光控生物驱动器的微型蠕动泵技术研究

工程5（2019）580研究机器人-文章一种基于光控生物驱动器的微型蠕动泵EitaroYamatsuta，Sze Ping Beha，Kaoru Uesugia，Hongobu Tsujimurab，Keisuke Morishimaa，a大坂大学机械工程系，大坂565-0871，日本b东京农工大学应用生物科学系，日本东京183-8509阿提奇莱因福奥文章历史：2017年12月28日收到2018年8月2日修订2018年11月7日接受在线发售2019年关键词：管状结构生物执行器蠕动泵光遗传学生物材料肌肉执行器组织工程软机器人A B S T R A C T蠕动在自然界中广泛存在，因为这种泵送作用在消化系统中对于将营养输送到身体的每个角落很重要。在本文中，我们提出了一种肌肉驱动的管状微泵，提供蠕动输送。我们利用果蝇幼虫表达通道视紫红质-2（ChR 2）的细胞膜上的骨骼肌，以获得光响应的肌肉组织。幼虫在蓝光刺激下被迫收缩。当改变传播光刺激的速度时，我们观察到收缩肌肉组织表面的位移。我们通过将幼虫解剖成管状结构来获得蠕动泵平均管状结构的内径约为400 μm，平均外径约为750μm。 这种管状结构的收缩可以用相同的蓝光刺激来控制。为了使内部流动可见，我们将微珠放入蠕动泵中，从而确定该泵可以以120lm·s-1的速度输送微珠。©2019 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍生物致动器，从活肌肉产生动力，作为一种不同形式的致动器[1生物致动器可以在没有能量或空气压力的情况下被驱动，因为它们以三磷酸腺苷（ATP）的形式使用化学能。这种类型的致动器本质上是小而轻的，并且与其他致动器类型相比具有高能量效率[11]。在生物致动器的研究中，电刺激[12]或化学刺激[13]已被用于控制肌肉收缩。然而，这些刺激会引起整个肌肉组织的收缩，因此它们对处理复杂的运动没有用处。为了部分地和迅速地控制肌肉收缩，已经提出了由光触发的刺激，其具有高的时间和空间分辨率[14用于此目的的遗传工具被称为光遗传学工具[18，19]，它们的使用允许肌肉对光刺激作出反应[20，21]。蠕动是多细胞生物消化系统中的一个重要运动，它允许将营养输送到整个身体。通过使这些系统的管状结构变形，该机芯可以输送柔软的材料，而不会*通讯作者。电子邮件地址：morishima@mech.eng.osaka-u.ac.jp（K. Morishima）。粉碎材料的形式;此外，材料和结构之间的大接触表面允许食物（材料）被有效地和高效地对于工业应用，防辐射还可用于运输物体，而不会有暴露在外部的风险。几项研究报告了使用伺服电机[22]、气动致动器[23]、磁场[24]、形状记忆合金致动器[25，26]和静电致动器[27]成功再现的磁共振。管道是多细胞生物的重要结构，并且器官通过进化获得蠕动运动。我们认为，通过用生物致动器再现蠕动运动，有可能在创造更集成的组织工程软机器人方面取得突破在这项工作中，我们设计，建造，并测试了一个微型蠕动管由光学可控的果蝇（D。（图1）。我们选择这些幼虫是因为它们采用蠕动运动进行运动，因此我们认为它们的肌肉结构对于骨膜是最优化的此外，已建立了转基因转移D.黑腹果蝇和这些苍蝇在短时间内繁殖，使这些幼虫大量可用。首先，利用转基因方法，在幼虫肌肉组织上表达通道视紫红质-2（ChR 2），以控制光刺激下的肌肉收缩ChR2是一种光门控阳离子通道，对蓝光有反应，并增加细胞内的https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.11.0332095-8099/©2019 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。目录可在ScienceDirect工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engE. 山津田 其他/工程 5（2019）580581Fig. 1. 蠕动泵的流量产生机理。（a，b）工业蠕动泵，具有（a）典型结构细节和（b）其简化模型;（c，d）生物致动器蠕动泵，具有（c）其简化机制和（d）本实验的概念。对于工业泵，其转子在硅胶管表面上施加应力并产生内部流动。对于bioactuator蠕动泵，光学光刺激引起肌肉收缩并产生内部流动。在光刺激时，组织工程泵诱导连续的肌肉激活，逐渐改变刺激区域，以产生波动运动。通过在左右肌肉之间产生不对称的波动运动来改变流动方向阳离子进入细胞，触发动作电位，从而引起肌肉收缩。为了了解性能，通过检查移动表面来观察幼虫的寄生在改变光刺激传播速度的同时，观察了幼虫体表的收缩位移然后计算出累积流量和最佳速度最后，为了复制肌肉萎缩症，我们用活的肌肉制作了一个试管，D.表达ChR2的黑腹果蝇。通过分离头和尾并去除管内容物，由幼虫制造微管。虽然被切除的管子作为生物已经死亡，但作为组织还活着，收缩能力还在。为了观察内部流动，我们将微珠引入到微管中，并通过控制微管的蠕动运动来测量它们在输送时的速度。2. 材料和方法2.1. 获得光响应幼虫为了制作光响应生物致动器，我们使用D。黑腹果蝇（野生型品系，Canton-S第三龄）幼虫材料。我们访问了GAL 4/UAS系统[28]，其具有D. 黑腹幼虫，如图2所示。成年雄性D.黑腹果蝇GAL 4-Mef 2和雌性果蝇D. melanogaster的GAL 4-Mef 2。将在UAS标签上具有ChR 2的黑腹果蝇（UAS-H134 R-ChR 2 [29]）在装有食物的玻璃瓶中交配，所述食物包括光敏剂全反式视黄醇（ATR，Sigma-Aldrich）。获得处女雌虫D.黑腹果蝇、雄蝇和雌蝇必须在它们出现后7小时内分开。由于昆虫体内不产生ATR，ATR在ChR2的利用中是独立的。交配后，雌性在两天内产卵卵在一天内孵化;五天后，我们在它们变成脓包之前获得了完整大小的幼虫这图2. 显示如何在幼虫的肌肉细胞上获得具有所需遗传特性的GAL 4/UAS系统的示意图。将成年雄性GAL 4-肌细胞增强因子-2（Mef 2）和成年雌性UAS-H134 R-ChR 2雄性D.在GAL 4系上具有Mef 2基因的黑腹果蝇（GAL 4-Mef 2）和未交配雌果蝇（D.将在UAS标签上具有ChR 2（UAS-H134 R-ChR 2）的黑腹果蝇在含有包括全反式视黄醇的食物的瓶中交配。所得幼虫在所有肌细胞上具有H134 R-ChR 2。整个过程在室温（25 °C）下进行。通过观察ChR2在幼虫肌细胞上的表达，来自mCherry的红色荧光，其在与ChR 2相同的位置表达（图3），使用荧光显微镜（BZ-X710，Keyence）。成功率100%。2.2. 获得管状结构通过解剖从表达ChR2的幼虫中切下用于生物致动器的微管（图1）。 4）。我们用不锈钢一次性手术刀片（凯医疗）切掉了头和尾582E. 山津田 其他/工程 5（2019）580×·把管子里的东西抽出来该管由角质层和附着在角质层上的肌肉组织组成 将切 下的 管保 存 在 Schneider 昆 虫培 养基 （ S 0146 ， Sigma-Aldrich）中切断幼虫的主要神经系统，使其不发生自发性收缩，用荧光显微镜直接观察这些微管及其横截面，如2.1节所述。通过观察蓝光刺激下管表面的收缩来验证成功率为60%（n= 5）。2.3. 光刺激地方黑腹幼虫肌肉被迫响应蓝光刺激（k = 466 nm）而收缩。由于幼虫的收缩根据光强度而变化，因此均匀的照明场是重要的。我们用几件设备构建了刺激装置。具有物镜（4倍放大率，数值孔径0.13，Nikon）的倒置显微镜（Ti-U，Nikon）、数字反射镜装置（DMD）投影仪（DLP Light图3.第三章。 来自表达ChR2的幼虫的mCherry的荧光图像。通过比较左右图像，我们观察了基因表达的位置。在右图中，观察到整个身体肌肉的红色荧光见图4。从D.黑腹幼虫(a)头和尾端被切掉，所有的内脏都被切除;（b）管结构的侧视图，头端在右边;（c）管结构的部分横截面。Commander，Texas Instruments）、平凸透镜（直径= 25 mm，f=50 mm，Sigma Koki）和消色差透镜（直径= 25 mm，f= 100 mm，Sigma Koki），如图5所示组装。在显微镜下对幼虫组织进行刺激.在载物台表面上蓝光的功率密度为2.0mW mm-2。刺激区域的传播速度如图所示进行控制。第六章每种刺激模式都是图5. 光刺激的实验装置。‘‘Lens 1” represents the plano- convex lens (diameter = 25mm, 从DMD投影仪透镜到透镜1的距离约为100 mm，从透镜1到透镜2的距离约为180mm。从投影仪到显微镜入口的总距离约为310 mm。这些距离在粗略设置后进行微调，以便光线聚焦在显微镜载物台上。从个人计算机输入的图案流被反射到DMD投影仪照射图案上。紫色箭头显示了图案化光刺激的路径黄色和红色箭头显示来自显微镜光源的光路 黄色箭头表示白光，红色箭头表示通过滤光片排除蓝色光谱的白光。见图6。用于控制蠕动泵送动作的一组输入模式。任意改变步数、传播速度和刺激区域宽度。每个刺激模式由黑色矩形（648× 864像素）（用于背景）和白色矩形（42× 864像素）（用于亮区）的组合组成，并使用Paint软件进行准备。每个图像都作为位图图形输出。将该组图像输入控制软件。刺激波包括36个图像。E. 山津田 其他/工程 5（2019）580583××··使用Paint软件（Microsoft Paint，Microsoft）制备。每个图像都作为位图图形输出这组图像被输入到控制软件中以控制投影仪。通过改变频率来控制光的传播速度我们的系统具有小于1 ms的时间分辨率和空间分辨率。分辨率高达20Lm。电影摄影机（FASTCAMSA 3，Pho-tron）来记录运动图像。2.4. 内部流动为 了 观 察 内 部 流 动 ， 微 珠 （ 即 ， 在 水 中 平 均 直 径 为99.5cm±1.5μm 的 聚 合 物 微 球 ， 4310A ， Duke ScientificCorporation，批号#30911;的工作。将微珠在Schneider昆虫培养基中扩散，并用微量移液管注入微蠕动管中。蠕动泵送作用是用图1所示的实验装置控制和观察的。 5.3. 结果和讨论3.1. 管结构使用荧光观察微蠕动管。管结构的平均长度为1342lm（n=6）。内径为423μm，外径为790μm（n=6）。幼虫的原始长度大于3毫米，但解剖消除了内部压力，组织收缩。这些尺寸是在标准大气压下测量的;然而，由于这些管是软的，它们可以通过拉伸来拉伸。3.2. 肌肉收缩我们用第2.3节中描述的设置捕获了运动图像。 每个刺激模式由黑色矩形（648 864像素）和白色矩形（42 864像素）的组合组成，如图所示。第六章我们使用了36张图像作为刺激模式。对于36幅图像，36 Hz的频率导致每个周期为1秒长。通过这种刺激，我们控制了肌肉组织的增生，如图1中的延时图像所示。 7和在补充数据（电影S1）中提供的电影中。当刺激的传播方向改变时，微管表现出前后收缩运动（补充数据中的电影S2）。如果没有这种控制，幼虫的蠕动循环本质上是因此，该结果表明收缩确实是由光刺激引起的通过改变当刺激区宽度固定为400μm时，我们通过观察表面位移（Dx）来研究蠕动泵的作用，如图所示。第 八章刺激区域的传播速度为图7. 蠕动周期的延时图像，通过光刺激控制强制收缩。红色矩形表示光刺激区域。在这些图像中，输出频率为3 Hz，持续12 s。管表面的收缩区与刺激区相对应。比例尺为1mm。图8. （a）观测到的地表位移。Dx表示从原始表面线的位移。在下图中，组织暴露于光刺激。(b)描述用于计算基于单元的流体致动的性能的参数的示意图。表面置换体积通过方程式计算其中，V是流量，I是流动通道的内半径管，D是位移速率。组织表面上的位移速率等于位移除以身体半径（o）。P是光刺激的传播速度，B是观察到的微珠的速度。从0调整到500lms-1，其中0lms-1表示刺激而没有传播。随着传播速度的增加，牵引位移变小，如图9（a）所示。这种变化可能是因为肌肉收缩是由ChR2诱导的阳离子流引起的。在这种情况下，ChR2没有获得足够的能量来收缩整个组织。为了以高传播速度在肌肉上获得更大的位移，需要更强大的资源。我们计算了诱导流量作为表面收缩的体积。使用Eq.其中V是流量，I是管的内半径，D是排量。组织表面上的位移速率等于位移（图1中的Dx）。（8）除以身体的半径P是传播速度，光刺激（图8（b））。DV¼2pI2DP1000用DV表示的量纲是单位时间内的体积变化。选择给出最大DV的传播速度作为最佳速度。然后，使用Eq。（1）、我们计算了流量。如图图9（b）中，当光刺激的传播速度为400lm·s-1时，获得最高的流速。3.3. 通过微输送管的我们捕捉到了管子的动态图像。为了控制静态泵送动作，我们使用了12幅刺激波图像，如图10所示。每种刺激模式由584E. 山津田 其他/工程 5（2019）580××·····图9. （a）位移速率对光刺激的传播速度的依赖性。误差条显示标准偏差。(b)根据方程中的传播速度和位移速率计算的流速。（1）; 0lm·s-1为无传播刺激（n = 3）。背景的黑色矩形（1024 × 768像素）和亮区的两个白色矩形（75 ×768像素）的组合，并使用Paint软件准备。每个图像都作为位图图形输出。这组图像被输入到控制软件，以便控制投影仪。通过控制管的蠕动泵送作用，我们成功地输送了微珠，如图1B所示。 11、电影《亲补充资料（电影S3）。当刺激区域的宽度固定在400μm并且传播速度固定在400μms-1时，微珠以120μms-1的平均速度运输。使用Eq.（2）其中V、I和D与等式中的项相同。（1），和B是运输的微珠的速度（图。 8（b））。DV¼pI2DB200对于120lms-1的B，我们使用方程计算出实验流速为6 nL s-1。（2）.该值小于从方程1获得的12 nL s-1的值（1）. 其中一个原因是-原因可能是管表面不光滑。然后，我们将估计的性能与先前报道的基于细胞或组织的生物微泵进行了比较。较图10. 用于控制蠕动泵送动作的一组输入模式。每个刺激模式由矩形图像组成，由背景的黑色矩形（1024×768像素）和亮区的两个白色矩形（75 × 768像素）组成，并使用Paint软件进行准备。每个图像都作为位图图形输出。将该组图像输入控制软件。刺激波包括12个图像。图11. 运输微珠时的延时图像。微珠位置的变化表明微珠被转运。通过将位移除以时间来计算管内流体的流速(a)光刺激到达最左边的珠粒;（b）0.8秒后拍摄的图像，其中每个虚线圆表示该时刻的微珠粒位置。相同的颜色表示相同的微珠。传播光刺激的速度是0.5mm·s-1。E. 山津田 其他/工程 5（2019）580585·····另一个报道的泵使用心肌细胞片（2nL min-1）[1]，我们目前的流速高180倍。与聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜基泵（0.226 nL min-1）[30]相比，我们的流速高出1800倍。这些泵的大小是不同的，并且来自幼虫的肌肉组织的功率是显著的。在不使用任何人工瓣膜或其他柔软材料的情况下，我们获得了稳定的流动由于我们的管仅由生物材料组成，因此浪费的能量消耗较少4. 结论在这项工作中，我们制作了一个微蠕动管使用生物执行器，与D。以表达ChR2的黑腹幼虫肌肉组织为材料。通过组合倒置显微镜、DMD投影仪和两个透镜，我们能够在观察的同时控制稳态泵送作用，稳态泵送作用由蓝光刺激引起。光刺激比其他类型的刺激（包括化学刺激和电刺激）对组织造成的损伤更小。我们研究了光传播的最佳速度，使用从微蠕动管表面上观察到的位移计算的流量。 在我们的实验条件下，最佳增殖速度为400lms-1。我想要更强的光源使用，它可能会获得更好的肌肉收缩和更高的流速。我们成功地在120lms-1的速度和12 nL s-1的计算流速下输送微珠。对生物驱动机器的研究仅限于基于膜的动物，如水母或黄貂鱼[3，17]。为了获得大的三维结构，必须引入管状结构用于能量循环。因此，本研究中检查的管状组织结构代表了在开发更集成的生物机器方面向前迈出的一步确认本研究得到了日本科学振兴会（JSPS）研究员（17J01742）、日本 科 学 振 兴 会 科 学 研 究 员 （ 21676002 、 23111705 、 26249027 和17H01254）的资助。以及日本新能源和产业技术开发组织（NEDO）的产业技术研究资助计划。遵守道德操守准则Eitaro Yamatsuta 、 Sze Ping Beh 、 Kaoru Uesugi 、 HongobuTsujimura和Keisuke Morishima声明他们没有需要披露的利益冲突或财务冲突附录A.补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.11.033上找到。引用[1] Tanaka Y，Morishima K，Shimizu T，Kikuchi A，Yamato M，Okano T，et al.Anactuated pump on-chip powered by cultured cardiomyocytes. 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