2018年药用植物内生真菌的抑菌和抗氧化活性研究

埃及基础与应用科学杂志5（2018）303完整文章药用植物内生菌Prabha Palanichamy，Govindan Krishnamoorthy，Suganya Kannan，Murugan Marudhamuthu印度泰米尔纳德邦马杜赖卡马拉杰大学生物科学学院微生物技术系，马杜赖625021阿提奇莱因福奥文章历史记录：2017年7月6日收到收到修订版，2018年6月13日接受，2018年在线发售2018年关键词：药用植物内生真菌抑菌试验抗氧化试验MTT法A B S T R A C T药用植物自古以来就被用作替代药物，以促进世界许多地区的人类健康和长寿。近年来，从高等真菌中分离出许多新的次级代谢产物，为抗菌、抗氧化、抗癌等新药的开发提供了先导化合物。共分离到42株内生真菌，印度泰米尔纳德邦的11种不同的药用植物。在离体条件下，对药用植物内生真菌产生生物活性次生代谢产物的能力进行了评价。最常见的分离真菌是链格孢属、镰刀菌属和菌丝体。 采用乙酸乙酯液液萃取的方法，得到了具有生物活性的次生代谢产物。其中15个菌株对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌和白喉棒状杆菌等潜在的人类病原体具有抗菌活性，抑菌圈可变。在链格孢MGTMMP 031中观察到具有良好菌丝生长和抗菌活性的最大次级代谢产物产生。此外，还评价了体外抗氧化和抗癌活性。通过紫外光谱（UV）、红外光谱（FT-IR）和薄层色谱（TLC）对次生代谢产物进行了表征，Rf值为0.35经鉴定其活性次级代谢产物为交链孢酚甲醚。结果表明，链格孢菌次生代谢产物具有潜在的药用价值，值得进一步研究。©2018制 作和 主办 由Elsevier B.V.代 表曼 苏拉 大学 这是 一篇 基 于CC BY-NC-ND许 可证 的开 放获 取文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍药用植物自古以来就被广泛用于人类福利，也是药物的主要储备[1]。内生菌和药用植物在代谢产物的产生上存在正线性相关，这是由于随着进化时间的推移与宿主的遗传重组[2]。内生真菌，居住在健康的活组织，而不会引起副作用，也产生某些生物活性的次级代谢产物[3]。内生菌必须合成代谢物，以便与共存的内生菌、宿主和病原体竞争，从而定殖宿主，以及获得营养[4]。它们是结构独特的生物活性天然代谢物的主要来源，如生物碱、苯并吡喃酮、苯醌、类黄酮、酚类、类固醇、萜类化合物、四酮和氧杂蒽酮，具有探索新疗法的广泛潜力[5]。它们作为抗真菌、抗病毒、抗菌、细胞毒性和免疫抑制的高效生产者发挥作用*通讯作者。电子邮件地址：murubio2001@yahoo.com（M. Marudhamuthu）。代谢物。几种新的内生真菌衍生的天然产物被分离并在早期描述[6]。这些具有生物活性的代谢产物可能在感染性疾病的治疗中起着至关重要的作用。 已经发现内生菌产生显著量的抗氧化剂，其防止对细胞组分的氧化损伤。从健康药用植物叶片中分离得到42株内生真菌，采用溶剂提取法获得其次生代谢产物。分析所选真菌菌株对五种不同细菌人类病原体的抗微生物活性。基于初步的抗微生物研究，发现来自内生真菌MGTMMP 031的活性代谢物对所有测试的病原体具有最大抑制区的潜力，并进一步评价其抗氧化和抗癌潜力。对培养条件和营养因子进行了优化。另外，利用ITS区18S rDNA序列对该菌株进行了进一步鉴定，并将 其命 名为链格 孢（ Alternariasp. ）（ MGTMMP 031）。 通过TLC、UV-VIS和FT-IR对部分纯化的次级代谢产物进行了表征https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2018.07.0022314- 808 X/©2018由Elsevier B. V.代表曼苏拉大学制作和主办。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas304P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303×·2. 材料和方法2.1. 植物内生真菌的分离与鉴定健康的药用植物叶收集自马杜赖Kamaraj大学的植物园，马杜赖（9°5 6038. 北纬600度，7800027度。100E）。 用流动的自来水洗涤叶子5分钟以除去灰尘和碎片。将叶子切成尺寸为1 cm × 1 cm的小块。通过依次将叶片在0.3%次氯酸钠中浸渍30 s和在70%乙醇中浸渍60 s，然后将它们在无菌蒸馏水中冲洗并进一步用纸巾干燥来进行表面消毒将叶段均匀地置于补充有链霉素（100 μ g/ml）的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上。将平板在25 °C下在12小时的光-暗循环下孵育6至7天[7]。获得纯的真菌菌株，并进行形态学鉴别，并使用乳酚棉蓝染色鉴定孢子[8]。2.2. 最佳培养基的选择选择的真菌菌株（MGTMMP 031）在五种不同的真菌生长培养基中生长14天，以确定用于生长和产生次级代谢产物的最佳培养基。培养基即马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）、麦芽提取物葡萄糖酵母提取物蛋白胨肉汤（MGYP）、酵母提取物蔗糖肉汤（YES）[9]、麦芽提取物肉汤（MEB）和矿物盐肉汤（M1D）[10]。在26 °C下孵育14天的PDB培养基中观察到最大生长和次级代谢产物的产生。提取物进行了分析其抗菌，抗氧化和抗癌性能。2.3. 发酵将纯的真菌菌株接种到1000 ml锥形瓶中的500 ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中，并在26 °C下孵育14天以产生次级代谢产物。孵育期后，使用4层干酪布过滤培养物，并使用分离漏斗用等体积的乙酸乙酯提取培养物滤液三次。收集溶剂相并使用旋转真空蒸发器冷凝。获得干燥的粗次级代谢产物，并将其用于研究真菌提取物的抗菌、抗氧化和抗癌潜力。2.4. 交链孢醇类化合物在F274级（E-Merck，Germany）[11]的预涂硅胶TLC板中，使用己烷：乙酸乙酯（2：3）溶剂系统进行薄层色谱（TLC）。将洗脱板完全干燥，在365 nm UV下观察色谱图，并测量代谢物随溶剂的移动（Rf值）。将代谢产物溶于乙酸乙酯中，并使用Shimadzu UV-1800系列进行UV-VIS（200 nm至700 nm）光谱分析。用岛津FTIR 8400系列在400-2.5. 真菌提取物通过琼脂孔扩散法[12]评价粗真菌提取物对以下人类病原体的抗菌活性，例如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌和白喉棒状杆菌。 所有的人类病原体都是从阿波罗医院获得的马杜赖链霉素用作阳性对照，乙酸乙酯用作阴性对照。将板在37 °C下孵育24小时。确定真菌粗提物对单个病原体的最小抑制浓度并制成表格。2.6. 总酚和黄酮含量通过改良的Folin-Ciocalteau方法测定浸提液的TPC[13]。将0.1ml浸提液补足至3.5 ml蒸馏水。将125μ l Folin添加到每一个试管中。间隔3分钟后，加入1ml 7%碳酸钠（Na2CO3）.将混合物在室温下在黑暗中保持90分钟。在760 nm处测量制备的空白溶液的吸光度。总酚含量表示为每100 µg干提取物中的芦丁当量（RE）µg。采用改良氯化铝（AlCl3·H2O）法[14]分析粗提物的TFC。将0.1 ml浸提液稀释至2.5 ml蒸馏水。 75l l 5%亚硝酸钠溶液加入到每个试管中。孵育5分钟后，加入150 μ l 10%AlCl 3H2O并充分混合。间隔6分钟后，加入0.5 ml 1 M氢氧化钠。在510 nm处相对于空白测量吸光度。芦丁用作标准品，结果以芦丁当量（RE）µg表示每100µg干浸膏。2.7. 体外抗氧化性能2.7.1. DPPH自由基清除活性提取物对DPPH自由基的清除作用通过Shimada等人报道的方法测定。[15]。0.1用1.5ml甲醇稀释10ml提取物。向试管中加入1.5 ml含0.2 mM DPPH自由基的甲醇溶液将溶液完全混合并在黑暗中保持20分钟在517 nm处测量吸光度将Rhizoma用作阳性对照。2.7.2. 超氧自由基清除活性真菌提取物抑制超氧阴离子的能力通过硝基蓝四唑还原的分光光度测量来确定[16]。超氧阴离子由非酶系统产生。将0.1 ml浸提液与等体积的60 µM吩嗪硫酸甲酯、468 µM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和150 µM硝基蓝四唑在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中混合。将反应混合物在室温下孵育5 min，并在560 nm处相对于空白读取吸光度。将Rhizoma用作阳性对照。2.7.3. 羟自由基清除活性根据Klein等改进的方法，对粗提物的羟自由基清除能力进行了分析[17]第10段。取0.1 ml粗提取物，用甲醇补足至1 ml向其中加入1ml铁-EDTA溶液（0.13%硫酸亚铁铵和0.26% EDTA）、0.5 ml0.018% EDTA、1 ml 0.85%（V/ V）二甲亚砜的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）。通过加入0.5ml 0.22%抗坏血酸引发反应。将管封闭并在90 °C的水浴中加热30分钟。加入1ml 17.5%冰冷的三氯乙酸终止反应。将3ml NASH试剂（将75g乙酸铵、3ml冰乙酸和2ml乙酰丙酮混合，并加入水至总体积为1L）加入每个管中。将管在室温下孵育15分钟。在412 nm处相对于空白测量所形成的黄色的强度将Rhizoma用作阳性对照。P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）3033052.7.4. 一氧化氮自由基清除活性通过Griess反应评价粗提物对一氧化氮自由基的自由基清除效率[18]。0.1用甲醇将10ml粗提取物补足至0.5ml，并与1.5 ml 10 mM硝普钠磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。将反应混合物在25°C下孵育30分钟。孵育后，取出0.5 ml等分试样，并与0.5 ml Griess试剂（1%磺胺（w/v）、2%正磷酸（v/v）和0.1%萘乙二胺二盐酸盐）混合。在546 nm处测量吸光度以rabbit为参比品表1药用植物内生真菌的形态学鉴定。SL. 号药用植物家庭分离的真菌菌株名称宏观和微观鉴别1穗花Costus spicatus（CS）Costaceae3MGTMMP001甜菜茎点霉2白花丹爵床科3MGTMMP002MGTMMP003MGTMMP 004无菌镰刀菌无菌菌丝3四叶瓦韦无患子科4MGTMMP 005MGTMMP006MGTMMP007无菌菌丝体拟锥膜蕨MGTMMP 008无菌菌丝4对生侧柱虫卫矛科6MGTMMP009MGTMMP010MGTMMP 011无菌菌丝甜菜茎点霉MGTMMP012MGTMMP013MGTMMP014MGTMMP015MGTMMP 016链格孢菌密索多利酵母56圆叶Justicia gendarussa（JG）雌雄异株守宫木爵床科叶下珠科56MGTMMP017MGTMMP018MGTMMP019MGTMMP020MGTMMP021MGTMMP 022镰刀菌菌丝体悬钩子细甲藻MGTMMP 023MGTMMP 024无菌菌丝无菌菌丝7Madhuea longifolia（ML）山柑科3MGTMMP025MGTMMP026MGTMMP027MGTMMP 028无菌菌丝体无菌菌丝8黄荆麦角菌科6MGTMMP029MGTMMP030MGTMMP 031无菌黑丝交链孢MGTMMP 032无菌菌丝9罗勒唇形科2MGTMMP033MGTMMP034MGTMMP035MGTMMP036MGTMMP 037链格孢菌刚果拉氏介无菌菌丝冷杉细轴蕨10四叶胡枝子夹竹桃科2MGTMMP 038MGTMMP 039无菌菌丝镰孢属物种11五叶山甘草芸香科2MGTMMP 040MGTMMP 041橡胶树自由菌无菌菌丝MGTMMP 042Fusariumsp.表2内生真菌分离物粗提物对人类细菌病原体的抗菌活性抑菌圈（ZOI）（mm）306P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303分离株E. 杆菌C.diphtheriaeS.aureusP.mirabilisS.typhiMGTMMP 00312 ± 1.7310.33 ± 0.57013 ± 10MGTMMP 0060011.66 ± 0.5700MGTMMP 00813.33 ± 0.5714 ± 111 ± 113.66 ± 0.5711.66 ± 0.57MGTMMP 01214.33 ± 0.5710.33 ± 0.570012.33 ± 0.57MGTMMP 01518.33 ± 0.57012.66 ± 0.5700MGTMMP 01713.6± 0.5712 ± 1012.33 ± 0.5714.33 ± 0.57MGTMMP 02013 ± 1014.66 ± 1.15015 ± 1MGTMMP 02111 ± 113.66 ± 0.5713.66 ± 0.5712.33 ± 0.5711.33 ± 1.15MGTMMP 02213 ± 113.66 ± 0.57011 ± 111.33 ± 0.57MGTMMP 02410.33 ± 0.5712.33 ± 0.57011.66 ± 1.570MGTMMP 03119.33 ± 0.5720.33 ± 1.5224 ± 128.66 ± 1.1534 ± 1MGTMMP 03315.33 ± 0.5716 ± 124.33 ± 0.5721 ± 114 ± 1MGTMMP 03715.33 ± 0.5716 ± 118 ± 115 ± 115 ± 1MGTMMP 04012 ± 10012 ± 10MGTMMP 04111 ± 111.6± 1.15015 ± 10数值为三次重复的平均值±标准差。P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303307标准品，并以与粗提物相同的方式处理。使用在磷酸盐缓冲液（2ml）中的硝普钠作为对照。2.7.5. 还原力根据Oyaizu的方法测定粗提物的还原力[19]。0.1将10ml提取物与0.25ml 0.2M磷酸钠缓冲液（pH 6.6）混合。向其中加入0.25ml的1%铁氰化钾，并将混合物在50°C下孵育20分钟。通过加入0.25ml 10%三氯乙酸（w/v）终止反应，并将混合物以5000 rpm离心10min。将上层（0.5ml）与0.5ml去离子水和1ml 0.1%氯化铁混合。在700 nm处测量吸光度2.8. 抗增殖性评价Vero细胞系、MCF-7、HUH-7和A549细胞系在补充有10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的最低必需培养基（MEM）中生长。将所有培养物保持在37°C、5%CO2的潮湿气氛中。达到融合后，将细胞胰蛋白酶化，并使用血细胞计数器计数活细胞数，以制备细胞悬液[20]。向 溶 解 的 真 菌 提 取 物 中 加 入 1 ml MEM 溶 解 的 提 取 物 通 过Whatman注射器过滤器（0.2µm）。将真菌提取物制成1 ml原液。在96孔微量滴定板的每个孔中加入100 µl真菌提取物，并在37 °C和5% CO2下孵育。24h、48 h、72 h后观察细胞形态。孵育72小时后，用20 μl溶于PBS的5 mg/ml 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT）处理各孔，并将板在37 ℃和5%CO2下孵育4小时。形成甲瓒晶体并溶解于100 μl DMSO中。使用ELISA读数器在620 nm处测量细胞活力[21]。2.9. 基因组DNA提取、ITS区扩增及系统发育分析使用STE缓冲液分离真菌基因组DNA，所述STE缓冲液包含10 mMTris pH 8 、 320 mM 蔗 糖 、 20 mM EDTA 、 75 mM NaCl 、20%SDS、5mg聚乙烯吡咯烷酮50 ml[22]。用通用引物ITS 1和ITS 4扩增ITS区，引物F（ITS 1TTATTGAT ATGC30 ） 。 对 扩 增子 进 行 测 序 ， 并 通 过 BLAST 程 序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将序列使用分子进化遗传学分析（MEGA 6.06）对高评分序列进行聚类。用MEGA 6.06内置的ClustalW软件进行序列比对，用邻接法构建系统发育树。图1.一、MGTMMP 031提取物对人类细菌病原体的抗菌活性308P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）3032.10. 统计和数据分析所有实验均一式三份进行，以检查重复性。本文的所有统计数据均为三次测定的平均值± SD。3. 结果3.1. 植物内生真菌的分离与鉴定从药用植物中共分离到48株真菌，其菌落特征和显微形态特征可作为鉴别菌株的依据。从对生侧柱蕨（Pleurostyliaopposita）中分离到大量的内生真菌（6株）。在48个原始真菌分离物中，选择42个形态不相似的分离物用于生物活性筛选。根据孢子形态对所有菌株进行了几乎一半的缺乏孢子形成的真菌菌株（50%相对频率）被归类为菌丝体灭菌（表1）。除此之外，MGTMMP 002 、 MGTMMP 017 、 MGTMMP 039 、 MGTMMP042、MGTMMP 013、MGTMMP 031、MGTMMP 033、MGTMMP001、MGTMMP 010和MGTMMP 021分别为镰刀菌属（Fusarium sp）、链格孢属（Alternariasp）和茎点霉属（Phomasp），分别有4个、3个和3个菌株，相对分离频率分别为9.5%、7.14%。3.2. 真菌提取物发酵14天后，收获总共42个无菌丝体培养物的上清液，并用乙酸乙酯萃取采用琼脂扩散法测定提取物的抑菌活性。以链霉素为参照标准评价真菌复合物的药效。表2中显示了对来自所选42种真菌的次级代谢产物的抗菌活性筛选，所述真菌抑制至少一种所研究的细菌，呈现0.2和1.0 mg/ml之间的MIC。黄荆、罗勒和白荆子真菌粗提物对5种病原菌均有抑制作用。在来自相同物种的菌株之间观察到它们产生活性物质的能力的差异。图二.基于ITS序列的MGTMMP 031系统发育树。P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303309代谢产物，如分离株MGTMMP 008、MGTMMP 021、MGTMMP022、MGTMMP 033和MGTMMP 037其 对 所 测 试 的 病 原 体 显 示 出 广 谱 的抗 菌 活 性 。 另 一 方 面 ， 菌 株MGTMMP 006的提取物具有高度特异性，仅对S.金黄色。来自菌株MGTMMP 031的真菌提取物存在于植物黄荆中，以优异的活性抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体（图1B）。①的人。3.3. 分子分类学特征和系统发育分析利用分子生物学和系统发育分析对潜在的次生代谢产物产生菌进行了分类学鉴定。用ITS1和ITS4特异性引物进行PCR扩增，得到550 bp的扩增ITS 1、ITS 4部分序列与Genbank中已登录的生物ITS序列进行了比对。从Genbank检索最高评分序列，比对，计算距离矩阵并构建系统 发 育 树 （ 图 2 ） 。 菌 株 MGTMMP 031 的 ITS 序 列 与 链 格 孢 属（Alternaria）种的ITS序列相似。ITS序列已提交Genbank数据库，登录号为KX198131。3.4. 粗品化合物通过色谱（TLC）和光谱分析（UV-VIS和FTIR）检查真菌提取物采用乙酸乙酯-正己烷（2：3）为溶剂系统，在薄层板上进行 通过UV照射进行条带的可视化，并且发现Rf值为0.83、0.77、0.66、0.5、0.35（图1）。 3）。粗提物的紫外光谱在224-342 nm处显示最大吸收乙酸乙酯提取物的FT-IR光谱显示在3265 cm-1处的吸收表明酸性羟基，在1624 cm-1处的吸收表明羰基，并且在1460和1263 cm-1处观察到吸收，这表明烷烃和胺基团的拉伸（图11）。 4）。3.5. 总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）已知酚类和类黄酮化合物是潜在的自由基清除剂;因此，在植物化学化合物的量、其抗氧化活性和癌症进展的滞后之间观察到密切 在本研究中，研究了生长在五种不同真菌生长培养基上的MGTMMP031的乙酸乙酯提取物的TPC和TFC（图1）。 5）。 粗提物的TPC在100 µg提取物中为1.781至4.577 µg芦丁当量（RE）。在PDB浸提液（4.577 µg RE）中观察到TPC最高的浸提液，其次是MEB浸提液（4.021 µgRE）。 浸提液的TFC范围为2.051 - 4.111 µg RE/100µg浸提液。PDB提取物的TFC最高（4.111 µgRE），其次是MEB提取物（3.529 µgRE）。这表明真菌生长培养基对真菌MGTMMP031中植物化学物质的分泌有在提取物中，MGYP肉汤提取物具有非常低的TPC，YES肉汤具有显著低的TFC。3.6. 体外抗氧化性能在本 研究中， 研究了 生长在 五种不同 真菌生长 培养基 上的MGTMMP 031的乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除特性（图1A ） 。 （ 六 ） 。 提 取 物 对 自 由 基 的 清 除 率 为 13.818%~66.162%PDB提取物对DPPH自由基的清除率最高（66.162%），而YES发酵液提取物对DPPH自由基的清除率较低。图三.粗品代谢产物的TLC图像。超氧自由基是一种强氧化剂，可与生物膜反应并引起组织损伤。它也作为前体形成单线态氧，羟基自由基，或过氧化氢。本研究对提取物清除超氧阴离子自由基的活性进行了研究。PDB提取物的自由基清除率最高，为36.158%，其次是M1D发酵液，为29.237%。抑制百分比值在7.768%和36.158%之间。YES发酵液清除超氧自由基的活性最低.羟自由基是引起脂质过氧化和巨大生物损伤的主要活性氧。羟自由基清除率为31.262%~ 50%。PDB的提取物（50%）具有较高的自由基清除活性，其次是YES发酵液（43.085%）。MGYP发酵液提取物具有较低的除了活性氧物质，一氧化氮还与炎症、癌症和其他病理状况有关。在本研究中，浸提液与氧气竞争，以减少一氧化氮的产生，可通过Greiss试剂进行测量。结果表明，各提取物对自由基的清除率在30.78%~ 53.752%之间。一氧化氮自由基清除活性提取物的含量顺序为PDB > MGYP肉汤> M1 D肉汤> MEB > YES肉汤。在还原力测定中，提取物中的抗氧化剂通过提供一个电子将三价铁离子（Fe3+）还原为亚铁离子（Fe2+），从而可以监测Fe2+的存在量310P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303图四、真菌粗代谢产物的红外光谱表征通过在700 nm处测量普鲁士蓝颜色的形成。700 nm处吸光度的增加表明还原能力的增加提取物的还原力为17.5%~ 74.81%。PDB提取物 （ 74.81% ） 显 示 出 较 高 的 还 原 力 ， 其 次 是 M1D 发 酵 液（52.3%），而来自YES发酵液的提取物显示出相对较低的还原力（17.5%）。3.7. 次级代谢产物对癌细胞系采用MTT法检测真菌粗代谢产物对肿瘤细胞 所有测试的恶性细胞系对真菌提取物显示出显著的响应。代谢产物对HUH-7细胞系显示出最强的抗增殖活性，浓度为75 µg/ml。另外，用提取物处理A549和MCF-7细胞系，并通过显微镜观察生长和形态的变化。计算所有菌株的IC 50值。HUH-7细胞的细胞毒浓度为75 μ g/ml。在A549的情况下，发现50μ g/ml。MCF-7乳腺癌细胞达到50%的细胞死亡，存在100μ g/ml次级代谢产物。但正常Vero细胞对浓度高达200μg/ml的提取物无选择性毒性这些结果说明了次级代谢产物对异常增殖的癌细胞的选择性4. 讨论11种维管植物的内生真菌分属于11个不同的科，且内生真菌的种类和定殖率不同。这与先前的报告是可靠的。与药用植物相关的内生真菌菌株的丰富性和多样性与从药用植物中分离内生菌的其他研究是可靠的[23，24]。不同药用植物内生真菌的定殖频率不同。在所有收集的药用植物中发现的最常见的真菌是非孢子生产者，属于Mycelia sterilia，包括植物病原体和内生菌。所有分离的真菌物种有效地抑制至少一种细菌病原体。灭菌菌丝体MGTMMP 008的次级代谢产物对大肠杆菌有一定的抗致病作用。coli、C.白喉和奇异变形杆菌。不同代谢产物的活性比例不同，而MGTMMP 031的抗菌活性最强。实际上，利用表型特征和孢子形态是鉴定真菌的主要依据。所获得的菌落特征、生理学以及孢子一致性的总体清楚地证实了所研究的内生真菌分离物（MGTMMP 031）属于链格孢属（Alternariasp）。P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303311图五、MGTMMP 031在五种不同培养基中的粗提物的总黄酮和酚含量类黄酮和酚含量表示为Ig芦丁当量。误差条表示平均值±标准差。见图6。MGTMMP 031粗提物在五种不同培养基中的抗氧化活性。活性以活性百分比表示。误差条表示平均值±标准差。312P. Palanichamy等人/埃及基础与应用科学杂志5（2018）303通过对所选菌株ITS区的序列分析得到支持。这种抑制也可能是由于生物活性代谢物的产生，而不是由于培养物滤液中产生的抗菌化合物对营养素的竞争。 因此，用无菌丝体的培养物滤液处理抑制了细菌生长[5]，最近证明了从内生真菌中分离的多种代谢物是通过各种代谢途径合成的[25]，如聚酮化合物和类异戊二烯合成。大多数链格孢属产生几种具 有 生 物 活 性 的 次 级 代 谢 产 物 ， 如 Altersetin 、 木 贼 素 、Hexahydroaltersetin 、 Dihydroaltersetin 、 Deprenylzinnimide 、Zinnimide、Cichorine、HomodestruxinB、DesmethyldestruxinB、链格孢醇、链格孢醇5-O-硫酸酯和Macrosporin[26]。分离的次生代谢产物与交链孢酚甲醚类化合物具有相似的特征，并进行了多种特征分析。以乙酸乙酯和正己烷为溶剂体系的Rf值分别为0.35和0.75，与交链孢醇的相似性较大。通过紫外光谱、红外光谱和已报道的交链孢酚甲醚（AME）的光谱数据进一步证实了交链孢酚在链格孢菌的次生代谢产物中的存在在λmax 224、256、286、332和340 nm处具有交链孢醇衍生物的典型图案。红外光谱在3269、2964、1710和1624 cm-1处有明显的吸收峰，与AME有明显的相似性。基于这一观察结果，从链格孢菌粗次级代谢产物中鉴定出活性化合物为AME。抗氧化剂被认为在自由基介导的生物系统损伤的管理中非常有益[27]。据报道，天然存在的酚类植物化学物质在体外具有多种生物学特性，如抗炎、抗肿瘤、抗诱变、抗癌、抗微生物和抗病毒活性，其程度更高[2]。多酚化合物对于稳定脂质过氧化作用非常重要[28]，并可能直接有助于其抗氧化特性[29]。酚类化合物的抗氧化作用可通过其清除活性氧、抑制自由基生成、提供电子和金属螯合等不同机制以及与不同自由基猝灭剂的协同作用来描述。据报道，从内生真菌中分离的一些化合物是潜在的抗氧化剂[30]。分析了5种不同的真菌生长培养基对抗氧化剂产生的影响。结果表明，PDB显著提高了酚类和黄酮类化合物的产量。相对较高的酚类和黄酮类化合物的含量可能解释了PDB提取物的抗氧化活性增强。与其它培养基相比，MGYP培养基中酚类物质含量较低，YES培养基中黄酮类物质含量较低。酚含量的降低显著降低了羟自由基清除活性。YES肉汤中类黄酮量的减少影响提取物的还原能力。它还降低了提取物对DPPH、超氧化物和一氧化氮自由基的抗氧化活性这些结果为酚类和类黄酮的存在也是总抗氧化能力和癌症进展滞后的原因这一假设提供了支持[5，30]。一些药用植物及其内生真菌被发现是具有抗癌和免疫刺激活性的代谢产物的来源。这些物种的抗肿瘤和细胞毒性特性属于四种结构类型的次级代谢产物：聚酮化合物、萜烯、含氮化合物和多糖[30]。用PDB培养滤液提取物分析其体外抗肿瘤细胞增殖活性。该提取物在体外对癌细胞（A549、HUH-7和MCF-7）的生长有影响，但对正常细胞（Vero）无影响。因此，它可能具有作为抗癌剂的潜力我们的研究表明，真菌提取物具有抗菌，抗氧化和抗增殖特性。然而，进一步研究需要确定真菌提取物对癌细胞生长的抑制作用是否是由于抑制细胞增殖或诱导细胞死亡。纯化代谢物的抗增殖作用机制有待进一步研究。还建议应结合体外研究进行体内研究，以便比较结果，并了解有关纯化代谢物抗增殖特性的更多信息。5. 结论本研究结果显示，这些内生真菌的萃取物可作为一种抗氧化剂，以减少自由基，也可作为一种潜在的活性生物分子，对抗致病病原体。将来，次级代谢产物中存在的活性分子（AME样化合物）负责生物活性将被纯化和表征。确认作者衷心感谢DBT -IPLS-印度，UGC -NRCBS-印度和CEGS提供必要的仪器支持。利益冲突作者不存在利益冲突。引用[1] 放大图片作者：Akerele O，Heywood V，Synge H.保护药用植物。英国剑桥：剑桥大学出版社; 一九九一年[2] 蔡Y，罗Q，孙M，Corke H. 112种抗癌中草药的抗氧化活性及酚类化合物。生命科学2004;74（17）：2157-84.[3] Schulz B，Boyle C，Draeger S，Römmert AK，Krohn K.植物内生真菌：一种新的具有生物活性的次级代谢产物的来源。Mycol Res 2002;106（9）：996-1004.[4] 克莱·K禾本科植物内生真菌：植物与真菌之间的防御性互惠共生。生态学1988;69（1）：10-6.[5] 谭瑞祥，邹文祥。植物内生菌：功能代谢产物的丰富来源 Nat ProdRep 2001;18（4）：448-59.[6] Wiyakrutta S，Sriubolmas N，Panphut W，Thongon N，Danwisetkanjana K，Ruangrungsi N ， et al. 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