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SoftwareX 9(2019)154MALTA:一个计算器,用于估计shRNA、CRISPR和cDNA文库作者:Mark A. Stamnes,Robert C. 派珀美国爱荷华大学分子生理学和生物物理学系,爱荷华州爱荷华市,52242ar t i cl e i nf o文章历史记录:2018年7月13日收到2019年1月8日收到修订版,2019年关键词:计算遗传筛选池库a b st ra ct使用shRNA、CRISPR或cDNA文库的遗传筛选依赖于将文库充分转移到细胞中用于进一步测定。这些文库可以具有许多不同的元件,并且每个元件可以以不同的拷贝数存在于给定的汇集文库中计算需要多少受体细胞才能对文库中的所有或大部分不同元素进行充分采样是很重要的,特别是如果人们想要比较依赖于准确复制含有文库的细胞的起始群体的不同遗传筛选的结果在这里,我们提出了一个简单的应用程序,开始与库元素及其丰度的列表,并计算最小采样数,以实现完全转移的库到受体细胞群体的用户指定的概率水平。用户可以调整几个输入参数,包括指定一个子群体进行计算。最后,该程序执行一系列用户指定数量的挑选的蒙特卡罗模拟,以产生每个库元素的经验确定的分布©2019作者由爱思唯尔公司出版这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)中找到。代码元数据当前代码版本v1.2代码的永久链接https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX_2018_106法律代码许可证MIT许可证使用Git的代码版本控制系统软件代码语言C++操作环境Qt 5 Mac/Windows/Linux如果可用,链接到开发人员文档/手册https://data.mendeley.com/datasets/53b9fcc8ph/draft?电话:03795802- 8 e83 -4145-8908-54cb0d502bffhttps://data.mendeley.com/datasets/c9h6ry4vx5/draft?a=7db191cf-135e-4ac1-acda-27b8b1a91034问题支持电子邮件venky. icloud.comrobert-piper@uiowa.edu规格表生物化学、遗传学和分子生物学更具体的主题领域遗传筛查方法名称在合并遗传筛选原始方法的名称和参考文献。不等概率息票收集《美国数学月刊》61,306-311(1954年)。资源可用性https://github.com/emptyewer/MALTA/releases1. 动机和意义*通讯作者。电子邮件地址:venky. icloud.com(V. Krishnamani),mark-stamnes@uiowa.eduwww.example.com Stamnes),robert-piper@uiowa.edu(R.C. Piper)。https://doi.org/10.1016/j.softx.2019.01.006在分子生物学中,文库是用于不同类型实验的遗传元件的集合,许多库由大量的元素集合组成,2352-7110/©2019作者。由爱思唯尔公司出版这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页:www.elsevier.com/locate/softx诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)154155××()(1−j=1−1−)。当不同的比例−- -=⋂在质粒载体内,质粒载体是独立于染色体DNA复制的双链DNA片段,并且易于在实验室中操作。单个质粒可以被工程化以表达特定的RNA,所述RNA继而可以被翻译成蛋白质,或可以形成酶复合物的一部分的RNA,所述酶复合物可以破坏特定基因(例如CRISPR/Cas9引导链gRNA)或通过RNA干扰抑制它们的表达(例如,RNA干扰)。 小发夹shRNA)[1- 4 ]。当编码不同蛋白质或RNA的特定质粒被收集在一起时,就形成了文库然后,这些文库提供了重要的工具来调查不同基因的功能,使得能够进行许多遗传筛选,其中可以评估给定文库中的每个元件(例如质粒)在引入单个细胞时改变特定生物过程的能力库基本上有两种不同的配置:阵列和池。当文库被排列时,文库中的每个元件(例如,表达一种特定基因的质粒)被分别容纳在存在于阵列内的不同管中。通过系统地分析来自阵列的每个不同另一种配置是将不同的质粒混合在一个池中。使用池库通常更容易,而且成本更低。当将文库的所有元件引入细胞中时,然后可以对它们进行遗传筛选或遗传选择,以检索干扰与所研究的生物过程相关的基因子集的文库元件子集[5汇集的文库可以具有许多不同的单个元件(例如1105然而,汇集的文库很少具有以相等丰度存在的所有元件,这使得难以计算给定文库中的所有类型的元件/质粒如何能够被充分采样。全面的遗传筛选依赖于实验条件,以确保对文库中的所有元素进行采样。当比较遗传筛选的结果时尤其如此,使得使用两种如果要对某些基因的功能作用作出结论,而这些基因在基因筛选中没有鉴定出文库中相应的元件,这一点也很重要。例如,如果在遗传选择的亚群中没有发现文库元件,则不能得出它们与基因组无关的使用已知内容的复杂遗传文库的全面遗传筛选其核心目标是计算在给定的概率水平内,每种元素中至少有一种元素需要对库进行多少采样。一个例子是计算需要产生多少个细胞,每个细胞携带单个文库元件,使得该文库的每个元件有98%的机会被转移到细胞群中。这一原则在Von Schelling [ 11 ]解决的“息票收集者”统计问题中得到了阐述在这里,收集器可以访问由k个不同的优惠券组成的大的随机堆。一个问题是,需要从一堆优惠券中挑选多少才能得到一张特别的优惠券。当每个优惠券都同样丰富时,每轮选择获得特定优惠券的机会是1/k,而得不到该优惠券的机会(j)是11/k。作为选择回合或选择的数量增加,不挑选特定种类的优惠券的概率降低(jn),而获得至少一种该种类的优惠券的概率增加n1nK优惠券是不同的,选择特定电子产品的概率-元素不是由1/k给出的,而是该类型元素在整个集合中的比例。因此,在具有n次挑选的集合中挑选占质粒总群体的25%的特定质粒的机会由(1(10.(25)n)。找到需要多少次拣选来获得每个优惠券中的至少一个的问题更难以计算,因为对于每次拣选,获得一种类型的优惠券或plas-mid与不同种类的优惠券或plas-mid的机会是不互斥的。对n次尝试中没有得到每个元素的概率求和会超过获得完整集合所需的选择次数。这是因为对于给定的一轮选择,当一个人没有选择一个特定的元素时,选择另一个元素的机会就会增加。因此,对于精确解,需要使用集合论中的包含-对于集合中的k个元素(Ki,Kj, Kk, Kn)生物学功能研究。这是因为另一种选择n n解释是这些文库元件最初并不存在于遗传筛选中并不取样。一个重要的参数P(Ki)=∑P(Ki)−∑P(Ki<$Kj)这种筛选的设计是为了适当地估计有多少细胞接受者(例如,转化子、转染子或转导子),使得文库内的全部元件库在起始群体中呈现[6,9,10]。没有i=1我1+1≤i∑jk≤n1≤ij≤nP( Ki<$ Kj< $Kk)−······ ··n知道库的内容,很容易做出不适当的估计[6,9,10]。利用这些文库的许多当前方法将分析与高通量、大规模并行、深度测序结合,其可以定量监测每个文库元件的相对水平[1,2]。高通量测序也可用于表征初始质粒或病毒文库,提供每个元件的同一性和丰度,从而提供计算文库受体细胞群体的足够起始大小所需的信息。当库的每个元素位于不同级别时,进行该计算变得复杂。例如,一个图书馆在仅有的20种不同元素中,每种元素的丰度相等,需要135次挑选才有至少98%的机会获得每种元素中的至少一种。然而,如果其中一种元素的丰度是另一种元素的100倍,则需要812次选择。当考虑具有数千种元素的库时,其丰度范围可以超过4-5个数量级,计算变得更加复杂,因为它们对实验的成功也变得更加关键在这里,我们提供了一个简单易用的软件程序,每-形成这些计算,从而提高能力,+(−1)n−1P(Ki)i−1这种计算是非常计算密集型和impracti- cal时,项目的数量是在103或以上的顺序然而,典型的cDNA、shRNA或gRNA文库中的项目或元件的数量远高于103。当前运行算法的台式计算机已经被改进用于对具有不均匀概率的集合进行这样的计算,很容易被超过102个元素的集合所淹没[12]。因此,我们制作了一个简单的GUI驱动(图形用户界面)独立软件,该软件对用户从给定集合(例如,库),其中每个元素的比例是已知的。这产生了从总集合中挑选的每个元素的经验确定的平均值和标准偏差该程序还提供了一个估计的挑选数量,它将采取一个每个元素的集合,作为一个起点,指定多少挑选MC模拟应该进行。156诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)1542. 软件描述2.1. 对挑选数量的估计MC模拟过程擅长使用用户指定的拾取数(n)执行多个选择实验,但是通过增加n来计算以达到将产生全覆盖的可接受的数目在计算上过于繁琐因此,MALTA被配备为对n进行估计,然后可以使用该估计来指定MC模拟将执行多少次拾取。有两种方法可以用来做这个估计(图)。①的人。一种是简单地将n次挑选后获得每个元素的概率视为互斥的可能性,类似于朴素贝叶斯分类器模型。虽然这高估了最小n,但使用此n作为第一近似值很容易使用MC模拟函数进行经验验证。此外,将每个元素的选择视为相互排斥的概率所引起的误差随着每个元素在总体中所占比例较低的事实上,这正是具有104- 10 7个元件的复杂shRNA或CRISPR gRNA文库的情况该方法可以估计从集合中获得每个元素中的至少一个的概率(例如,图书馆)与给定数量的挑选。MALTA称之为第二种方法是使用费兰特和弗里戈[ 13 ]描述的希普斯定律的原理这里,不是估计获得集合中所有元素的给定概率所需的选择数量这些估计方法与使用先前描述的计算方法[9]计算的精确解的比较如图所示。1.一、MALTA报告了这两种估计,但建议根据前一种情况对非互斥概率进行求和来估计选择的数量。这产生了一个粗略的估计,然后可以用来启动MC模拟的适当数量的选择MALTA评估项目“完整性”的程序概述如下:输入数据元素计数基因12基因25基因3 2基因41x=“覆盖范围”的用户输入n=拾取数量=0步骤1. 计算所有元素的比例输入数据比例(j)元素计数基因120.20.8基因250.50.5基因320.20.8基因410.10.9步骤2. 如果X大于:1-(j。基因1 n + j。基因2n + jGene3n +j基因4n)将n增加2倍并重复步骤2。2.2. 文件格式MALTA是用C++编写的,提供了一个简单的图形用户界面。该程序的版本可在Linux,MacOS和Windows上运行输入文件是逗号分隔值(.csv)格式的文件,其中第一行应包含以下A列标题:“项目类型”,B列标题值可以是每个项目的原始计数或每个项目在人群中的百分比或百万分之一(图10)。2)的情况。这两种方法都可以,因为MALTA将确定所有项目的值之和,并计算每个项目的单独概率。MALTA中的菜单命令允许使用正常的操作系统标准一旦加载文件,以条形图形式显示的数据将在主窗口中显示丰度的等级顺序和log2转换的丰度然后,用户可以调整“覆盖范围”的级别。MALTA使用“项目的完整性”计算来找到近似的选择数量,它将实现获得一个完整的元素集,其概率由用户在“覆盖范围”下输入的值指定(图1)。 3特征c)。最高值为99%。对于每次调整,MALTA将估计挑选的数量(n),然后使用该n来计算“然后使用估计的n自动填充对话框窗口,该窗口设置将进行MonteCarlo模拟的拾取数。用户可以覆盖该估计,并填充2.3. 调整输入数据的子集一些复杂的文库可能具有许多与文库中的其他元素成比例的丰度极低的元素。从这些元素中挑选一个,必须使用非常大量的截齿,并且这在实验上是不可行的。因此,为了计算的目的,可能希望简单地将这些低丰度元素合并在一起,这将允许将该组低丰度元素作为单个概率处理,并导致在这里,群体是不变的,然而,MALTA不估计在分箱的亚阈值群体内找到每个单独项目所需的选择。 为了进行这些调整,马耳他已经包括滑块(图。 3A特征a)充当“人口幕”,有效地将较高丰度和/或较低丰度的物品分箱在一起,允许MALTA忽略必须获得每一个分箱的物品。这在图3B中示出,其中调整群体帘幕以排除高丰度和低丰度项目。虽然使用了与图1相同的输入数据。在图3A中,仅突出显示的项目被视为单独的项目,考虑针对其计算的挑选和概率。在右上角有两个选项卡,分别为“输入数据”和“蒙特卡罗计数”(图1)。3C)。输入数据只是显示从.csv文件中提取的数据,并根据.csv文件顶行中用户指定的标题对其进行标记蒙特卡罗(MC)计数显示每个项目实现的计数数的平均值和标准一些种群中每个项目的丰度可能有很大的差异,因此存在许多非常低丰度的项目。作为一种替代人口窗帘,有'亚人口截止'功能(图。3项目b)。与包括所有输入数据以计算估计值但将某些元素分组在一起的总体帘幕不同,“子总体截断”提取数据的子集以计算和估计数量的pics。这里,可以设置阈值,使得任何元素诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)154157==×Fig. 1. 估 算 方法与精确计算方法的比较。在整个集合中有6(k6)种不同类型的项目(A-F)及其相对比例(1:2:3:4:5)对于指定的选择数,给出了独立获得每个特定的概率,而未获得一个的补充概率也被示出。这两种方法的估计说明获得一个完整的项目集(项目的完整性)的概率是通过求和的概率没有获得每个项目在指定数量的选择和集合的完整性是使用堆底部一行显示了不等概率情况下“优惠券收集者”问题的精确计算在该阈值之下,从拾取数量的估计中消除。通过提高该阈值,减少了估计的拾取数量重要的是,此操作会忽略来自低于指定阈值的元素的数据,这不仅会影响估计值,还会影响任何Monte Carlo模拟。用户可以指定一个值高达90%的最丰富的元素,一个限制,以避免消除整个一组的元素上执行后续的calculu- lations。完整的数据集可以通过将“Subpopulation- lation Cutoff”重置为零来恢复2.4. 蒙特卡罗模拟上述所有用户输入都有助于生成对MALTA可以用于运行一系列Monte Carlo模拟的选择数量的估计。这些操作中的每一个都将自动调整MC Picks字段中找到的数字(图1)。3特征d)。然而,用户可以通过在"Sim“中输入一个数字来指定要进行MC模拟的不同数量的选择。匹克的场地。用户还可以通过在“模拟”字段中输入(1-1000)之间的数字来指定MC模拟的数量。点击“模拟”时通过点击“MC计数”选项卡访问这些结果MC模拟计算基于随机接受算法[14]。在伪代码中,计算是:Sim.Picks 用户指定的每次MC模拟的拾取数量 来做。模拟次数=用户指定的MC模拟次数。输入数据元素计数步骤1:计算每个基因在群体中的比例(Proportion)步骤2:计算集合的累积比例(C.Proportion)输入数据比例C。比例元素计数基因1 2 0.2 0.2基因2 5 0.5 0.7基因3 2 0.2 0.9基因4 1 0.1 1.0步骤3. 创建0到1之间的随机数步骤4.找到具有最低C.Prop的基因,该基因也大于或等于随机数。如果随机数是0.5,则对应的匹配是Gene2如果随机数是0.75,则对应的匹配是Gene3步骤5:将相应的基因计数增加1。第6步:重复第3步到第5步的第7:重复第6步的步骤8:计算多个模拟中每个基因计数的平均值和标准差。在MALTA中实现的随机接受轮盘选择算法允许MC模拟被有效地计算。与线性搜索算法相比,该算法更有效且内存占用更少,线性搜索算法搜索填充有与其在群体中的丰度成比例的每个元素的倍数的阵列,当分析具有广泛比例范围的大群体时,可以创建非常大的阵列[14]。MALTA在3.2 GHz Intel Core(quad)i5处理器上运行时,在大约2分钟内完成了50个MC模拟,每个模拟1.5 107基因12基因25基因32基因41158诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)154××××图二. 输入格式的.csv文件导入到MALTA。显示的是使用电子表格程序(上面的Microsoft Excel)或作为简单的文本文件查看器(下面)查看的文件格式。值(B列)可以是原始计数或比例。每个元素的有效位数不必相同。3. 说明性示例MALTA软件的存储库中包括3个示例数据集。第三个描述了我们在慢病毒载体中获得的一个shRNA文库,该文库包含约9,303个不同的元件,其中每个元件是设计用于抑制特定人类基因表达该shRNA文库通过下一代测序进行表征,以鉴定存在的每个元件并定量其在群体中的比例文库元件具有不同的丰度,当与最低丰度元件相比时,最丰富的元件富集超过4000倍。进行的MALTA估计表明,要有97%的机会获得shRNA文库中的至少一种,需要超过1.5107个选择。通过将“拾取数”设置MC模拟验证了这一估计,从经验上表明,丰度最低的元素被选择的平均值为在多个MC模拟中,重复次数为105+/-2次(图4). 设置MC模拟只有1.0 - 10 -6挑选显示丰度较低的元素没有被选中,平均低于1。扩展该过程,用户还可以模拟如果目标是仅转移更丰富的元素而不是配置实验,则库将被采样的程度,使得它必须覆盖所有元素,而不管它们在群体中有多罕见。调整右边的例如,估计挑选的数量以覆盖库中最丰富的9211个元素,而不是所有9303个元素以覆盖99%,产生仅786,432个挑选的目标,低于完整库的2.5×107个通过这些调整,用户可以对许多场景进行采样,并选择哪些场景对他们的基因实验最有还可以使用MALTA来更好地理解在实验中获得的给定数量的转化体实现了这里,将MC模拟的“Sim Picks”数量设置诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)154159∼图3.第三章。MALTA:计算库覆盖率的GUI界面。A. 马耳他的图形用户界面显示了100个不同丰度的项目的数据用户控制的功能包括:(a)当使用时,MALTA不计算在该分组总体中检索所有单个项目之一所需的选择数。(b)“Coverage "是用户指定的获取在突出显示的群体中,每种至少有一个(粉红色条)。(c)Sim Picks是将用于Monte Carlo模拟的选取数。(d)模拟次数是用户指定的蒙特卡罗模拟将被执行的次数。(e)开始蒙特卡罗模拟。然后将多次运行的结果取平均值并计算标准偏差。(f)用于查看输入数据和模拟结果的选项卡。除了最低丰度的元素外,仍然可以获得文库。这种类型的计算在回顾性方面是有帮助的,允许人们了解一旦获得对病毒转导的效率,对于一些实验,研究者可能希望确保在受体细胞群中回收每个文库元件的多个拷贝。MALTA中的估计器函数建议了一些选择,以确保细胞群中每个元素的1个拷贝。然后通过运行蒙特卡罗模拟来验证该数字用户可以增加MC模拟将执行的拾取数量,允许用户找到获得每个库元素的多个副本所需的拾取数量 在实践中,文库的10倍覆盖率的估计可以通过将估计值乘以10或在"Sim“中的数字后面加上”0“来获得在运行MC模拟之前选择4. 影响MALTA提供了一种易于使用的方法来评估用于遗传筛查的文库的复杂性,并将帮助研究人员欣赏和适应其实验的适当规模有效使用shRNA、CRISPR、cDNA或其他文库的重要参数之一是确保文库被充分取样,使得大多数元件被可重复地转移到感兴趣的细胞,使得大多数元件可以进行遗传评估。上面的示例该文库在12个池中合成,每个池具有10,000个元件,每个池具有不同的元件或shRNA序列。虽然只有一个相对较小的库,但每个元素的不同比例(变化超过4个数量级160诉Krishnamani,文学硕士Stamnes和R.C.Piper/SoftwareX 9(2019)154××∼ ×见图4。使用表征的shRNA文库池的说明性实例。使用示范数据集(3)中列举的9303个元件的混合shRNA文库进行MALTA评估。绘制的(灰色)是500种最丰富的元素的原始丰度,以及500种最不丰富的元素以log2标度绘制在Y轴和分裂的X轴上。通过5次Monte-Carlo模拟获得的每个元素的平均数,使用1.5 107个选择(蓝色)或1.0还绘制了106个模拟(红色)。迫使人们从文库中获得1107个慢病毒,以确保获得所有元件中的至少一如果没有马耳他可以进行的计算,就很难理解对如此高的数字的要求值得注意的是,构建了越来越多的类似文库以允许进行深入的遗传筛选。实例包括编码CRISPR gRNA序列的几个文库,其可以与Cas9组合并灭活、抑制或刺激不同的基因[15这些文库中的许多文库含有比图1中用作实例的shRNA文库多得多的元件(100,000-200,000)。四、此外,已知用于扩增(扩增)文库的量的程序会加剧每种元素的相对丰度的差异。这些因素的结合强调了使用MALTA等工具的必要性,以确保使用的实验程序能够适应对整个文库进行充分采样并进行定量比较所需的规模。5. 结论用于进行全面遗传筛选的基于DNA的文库的种类不断增加,为研究人员提供了强大的工具来了解范围不断扩大的生物过程。下一代测序技术在它们所含的元件数量和这些元件的相对比例方面完全表征这些文库的能力可以为MALTA等程序提供必要的数据,以计算依赖于适当采样这些文库的实验所需的规模。这些计算的数学解决方案遵循了公认的优惠券收集者问题的原则因此,MALTA允许通过使用一系列Monte Carlo模拟预测文库的覆盖率来进行经验评估在模拟中执行的挑选数量的估计可以由MALTA估计,并且用户还可以细化初始估计以仅覆盖库中的元素子集,致谢这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)对RCP的资助(RO1 GM 58202 和 R21 EB 021870 - 01 A1 )和 美国国 家科学 基金会(NSF)对MAS的美国研究项目资助1517110的支持。引用[1]RNAi screening comes of age : improved techniques andcomplementaryapproaches. 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