产生B4mAB[63]。HD 37单克隆抗体通过用来自毛细胞白血病患者的细胞免疫BALB/c小鼠而产生[55]。通过分别用NALM 1 + NALM 16细胞和B-CLL免疫小鼠来衍生SJ 25-C1和4G 7(BioLe gend)。通过用B-CLL细胞系JVM 3免疫BALB/c小鼠来衍生FMC 63[64]。未发现AB1、BU12、F974A2或HIB19的免疫原信息。注意到HIB19部分阻断B43(BD Biosciences)的结合,而已经证明FMC63阻断HIB19或SJ25C1的结合[65]。现有的数据不可避免地导致以下结论:上述所有α-CD 19在类似的免疫原性区域中与CD19的胞外结构域相互作用。这些αCD19的另一个共同点是,已知的免疫原都是恶性B细胞上的人CD19的内源性形式。由Juno、Kite Pharama、Novartis、Fred Hutchinson癌症研究中心和中国人民解放军总医院赞助的主要报道的CART 19试验均使用鼠抗CD 19scFv-inF. Chen等人 /工程5(2019)140-149145在Juno的情况下,这些衍生自SJ 25-C1,而其余衍生自FMC 63[64,66]。Blinatumomab是一种最近获得FDA批准的双特异性T细胞增殖剂,含有源自HD 37的CD19 scFv[55,67]。在临床试验中,一些患者报告了针对鼠scFv区的T细胞而非B细胞免疫反应已经努力使scFv区人源化以降低源自CAR19转基因的免疫原性[68,69]。大多数CART 19试验采用了含有CD 28或4-1BB共刺激结构域的第二代CAR[14,66]。在他们的临床前CART 19评价中,Milone et al.[37]显示了与CD 28相比的数据,以证明4- 1BB具有最小的IL-4和IL-10诱导、CD 19非依赖性CART 19增殖、小鼠中更好的植入/持久性和更好的抗肿瘤功效。在ALL试验中,CD 28和4-1BB在缓解率和毒性方面表现相似,尽管存在细微差异。利用CD28和4-1BB CART 19的共输注的研究可能能够描绘两者的性质。共刺激结构域[70]。3. 工程化T细胞疗法的临床阶段发展3.1. 工程化T细胞治疗临床试验设计对于常规药物开发,有一种系统的方法来测试候选药物(图2,表1)[30]。靶向癌症治疗与旧的化疗/细胞毒性不同。这些药物的临床试验设计强调靶向参与。在试验中评价了三个水平的靶向药效学终点;这些终点包括机制证明(POM)的靶向参与、原理证明(POP)的表型变化和概念证明(POC)的临床结局[71]。在过去的二十年里,制药公司一直在努力提高成功率,降低制造新药的成本和时间对不完美的候选药物-概念验证分子(POCM)进行0期试验,以获得临床见解并快速做出Go/No-go决定[72]。这一新的学科已经成为所谓的探索医学、实验医学、转化医学或发展医学。该学科旨在弥合临床前动物研究和临床试验之间的差距,因为许多动物模型无法预测临床结果。0期的主要目标可以是通过微量给药评价候选药物的PK/PD,对几种不完美的候选药物进行排名,和/或通过生物标志物验证候选药物的POM和POP[71]。I期临床试验的主要目的是安全性评价以及确定候选药物的最大耐受剂量在这种情况下,将记录PK特征、毒性和PD数据。通常,I期试验包括20-100名健康志愿者II期的主要目的是评价药物疗效并进行进一步的安全性评价。进一步记录PK特征、毒性和PD数据。这项研究招募了20III期的主要目标是评估临床结局和总体风险-受益评价方面有效性的其他信息进一步记录PK特征、毒性和PD数据这项研究招募了300IV期研究是上市后监测试验。在这些研究中,主要目标是进行安全性监测和确定药物的其他用途[73]。CART 19疗法的临床试验设计是上述范例的修改版本(表1)。随着药物被这是许多复发性难治性乳腺癌患者的最后手段,CD19+ B细胞恶性肿瘤,并且由于CART 19在2017年之前是一种有前景的实验药物,因此试验设计是上述常规试验和扩大使用的组合[74]。已发表的I期研究,如NCT 01626495和NCT 01029366,均在终末期患者中进行除了评价治疗的安全性和可行性的主要目的外,还纳入了许多次要目的,以证明POM、POP和POC,并研究CART19 CK、分化和宿主免疫原性[8,75]。NCT 01626495的II期研究NCT 02435849(ELIANA)的主要目的是次要目的是广泛的,目的是进一步了解该疗法的疗效如ELIANA所证明的,CART 19令人印象深刻的临床益处导致FDA批准该药物,其作为Kymriah上市[15]。3.2. 在临床中评估工程化T细胞疗法尽管制药行业是开发CAR T细胞疗法的新手,但学术研究人员已经为工程化T细胞疗法的临床开发建立了系统的管道。已经报告了关于评价患者POM、POP和POC以进行PD评价; CART 19的持续性以进行CK评价;以及尼古丁释放综合征(CRS)/靶向组织脱落以进行AE/安全性评价的大量详细信息。本研究总结如下[8,26,75评价POM的方法。通过测量当CART19与CD19+ B细胞相互作用时释放的血清中的生物标志物来评估CAR 19与靶细胞表面上的在治疗后不同时间点采集的患者血清和骨髓(BM)样本中测量了一组包含细胞因子、趋化因子(30重)和其他的30种分析物[8]。分析物如IL-6、IFN-c和IL-8的升高这些分析物可以使用商业Luminex基于珠的测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量。此外,CART 19细胞的体内扩增是证明靶接合活性的另一个参数。CAR19+细胞的扩增可以通过流式细胞术通过对CD3+和CAR19+细胞设门来确定,或通过使用CAR19构建体特异性引物对对对外周血基因组DNA进行定量聚合酶链反应(qPCR)来确定[8]。评估POP的方法。研究表型变化的测定包括绝对淋巴细胞计数(ALC)、通过对CD19+和CD20+ B细胞设门的流式细胞术进行的CD19+B细胞计数CD 19+ B细胞的减少是POP的明确证据。方法评价POC。这些方法评价了达到POM和POP后对患者的临床受益关于肿瘤负荷消除、无事件生存期和治疗后感觉更健康的结果都是支持POC的证据这不是一个多余的评估,因为对于在POM和POP实现的同时发生CD 19-B细胞白血病的患者。评估CAR19+细胞CK的方法。治疗后随时间推移的CK评价与工程化T细胞疗法比PK研究更相关。CAR19+细胞可以在不同时间点在血清、BM或脑脊液(CSF)样品中通过流式细胞术通过对CD3+和CAR19+细胞设门来测定。CAR19构建体的存在也可以通过对从外周血或其他组织提取的基因组DNA(gDNA)的qPCR或数字PCR随时间定量,并表示为每微克gDNA的拷贝数。流量和qPCR数据彼此相关,而PCR方法可能更灵敏。类似146F. Chen等人/工程5(2019)140可以从上述测量结果中推导出PK参数,例如AUC、半衰期(T1/2)等[26]。评估持续CART 19细胞功能的方法。持续CART 19的效应子功能可以通过使用CD107α作为标志物的脱粒测定来确认[78]。 对于脱粒测定,收集不同输注后时间点的CART 19并与靶细胞一起孵育。然后使用与CAR19标记物配对的脱粒标记物CD107a通过流式细胞术分析细胞[8]。另一种方法是测量共培养细胞上清液中的IFN-c水平,这也评价了CART 19功能[37,62]。评价AE的方法。CRS是这种治疗方式中的主要靶向AE。上述30重测定或其它多重测定组可用于监测治疗后效应,例如IL-6、IFN-c和IL-8的升高。其他临床症状包括发热、肌痛和恶心。对于一些患者,由于低血压、毛细血管渗漏和缺氧而需要重症监护。巨噬细胞活化综合征可能与CRS同时发生,表现为高水平的铁蛋白、C反应蛋白和可溶性IL-2受体[75B细胞再生障碍性贫血是该治疗中的一种靶向非致死性AE;它是有益临床结局的指标,可通过静脉注射免疫球蛋白补充进行管理[46]。CAR19的免疫原性是这类药物的一个问题。然而,在多项研究中,输注后几个月存在CAR19细胞,表明不存在免疫原性[8,15,26,76]。然而,Turtle et al.[68]报道了一些患者对CAR19的T细胞免疫应答体液反应的缺乏并不奇怪,因为治疗根除了B细胞。然而,在大多数患者中,含CAR 19的鼠scFv和源自嵌合蛋白的新型连接区的细胞排斥的缺乏可归因于环磷酰胺/氟达拉滨淋巴细胞清除治疗[79]。在几项CART 19试验中报告了神经系统不良事件。在NCT02435849试验中,40%的患者在输注后8周内出现一些神经系统问题[15]。在NCT02348216试验中,64%的患者有神经系统症状,其中28%为3级及以上[16]。JunoGust等人报告了神经毒性的风险因素,如内皮激活和血脑屏障增加[81].4. 技术对工程化T细胞疗法的影响CART 19的成功标志着工程化T细胞治疗行业的开始我们预计这个行业的增长和成熟,通过不断进步的技术和人工智能实现。以下是技术和计算机辅助分析工具正在加强的一些领域的例子。4.1. 通过基因组学和生物信息学工具在后基因组时代,先进的基因组技术和生物信息学将不可避免地对肿瘤特异性靶标识别产生影响。鉴定癌症特异性突变蛋白质的基于质谱的多重蛋白质靶标分析方法已被证明是可行的;该方法可用于鉴定癌症生物标志物,用于诊断试剂盒开发或用于癌症治疗的新型靶向药物[82]。新抗原主要通过全外显子组测序,然后进行生物信息学分析来鉴定。此外,当该方法与TIL结合时,通过共培养多克隆TIL群体和用源自新抗原的串联小基因转染的抗原呈递细胞以及平行的单细胞RNA-seq进行筛选,可以鉴定新抗原特异性TCR和相应的新抗原[83,84]。通过深入挖掘多个公共转录组学数据库,在19种癌症类型中鉴定出具有CT表达模式的新基因[85]。4.2. 新型CAR结合结构域鉴定:组合抗体库尽管目前报道的CAR(如CAR19)是基于现有抗体构建的,但预计高通量筛选(HTS)和先导物优化过程将在未来工程化T细胞治疗开发中发挥关键作用(图3)[37,86]。用于小分子药物开发的筛选概念和技术可以容易地用于鉴定理想的CAR结合结构域[87]。正如组合化合物文库为小分子候选药物鉴定提供了新的化学平台一样,组合全人抗体文库将是挖掘含有新结合位点或不同结合亲和力的scFv的来源,其可用于构建具有所需特异性或亲和力的CAR[88预计HTS相关技术和计算工具将在工程化T细胞治疗组合的扩展中发挥重要作用。4.3. 发现生物标志物以预测CRS的发作并协助管理计划CART 19治疗相关CRS的范围可以从轻度到重度,并且发作时间不同。尽早预测治疗诱导的CRS的能力将改善有益的临床结局并减少AE。在通过基于Luminex微珠的多重测定对30种细胞因子/趋化因子和14种可溶性细胞因子受体进行的样本化患者样本的回顾性分析中,鉴定了几种预测性生物标志物特征例如,使用IFN-c、可溶性gp130(sgp 130)和IL-1受体拮抗剂(IL-1 RA)的三变量回归模型在输注后前3天准确预测了成人和儿童队列中哪些患者发生重度CRS使用sgp 130、单核细胞趋化蛋白-1(MCP 1)和嗜酸性粒细胞趋化因子的决策树模型也预测了患者CRS的发作[77]。此外,宾夕法尼亚大学和费城儿童医院的医生制定并实施了CRS分级方案和治疗计划,用于CRS管理,可优化疗效并最大限度地减少毒性[91]。4.4. 通过单一细胞上蛋白质和转录物的多重和同时定量的流式细胞术技术的最新进展-飞行时间流式细胞术(CyTOF)-有可能大大增加T细胞产物分析的通量和广泛性[92]。尽管关于这一主题的报道很少,但10x基因微滴微流控大规模并行单细胞测序工具有望通过同时实现单细胞上蛋白质和转录物的多重最近一篇关于通过测序对转录组和表位进行细胞索引的论文(CITE- seq)证明了使用10x Genomics平台和生物信息学分析来分析免疫细胞作为鉴定预测性生物标志物的策略的概念证明[93]。不久之后发表了一篇类似的论文,使用RNA表达和蛋白质测序分析(REAP-seq)进一步分析免疫细胞≤F. Chen等人 /工程5(2019)140-149147支持这一观点[94]。此外,NanoString最近公开了一种称为3D FlowTM分析的产品,其具有对分选细胞进行深度蛋白质组学和转录组学分析4.5. 发现生物标志物以预测工程化T细胞疗法很明显,所有水平的药物开发都依赖于生物标志物/测定来指导过程。工程化T细胞疗法中最棘手的问题之一是在制造患者特异性产品之前预测哪些患者可以从这种治疗中受益,因为这种疗法并不适用于每个人。在对41例CLL患者的CART 19临床产物进行的回顾性研究中,在转录组学和基于流式细胞术的蛋白质组学水平、血清蛋白质组学和功能研究方面取得了重大进展。通过转录组学分析揭示了这组样本的潜在预测基因标志物,例如与完全应答(CR)相关的早期记忆T细胞和IL-6/信号转导子和转录激活子3(STAT 3)基因特征的富集,而属于终末分化、耗竭、凋亡和糖酵解的已知途径的基因与无应答相关。多色流式细胞术数据的无偏生物信息学分析进一步揭示了高百分比的CD 27+ PD-1- CD8+ CAR T细胞与CR相关此外,高CAR T细胞产生前的CD 27+ CD 45 R 0- CD 8+T细胞水平与CR相关这些生物标志物可能会导致-这对有效制造工程化T细胞产品的过程有重要意义[95]。此外,大规模多重免疫测定已用于血清生物标志物鉴定和验证。基于Lumi-nex珠的液体阵列已经成为同时分析30种分析物的最受欢迎的平台。SomaLogic蛋白质组学平台利用功能类似于抗体的修饰的DNA适体。据报道,使用适体的多重测定在一个65 μ L的样品中同时定量>1100种蛋白质[96]。平面阵列,如高密度蛋白质阵列或抗体测定,在新的生物标志物鉴定中可能非常强大。OriGene已经制造了一种蛋白质阵列,在一张载玻片上一式两份地点样了大约17000 个样品。CDIHuProtTM微阵列在一张载玻片上包含来自16 152个基因的蛋白质,覆盖了约81%的蛋白质组。这些阵列可用于血清生物标志物发现以及其他应用。由抗体制成的阵列是另一种方法Wilson等人[97]广泛讨论了新生物标志物鉴定及其在药物发现和开发中的应用和意义。在处理高含量HTS时,生物信息学工具是必要的。需要低通量ELISA或低密度Luminex测定来验证生物标志物候选物,随后可以开发这些生物标志物候选物以制备伴随或补充诊断试剂盒[98]。全基因组关联研究(GWAS)是一种用于研究个体遗传背景的高通量基因分型技术平台结合生物信息学分析,GWAS可以在基因组水平上检测个体的数千个单核苷酸多态性(SNP)。来自大型队列研究的数据可以将SNP与某些临床结果相关联。这是识别预测性生物标志物的另一种策略,可作为伴随诊断并指导候选患者形成有效的治疗计划[99,100]。最近FDA批准的派姆单抗和纳武单抗及其诊断试验证明了伴随或补充诊断的重要性,以最大限度地提高疗效并最大限度地减少靶向治疗的AE[101]。预测产品是否有效的能力,哪种患者可以从这种治疗中受益对于使工程化T细胞成为主流疗法非常关键。5. 未来前景成功的CART 19疗法的重要性在于其能够证明T细胞可以被重编程以识别和杀死引起血液系统疾病以外的疾病的细胞它的治疗效果在基因上整合在T细胞中,并成为患者系统的一部分。这是一种非常个性化的药物;然而,单次输注的治疗益处可能持续一生工程化T细胞疗法在对抗癌症和某些其他疾病中的潜力将随着最近开发的基于TCR的CAR而进一步最大化,其结合了两种平台的优点并消除了每种方法的限制[41]。自1909年“魔术子弹”概念的提出和通过筛选合成化学品对阿司那明的开发以来随着生物化学的引入和对蛋白质功能的理解,酶和受体显然是治疗干预的良好靶点。到了20世纪80年代,当分子生物学影响到生物科学的各个领域时,保罗·埃利希的“神奇子弹”概念完全实现了。制药行业的药物开发集中在“一个基因,一种药物,一种疾病”的概念上,这导致了“神奇子弹”的发现,如立普妥和环丙沙星(图1和2)。第2和3段)。这一概念已成为20世纪现代药物开发的基础[30]。CART 19疗法的成功将Paul Ehrlich的“神奇子弹”概念提升就像arsphenamine导致合成制药行业的出现一样,我们预计CART 19疗法将导致工程T细胞疗法的类似发展。目前关于基因组的知识以及前所未有的技术和计算创新将进一步推进这一领域,使我们能够对抗癌症和其他疾病。确认作者感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞免疫治疗中心和艾布拉姆森癌症中心、帕克癌症免疫治疗研究所和北京大学的支持作者感谢Regina Young协调了本文的清理工作。遵守道德
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