胰腺癌外泌体CD44与整合素α6β4协同作用对肿瘤细胞运动和靶细胞活化支持器官转移

工程7（2021）1413研究肿瘤诊断和治疗新技术-文章外泌体CD44与整合素α6β 4协同作用通过调节肿瘤细胞运动和靶细胞活化支持向器官转移Wei Mua，Yajie Xub，Pengfei Gua，Wenbo Wangc，Jingquan Lia，Yang Gea，Zhang，Hui Wanga，b，Zhanga上海交通大学医学院公共卫生学院单细胞组学研究中心，上海200025b中国科学院上海营养与健康研究所中国科学院营养代谢与食品安全重点实验室，上海200031c上海交通大学医学院国家转化医学研究中心，上海200031阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年7月20日修订2020年8月10日接受2020年10月8日网上发售保留字：胰腺癌嗜器官转移转移前小生境CD44A B S T R A C T快速转移到肺、肝和脑等重要器官是绝大多数胰腺癌死亡的原因。胰腺癌肝转移是胰腺癌患者死亡率高的原因。来源于胰腺癌细胞的外泌体倾向于富含锚定至细胞膜的蛋白质我们的研究首次证实了由外泌体递送的跨膜糖蛋白CD44参与胰腺癌的转移过程。此外，CD44与整合素α6β 4相互作用形成复合物，从而重塑细胞内骨架蛋白，并通过激活Src和Ras信号级联途径促进肿瘤细胞运动。值得注意的是，我们还证明了CD 44肝细胞对CD44感受态肿瘤外泌体的选择性摄取激活了纤维化途径，并通过刺激细胞因子、促炎因子和生长因子产生了转移前小生境，这些因子最终支持肿瘤转移。我们的研究结果表明，外泌体CD44作为胰腺癌的临床诊断和治疗©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）中找到。1. 介绍癌细胞从原发肿瘤部位扩散到远处器官是恶性肿瘤最具破坏性的方面[1]。胰腺癌的特征是最致命和最具侵袭性的恶性肿瘤之一，这是由 于预后 差，具 有远处 和快速 转移扩散 [2] 。 胰腺导管 腺癌（PDAC）占所有胰腺肿瘤的绝大多数（92%），临床治疗中估计的5年生存率低于6%[3，4]。PDAC转移的倾向，优先转移到肝脏，导致外科手术后的高临床致死率[5]。最近，各种研究表明，肝脏的不利环境在早期阶段被选择性地预处理，以使其更有利于播散性癌细胞的植入和生长[6]，从而产生了一种概念。*通讯作者。电子邮件地址：geyang19861026@icloud.com（Y.Ge），huiwang@shsmu.edu.cn（H.Wang）。定义为转移前小生境形成。转移性胰腺肿瘤细胞产生被选择用于适应特定器官环境的内在细胞特性[7]。越来越多的关于转移性向器官性的研究揭示了关于胰腺肿瘤细胞转移至特定器官的方式的关键细节[8，9]，揭示了在特定器官中准备转移小生境的各种关键介质，并确定了为治疗干预提供有吸引力的选择的新靶点[10]。尽管已经提出了许多假设，但“种子和土壤”和转移前小生境的理论然而，器官特异性转移的潜在机制仍有待阐明。外泌体通过其囊泡内容物传递信息，并且被认为是细胞之间的新型信号传导机制[12]。肿瘤来源的外泌体含有从供体细胞分泌的丰富的生物分子，并作为细胞间通讯的信号信使发挥作用[10]，有助于激活各种宿主细胞，如免疫细胞，https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.08.0132095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engW. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131414·-细胞[13]，癌症相关成纤维细胞（CAF）和巨噬细胞，重塑局部基质[14]。值得注意的是，外泌体对这些宿主细胞的调节和重编程可以在其靶位点为肿瘤细胞创造转移偏好环境[15]。肿瘤来源的外泌体可以通过与靶细胞表面结合或与细胞膜融合，在形成原发性肿瘤细胞之前重塑特定位点[13，16]。例如，外泌体内的整联蛋白货物通过以组织特异性方式与宿主靶细胞融合来指导器官特异性定殖，从而引发转移前小生境形成[17]。PDAC衍生的外泌体可以支持肝转移，这是由于其增加了未处理小鼠中的肝转移负荷[18]。然而，肿瘤来源的外泌体参与和影响肝转移前小生境的产生的确切机制仍然知之甚少。分化簇44（CD44）是跨膜糖蛋白家族的成员[19，20]，影响受体酪氨酸激酶（RTK）的活化[21]。此外，它作为RTK的共受体介导与细胞迁移相关的信号传导途径，如c-Met信号传导[22]。除了调节各种细胞、生理和病理过程外，CD44还作为细胞外基质组分的受体[23]，特别是透明质酸（HA），以激活细胞骨架蛋白，从而促进细胞运动[24]。许多研究表明，CD 44在胰腺癌中主要过表达[25，26];作为细胞CD44的定位有助于癌细胞获得粘附和迁移特性[24，28]。因此，了解CD 44的影响-特别是当它在胰腺癌进展期间由外泌体递送时-可以提供关于肿瘤转移机制的新见解。在本研究中，我们证明了CD44表达与胰腺癌预后呈正相关。CD44与整合素α6β 4相互作用，通过调节大鼠肉瘤（Ras）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。此外，我们发现胰腺肿瘤细胞来源的exosomes可以将CD 44转移到靶细胞，并与肝细胞中的a6b4合作。因此，外泌体CD 44通过上调分子如CD 133、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和白细胞介素-β 1（IL-β）产生转移前环境以促进特定器官转移。6（IL-6）在靶肝细胞中的表达。探索和鉴定PDAC外泌体CD44在肝转移中的作用可以为开发诊断标志物和治疗以阻止转移铺平道路。2. 材料和方法2.1. 患者样本采集来自具有早期或晚期胰腺疾病的胰腺癌患者的血清样品从中国上海交通大学医学院附属瑞金医院获得。2.2. 细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS; Gibco）和1%青霉素/链霉素（P/S;Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco，USA）中培养肿瘤细胞系PANC-1、Capan-1、PANC-1CD44敲低（P-CD44kd）、PANC-1b4敲低（P-b4 kd）、Capan-1CD 44敲低（C-CD 44 kd ） 和 Capan-1b4 敲 低 （ C-b4LX-2 细 胞 购 自 LifeTechnologies并在Roswell Park Memorial Institute中培养（RPMI）培养基（Gibco）。 所有细胞系在37°C下在含有5%CO2的加湿培养箱中培养。对于人LX-2细胞与各种肿瘤来源的外泌体的体外培养，将细胞保持培养7天，每隔一天补充含有500 μ g mL-1外泌体的培养基。2.3. 敲低细胞系分 别 转 染 CD44 和 b4 短 发 夹 状 RNA （ shorthhairpin RNA ，shRNA ） ， 筛 选 克 隆 . 载 体 表 达 的 短 发 夹 RNA 购 自 Stana CruzBiotechnology（USA），并且RNA-CD44（有义：GACAGAAAGCCAAGTGGACTCAACGGAGA）和含有无效shRNA盒的HuSHshRNA绿色荧光蛋白（GFP）克隆载体（pGFP-V-RS-vector; Origene，USA）用于敲低CD 44表达。RNA-b4（正义：ATCGAAGCATTTCAAGAGAATGCTTCGATCATTACTTG）的寡核苷酸和含有无效shRNA盒的pGFP-V-RS载体用于敲低CD 44和b4的表达。2.4. 免疫标记对于外泌体标记，用200μL荧光膜示踪剂3，3-双十八烷基-5，5-双（4-磺基苯基）-氧杂碳菁钠盐（SP-DioC 18; Invitrogen）在磷酸盐平衡溶液（PBS，1：10 000; Invitrogen）中标记1 mg外泌体25分钟。将标记的外泌体洗涤两次，并与外泌体耗尽的胎牛血清（FCS; Gibco）在黑暗中孵育30分钟，使得游离染料可以结合FCS中的蛋白质。在用PBS洗涤后，通过离心收集染料标记的外来体。如前所述，使用40%蔗糖溶液纯化标记的外来体沉淀。将染料标记的外来体储存在80 °C下直至进一步使用。 为了染色细胞膜蛋白，将细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，并用0.5%TritonX-100（Sigma，USA）透化20分钟。将固定的细胞与抗-CD 44、抗-α 6 b 4、抗-α 3b 1、抗-基质金属蛋白酶（MMP）-9、抗-MMP-13、抗-上皮细胞粘附 分 子 （ EPCAM ） 、 抗 - 波 形 蛋 白 、 抗 -Src 和 抗 -Ezrin 抗 体（Abcam，中国）在4 ℃下孵育过夜，随后与荧光缀合的Alexa Fluor488和Alexa Fluor 555二抗（Thermo Fisher Scientific，USA）孵育。2.5. 蛋白质印迹分析用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（Sigma）裂解细胞和外来体进行二辛可宁酸（BCA）测定以测量样品蛋白浓度。所有蛋白质样品的浓度均校正为11g·1L-1。的CD44、a6b4、MMP-2、MMP-9、MMP-13、通过蛋白质印迹法评估EPCAM、波形蛋白、Src、Ras和ERK，并将蛋白质表达标准化为b-肌动蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（非还原）分离蛋白质样品（每份20μg）。然后将蛋白质样品转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂奶粉溶液封闭膜1小时，并在4 ℃下与抗CD 44、抗α 6 β 4、抗MMP-2、抗MMP-9、抗MMP-13、抗EPCAM、抗波形蛋白、抗Src、抗Ras、抗ERK和抗β-肌动蛋白抗体（Abcam）孵育过夜。通过增强化学发光（ECL）检测系统使免疫印迹可视化。W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131415·×××××···×2.6. 蛋白质复合物免疫沉淀将PANC-1、Capan-1和β-CD 44 kd细胞和外来体在4 ℃下在裂解缓 冲 液 （N-2- 羟基乙基哌嗪 -N-0- 2- 乙 磺 酸 （ HEPES ） 缓 冲 液（Sigma）和1%Brij96（Sigma））中均质化60分钟。使用相应的抗体（2μ g mL-1或200μ L杂交瘤上清液）在10 ℃下过夜免疫沉淀细胞裂解物（1 mg）或100μg外来体裂解物。四摄氏度。将样品用5%蛋白-G琼脂糖（Invitrogen）在4 °C下旋转沉淀1小时。将复合物用裂解缓冲液洗涤三次。使用连接到真空泵的35 G针头除去所有液体以确保最小背景。将复合物溶解于Laemmli缓冲液（Invitrogen）中，在95 °C下煮沸5分钟，并短暂离心以将琼脂糖珠粒与蛋白质分离。2.7. 外来体收集和分离对于外来体收集，我们首先在10 cm培养皿中用补充有10%FBS和1%P/S抗生素溶液的DMEM当细胞覆盖培养皿80%汇合时，将培养基更换为不含FBS的DMEM培养48 h。收集细胞培养基并通过0.22μ m过滤器（Millipore，USA）过滤。这个循环重复两到三次。通过如下密度梯度超离心分离外泌体：500g（g：重力速度）10 min两次以去除细胞，2000g，20 min以去除残留碎屑，10 000g持续120 min以除去微泡，并且100 000g持续2 h以使微泡聚集。选择小球中的纳米囊泡。对于外来体纯化，进行蔗糖组分超离心，并收集溶液的2-8个级分。用高速Avanti JXN-30离心机（Beckman Coulter，USA）和optimaJXN超离心器（Beckman Coulter）进行超离心2.8. 克隆形成分析将PANC-1、P-CD44 kd和P-b4kd细胞（每种细胞系200和1000个细胞）接种在6孔板（Corning，USA）中，培养10天后计数集落数进行克隆形成测定以评价细胞活力。2.9. 细胞增殖测定使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定（Abcam，UK）监测细胞生长。简言之，将PANC-1、P-CD44 kd和P-b4kd细胞以5 × 103细胞/孔的稀释度在96孔板中孵育0、24、48或72小时，并根据制造商CCK-8孵育4小时后，通过在450 nm波长下读取光密度来测量细胞活力。所有实验一式三份进行。2.10. 细胞周期测定进行羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色测定。每孔收集3 ×103个细胞，并用无菌PBS洗涤两次。 然后用5 lmol L-1的CFSE标记细胞，并在37°C下孵育24、48和72h。此后，通过流式细胞术分析CFSE标记的细胞的稀释2.11. 细胞凋亡测定用Annexin V和PI标记法检测细胞凋亡。异硫氰酸荧光素（FITC）用于细胞染色，用于流式细胞术测定。将PANC-1、β-CD 44kd和β-CD44 kd细胞接种在96孔板中，并与顺铂以梯度浓度孵育24小时，48和72 h。此后，用PBS/1%FCS洗涤细胞。将细胞与膜联蛋白-V-FITC/PI孵育;然后通过流式细胞术使用两个通道评估细胞凋亡：膜联蛋白-V-FITC通道FL-1和PI通道FL-3。2.12. 细胞迀移测定在具有聚碳酸酯膜（孔径：8 mm）的transwell小室（6.5mm;Costar，USA）中测试PANC-1、Capan-1和敲低细胞系的迁移能力将细胞接种在具有40μ L DMEM的上室中将500微升含有10%FBS的 DMEM添加到下部隔室中。孵育24 h后，将迁移至滤膜下表面的细胞通过光场显微镜捕获图像。2.13. 透射电子显微镜通过梯度超离心收集外泌体样品并制备用于透射电子显微镜（TEM）分析。将外来体固定在铜网格上，并用1%戊二醛在冷的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中固定5分钟然后将它们在无菌蒸馏水中洗涤，用pH 7的草酸铀酰溶液对比5分钟。进行TEM以在80 kV的电压下捕获2.14. 流式细胞术使用胰蛋白酶或乙二胺四乙酸（EDTA; Sigma）分离细胞样品，然后预先固定和透化。将细胞与第一抗体（1 -5 1 g mL-1）孵育45 min;然后加入荧光染料偶联的第二抗体（0.3-0.5 1 g mL-1），并将细胞在4 ℃下在黑暗中孵育30 min。对于细胞内染色，将细胞在1%福尔马林中固定20分钟，并用100%乙醇透化。在与一抗和二抗孵育之前，在荧光激活细胞分选仪（FACS）缓冲液（Sigma）中的0.2%吐温中孵育。使用FACSCalibur平台采集并分析样品。2.15. 统计分析所有数据表示为一式三份实验和/或三次重复的平均值±标准偏差（SD）。使用Student双尾t检验确定统计学显著性认为P0.05的结果具有统计学显著性。3. 结果3.1. 胰腺癌CD44是一种多结构和多功能的细胞表面分子，参与各种生物学过程，对癌细胞的病理活动至关重要[26]。为了探讨CD44与胰腺癌转移的关系，我们首先在XENA数据库中使用Oncomine浏览器比较了正常个体和胰腺癌患者之间的CD44表达水平。从XENA数据库获得的结果表明，胰腺癌患者中的CD44表达高于正常个体（图1（a））。进一步yhttp://xena.ucsc.edu/http://www.oncomine.orgW. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131416Fig. 1. CD44与胰腺癌的分期、肿瘤状态、侵袭性及预后不良呈正相关。(a)通过挖掘Oncomine数据库，使用XENA数据集在患者样品的正常和转移组织正常组织由1表示，肿瘤患者组织由2表示。* ：P0.05。（b）（c）采用Western blotting法检测患者血清中CD 44和a6b 4的表达水平。为了确定CD44在肿瘤转移中的作用，我们还分别分析了不同级别原发性和转移性肿瘤患者中的CD44表达（附录A图S1）。此外，使用UALCAN浏览器y分析来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的具有高或低/中CD 44表达水平的患者的存活曲线。很明显，与低/中等表达水平的CD 44患者相比，高表达水平的CD 44患者预后较差（图11）。 1（b））。整联蛋白受体促进细胞粘附并通过其大的胞外结构域介导胞外基质的活化[29]。因此，它们通过胞外结构域以及与细胞骨架蛋白相互作用的胞内结构域与配体结合[30]。有趣的是，我们还发现胰腺癌中CD44的表达与α6β 4（一种与细胞膜结合的整合素）正相关。我们评估了早期和晚期胰腺癌患者血清中CD 44和a6b 4结果发现，晚期肿瘤患者血清中CD 44和a6b值得注意的是，在来自癌症晚期患者的血清样品中，CD 44与α6β 4整联蛋白正相关，而在来自癌症早期患者的血清样品中，CD 44与α6β4之间的相关性不强（图1（c））。临床样本的这些结果与数据库的分析一致。因此，CD44可能是胰腺癌的潜在预后生物标志物，并可能与细胞粘附分子a6b4相关。yhttp://ualcan.path.uab.edu3.2. CD44对胰腺癌中a6b在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强。Epithelial–mesenchy- mal transition (EMT) is also regarded as an initial signof early tumor metastasis CD44分子包含细胞外结构域，其在细胞表面上表达并参与细胞运动[31]。因此，我们探讨了CD44在胰腺肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用。两个胰腺癌细胞系，PANC-1和Capan-1，被用来检查CD 44和其他细胞运动相关基因之间的关联。考虑到患者样本中CD 44和a6b 4之间的相关性，我们首先检测了这两种细胞系中CD 44和a6b4的表达水平。CD44和a6b4在这两种细胞系中均高度表达（图2（a））。为了进一步评价CD 44在肿瘤转移中的作用，分别使用PANC-1和Capan-1细胞系建立CD 44敲低（shRNA-CD 44）细胞系。在抑制CD 44表达后，α6b4的表达水平下调（图2（b）），表明CD 44可直接调节α6b 4的表达。为了探索-行动之间CD44和a6b 4，我们执行一个共同的，通过免疫沉淀（Co-IP）实验来证实CD 44是否可以在PANC-1和Capan-1细胞系中与α6β4形成复合物（图2（c））。此外，还发现其他细胞运动性相关基因，包括Src、EPCAM和Ras，在P-CD 44 kd和C-CD 44 kd细胞系中下调，这意味着CD 44可能通过调节各种信号传导级联而有助于细胞迁移和侵袭（图1B）。 2（d））。此外，抑制CD44下调了多种蛋白酶;如图所示，MMP-9在P-CD 44kd和C-CD 44kd细胞系中的降低最显著，而MMP-2和MMP-4的表达水平在P-CD 44kd和C-CD 44MMP-13降低通过约百分之四十60%，W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131417（图） 2（d））。Src（一种与细胞骨架重塑相关的蛋白酪氨酸激酶）的表达在P-CD 44 kd和C-CD 44 kd细胞系中也降低，表明CD 44调节Src表达以改变细胞骨架的结构以及细胞骨架与细胞膜之间的接触位置，从而促进细胞迁移（图11）。 2（d））。此外，进行细胞膜染色以评估CD44和某些其他EMT相关蛋白的共定位。CD 44与EMT相关蛋白的共定位在P-CD 44kd中明显减少，尤其是CD 44与a6b 4的共定位。值得注意的是，CD 44与MMP-9以及波形蛋白和Ras在细胞表面上显著共定位。而在P-CD 44kd和C-CD 44kd细胞系中，这些蛋白的共定位减少。这些结果表明，CD44的表达降低可以下调Src和Ras信号通路。此外，蛋白质在细胞膜上的共定位减少可能有助于肿瘤转移过程的早期阶段，导致细胞粘附和迁移（图1）。 2（e））。3.3. CD44影响细胞增殖和活力异常细胞增殖是肿瘤生长和侵袭性的重要特征。因此，我们评估了图二、CD 44调节胰腺癌中a6b 4的表达（a）采用Western blotting法检测胰腺癌细胞系PANC-1和Capan-1中CD 44和α6b 4的表达（b）ShRNA-CD44用于通过沉默CD 44表达来敲低PANC-1和Capan-1细胞系中的CD 44（c）CD 44和α6β 4的Co-IP结果表明，在PANC-1和Capan-1细胞系中，CD 44直接与a6b 4整合，形成CD 44免疫球蛋白G（IgG）用作对照。（d）提取总蛋白并进行Western印迹分析以检测PANC-1、β-CD 44kd、Capan-1和C-CD 44kd细胞系中EMT相关蛋白的表达(e)共聚焦显微镜确定了CD 44和EMT相关蛋白的定位，并证明了评估细胞表面CD 44- a 6 b 4复合物的能力使用共聚焦显微镜获得图像并合并以评估蛋白定位（比例尺：50μ m）。W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131418CD44对肿瘤细胞增殖的影响。为了阐明CD 44和b4之间的关系，我们用shRNA-b4建立了b4敲低（b4kd）细胞系。将shRNA-b4转染PANC-1和Capan-1细胞系（分别为P-b4kd和C-b4将PANC-1、P-CD 44kd和P-b4kd接种（每种细胞系200和1000个细胞）在6孔板中，培养10天后计数细胞集落数。我们观察到PANC-1具有最大数量的集落，而与PANC-1细胞相比，P-CD 44 kd和P-b4kd细胞系中的集落数量分别少约30%和50%（图1B）。 3（a））。进行CCK-8测定以监测不同细胞系中的细胞生长，并且数据显示肿瘤和敲低细胞系之间的差异很小（图3（b））。通过CFSE标记对PANC-1、P-CD 44kd和P-b4kd细胞系进行细胞周期分析，结果显示培养72 h后进入第三周期的P-CD 44kd和P-b4kd细胞数少于肿瘤细胞数，提示CD 44和b4不影响细胞增殖和细胞周期（图3（c））. Annexin-V-FITC/PI染色用于评估CD 44和b4异常表达的肿瘤细胞在24、48和72 h的细胞增殖。结果表明，随着顺铂浓度的增加，三种细胞系的凋亡细胞数均增加。与PANC-1细胞相比，P-CD44kd和P-b4kd的抗凋亡性在所有三个测试时间点均降低。与PANC-1细胞相比，P-CD 44 kd和P-b4kd细胞的凋亡率增加了约10%（图1）。 3（d））。3.4. CD 44肿瘤细胞通过膜结构和细胞肌动蛋白的变化实现运动和侵袭;这导致周围组织的渗透，导致肿瘤侵袭和转移[32]。因此，我们测定了PANC-1、Capan-1、P-CD 44kd、C-CD 44kd、P-b4kd和C-b4kd细胞系中的细胞粘附和结构调节.将这些细胞接种到96孔板中;培养4小时后，洗涤细胞两次以除去非粘附细胞。通过对粘附细胞进行结晶紫染色来评价细胞粘附酶联免疫吸附试验（ELISA）结果显示，约50%的肿瘤细胞粘附在平板上，而只有约30%的CD44kd细胞粘附在平板上。值得注意的是，只有10%的b4kd细胞粘附在平板上。这些结果表明，在CD 44 kd和b4 kd细胞系中粘附均降低（图1B）。提示CD44和b4表达的降低导致细胞失去连接和粘附能力。为了从形态学角度进一步研究细胞粘附进行共聚焦显微镜以观察细胞触角，并捕获和分析图像共聚焦显微镜图像显示，与肿瘤细胞相比，P-CD 44 kd、C-CD 44 kd、P-b4 kd和C-b4 kd细胞的细胞触角减少（图11）。 4（b））。虽然我们没有研究CD44和a6b4与细胞凋亡的关系，粘附，我们研究了CD 44和a6b 4与这些细胞系中的细胞迁移图3.第三章。CD44表达和细胞增殖和活力。（a）通过克隆形成测定来测量降低的CD 44和b4对细胞生长的影响将细胞（每种细胞系200和1000个* ：P0.05。(b)CCK-8法检测肿瘤细胞和敲减细胞的增殖情况。在指定的时间点测量细胞并使用CCK分析增殖能力OD：光密度。（c）用CFSE标记细胞以显示不同细胞周期中的细胞比例，并通过FACS分析（d）用梯度浓度的顺铂处理细胞，通过Annexin-V-FITC/PI染色评估细胞凋亡，并进一步用FITC染色评估* ：P0.05。W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131419图四、CD 44（a）通过细胞结合测定来评估CD44对肿瘤粘附的影响将6个细胞系接种在96孔板中4小时。洗涤细胞并用结晶紫染色显示了粘附细胞百分比的平均值± SD* ：P0.05。（b）评估CD44对肿瘤触角的影响将细胞接种在盖玻片上并用鬼笔环肽异硫氰酸荧光素染色。进行共聚焦显微镜以捕获代表性图像。(c)transwell法检测CD44对肿瘤细胞迁移的影响。将细胞接种在上部transwell室中，并且底部孔中的细胞的结晶紫染色显示迁移能力。* ：P0.05。细胞迁移是一个复杂的过程，涉及细胞骨架的急剧重塑以及细胞骨架和细胞膜之间的相互作用[27]。CD44可以介导细胞骨架相关蛋白，其参与细胞骨架重塑过程[22]。因此，我们接下来想研究CD44和a6 b4是否也有助于细胞迁移。将细胞接种到transwell小室中，并在24 h后评价迁移细胞。为了分析细胞运动性，将细胞用结晶紫染色并在光学显微镜下观察。transwell检测结果显示，CD 44- a 6 b 4敲低（CD 44- a 6 b 4 kd）细胞迁移到底部孔的数量减少减弱了这些细胞的迁移能力（图4（c））。我们还对细胞进行了基质胶侵袭试验，发现CD44缺失的细胞显示肿瘤细胞侵袭的显著降低（附录A图S2）。这些实验表明，在肿瘤转移过程中，CD 443.5. CD44与a6b 4在肿瘤来源的外泌体中的外泌体从供体细胞转移生物活性分子，这些分子被邻近组织吸收[33];因此，它们调节靶细胞行为。通过密度梯度离心法提取PANC-1和P-CD44kd外泌体，并使用扫描电子显微镜检查外泌体的形态。PANC-1和P-CD 44kd外泌体均显示杯形纳米结构以及相似的尺寸和质量（图5（a））。纳米颗粒跟踪分析（NTA）指示来自肿瘤和CD44 kd细胞的外来体的粒径（图1B）。 5（b））。Western blotting结果显示，P-CD 44kd外泌体中的CD 44表达水平低于PANC-1外泌体，这表明P-CD 44kd外泌体携带较少的来自供体细胞的CD 44膜蛋白（图5（c））。这些结果表明，与供体细胞相比，肿瘤来源的外泌体含有相似的蛋白质及其复合物。考虑到CD44由于来自供体细胞表面的内吞作用而在外来体中富集，我们接下来评估了外来体中外来体CD44和α6β 4之间的相互作用.为了验证CD 44和α6β 4是否可以形成复合物并释放到细胞外空间中，进行Co-IP测定以评估肿瘤来源的外来体（图5（d））。此外，表达水平PANC-1 和 β-CD 44kd 细 胞 系 中 整 合 素 α6β4 的 表 达 被 抑 制 剂 如Cilengitide和Cyclo（MCE，USA）的组合所消除。从这些细胞中分离外来体并用抑制剂预处理。我们观察到，在分别阻断细胞和外来体中的b4表达后，CD44的表达没有显著变化（图5（e））。这些结果表明，CD44可能不受整合素的调节。3.6. 外泌体CD44通过肝细胞活化促进转移外泌体可以在靶器官中产生转移前小生境，从而促进靶区域的转移[34，35]。因此，我们确定了CD44感受态外泌体对靶细胞摄取的影响。用荧光染料diosp-18染色从PANC-1和β-CD 44kd细胞分泌的外泌体，然后将染料标记的外泌体与宿主细胞LX-2（人肝星状细胞（HSC）系）孵育HSC主要将信号从窦状隙细胞传递到肝实质，支持促炎细胞因子和趋化因子的活化。到W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131420图五、在exosomes中，CD44和a6b4相互作用（a，b）通过超离心分离从PANC-1和β-CD 44kd细胞分泌的外泌体，并通过TEM成像;进行纳米颗粒跟踪分析以确定外泌体的大小（c）免疫印迹分析显示β-CD 44kd外泌体中的CD 44表达水平(d)进行Co-IP实验以检查CD 44和α6β 4在PANC-1外泌体中的整合。IgG用作对照。（e）免疫印迹分析显示在用抑制剂预处理后PANC-1细胞和外来体中CD 44和α6β 4的表达用抑制剂预处理PANC-1细胞48小时以阻断整联蛋白表达，并从经抑制剂处理的肿瘤细胞中分离PANC-1衍生的外泌体PANC-1 exosomes中的CD 44在体外可与a6b 4相互作用形成复合物。Inh：抑制剂。检测外泌体CD 44在细胞摄取和串扰中的作用，将PANC-1肿瘤和P-CD44kd外泌体与LX-2细胞孵育48 h。有趣的是，尽管两种类型的外泌体的绿色荧光区域在相同的放大倍数下被捕获，但它们没有显示出数量上的差异。大部分PANC-1外泌体进入LX-2细胞，而P-CD 44kd外泌体仅附着于靶LX-2细胞表面并进入细胞外间隙，表明P-CD 44kd外泌体丧失摄取能力（图6（a））.接下来，我们进行了transwell测定以评估由肝细胞调节的肿瘤外泌体的侵袭能力。将LX-2细胞与PANC-1外泌体和P-CD 44kd外泌体一起孵育，并检测LX-2细胞的迁移率。检测到2个细胞。将外泌体调节的LX-2细胞接种到上部transwell室上，培养24小时后，将迁移的细胞用结晶紫染色（图6（b））。显微镜图像显示与外来体孵育促进细胞向底部孔的迁移，并且我们观察到与P-CD 44kd外来体孵育组相比，PANC-1外来体孵育组中进入底部孔的细胞数量增加。在胰腺肿瘤细胞转移到肝脏之前，由于活化的HSC和肌成纤维细胞，成纤维细胞活化蛋白（FAP）的表达增加，这促进了转移前小生境的建立[36]。FAP的过表达增加了CD44的表达，表明在该上皮细胞系中由CD44介导的细胞粘附和迁移途径。FAP增加LX-2人星状细胞系中的凋亡、细胞粘附和迁移[37]。因此，我们分别评估了对照LX-2、PANC-1外泌体调节的和β-CD 44kd外泌体调节的LX-2细胞中α-SMA、FAP和CD 44的表达（图6（c））。Western blotting分析显示，LX-2细胞中细胞因子和生长因子的表达水平上调，提示胰腺肿瘤外泌体激活了肝细胞。值得注意的是，与CD 44kd外泌体相比，CD 44感受态外泌体显示出更强的调节靶LX-2细胞中分子的能力-特别是肝细胞生长因子（HGF）、α-SMA、透明质酸（HA）和CD 133的表达水平[38]-表明外泌体CD 44在肿瘤从原发部位转移的过程中起关键作用。将肿瘤转移到靶器官（图6（c））。这些结果表明，外泌体中的CD44对靶细胞的侵袭能力有影响。4. 讨论胰腺癌是一种侵袭性恶性肿瘤，5年死亡率为97%-98%，通常是由于广泛的大约60%因此，迫切需要鉴定用于胰腺癌早期检测和预后的敏感和特异性生物标志物[40]。 据报道，CD44是与各种癌症的肿瘤进展和不良预后相关的潜在生物标志物有趣的是，与肿瘤中心相比，转移性肿瘤标本的肿瘤边缘CD44表达富集，这强调了CD44在转移中的重要性[41]。尽管最近的研究表明高水平的CD 44表达与包括胰腺癌在内的几种类型的癌症有关，但CD 44在胰腺癌转移中发挥作用的机制以及整合素α6β 4是否与CD 44相互作用并作为介导物起作用仍然是未知的。本研究证实CD44高表达水平与胰腺癌的发病率和转移呈正相关。此外，使用临床样本，我们发现a6b 4的表达水平与胰腺癌的分期呈正相关。另外，我们的实验证明CD44可以与α6β4结合形成复合物，该复合物可以调节Src和ERK等信号通路。同时，粘着斑激酶（FAK）是一种非RTK，它对整合素介导的信号传导和细胞功能至关重要。FAK还作为各种信号传导途径的汇聚点，特别是与肿瘤运动性和致癌转化相关的核因子（NF）-κBCD44和a6b 4的结合也促进肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖和凋亡。我们首次发现胰腺癌来源的外泌体携带的CD44可以与a6b 4相互作用，从而调节靶细胞的运动性。外来体W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131421图六、CD 44（a）肿瘤来源的外泌体调节靶细胞;将100lg·mL-1的PANC-1外泌体和P-CD 44kd外泌体与LX-2细胞共培养24 h。在绿色荧光视野中显示的染料标记的外来体从PANC-1和P-CD 44kd细胞系分泌。通过共聚焦显微镜获得图像。将绿色荧光与亮视野（BLF）合并，并且一起观察细胞和外来体。（b）通过transwell测定法确定外来体对靶细胞迁移的影响用结晶紫染色迁移到底部孔的LX-2细胞以细胞数作为评价细胞侵袭能力的指标未进行外泌体孵育的LX-2细胞作为空白对照。（c）评估靶细胞中细胞因子和生长因子的表达水平用肿瘤来源的外来体预处理细胞将LX-2细胞与PANC-1和CD 44kd外泌体一起孵育不进行外泌体孵育的LX-2细胞作为空白对照组。b-肌动蛋白用作蛋白质加载对照。HA：透明质酸;VEGF：血管内皮生长因子; GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。CD 44CD44不仅是一种潜在的生物标志物，而且可以用于靶向治疗。转移到重要器官如骨、肺、肝和脑是绝大多数PDAC死亡的原因[42]。已经清楚地认识到，转移性接种和生长由肿瘤细胞的内在遗传特性和基质微环境的局部特征决定[43]。了解转移相关信号通路的器官特异性功能可能为靶向治疗不同器官的转移提供新的机会。胰腺癌肝转移的研究是一个复杂的过程，有许多困难.事实上，由于肝脏手术不是一种治疗选择，因此无法获得肝脏转移病灶进行详细分析图7.第一次会议。说明CD44和整合素在胰腺癌肝转移中的调节和作用的示意性模型W. 穆，Y.Xu，黑顶山P.Gu等人工程7（2021）14131422几乎所有的转移性胰腺癌患者[8，44]。因此，对胰腺癌细胞系的体内选择的高转移性变体的最小功能基因组分析已经导致鉴定不同的器官特异性（例如， 骨、肺和脑）转移基因[45]。HSC积极参与建立癌症转移前小生境，并被癌细胞重新编程以促进肿瘤生长，成为癌症相关HSC。在本研究中，我们关注淋巴归巢肿瘤中的一个上调基因CD44[14，20]。CD44是一种跨膜蛋白，先前已暗示正常淋巴细胞归巢至淋巴结。CD44可诱导许多与肿瘤转移过程相关的活动，如不受控制的细胞生长、细胞骨架重组和密集的细胞迁移[46]。例如，CD 44-最近的研究还报道，CD44可以与不同类型的膜蛋白相互作用，形成复合物，从而促进恶性级联反应。粘附分子及其相应配体在宿主器官和肿瘤细胞中的明确表达控制器官和选择性非随机肿瘤阻滞[47]。例如，E-钙粘蛋白-整联蛋白串扰调节上皮细胞-细胞粘附和细胞-基质粘附信号传导之间的动态相互作用CD44和整联蛋白可以介导类似蛋白质的表达，例如Rho家族和Src[30]。CD44已被证明是整合素avb 3介导Runx 2磷酸化的关键共受体和Smad 5的表达，并可能成为前列腺癌转移过程中NF-κB配体信号传导的受体激活剂。因此，CD44决定了整合素与其他受体之间的关联[48]。因此，有必要探讨CD44与整合素之间是否存在相互作用，以增强其在肿瘤转移中的作用。我们的研究表明，CD 44可以与整合素α6β 4相互作用，形成CD 44外泌体是细胞来源的微囊泡，供体细胞的蛋白质、脂质、mRNA和miRNA[43]，以系统的方式作为细胞间通讯器[11]。几项研究表明，肿瘤外泌体分子如整联蛋白可通过与器官特异性驻留细胞融合以建立转移前小生境来确定向器官转移[49，50]，这进而显示出对次级靶点的各