没有合适的资源?快使用搜索试试~ 我知道了~
www.engineering.org.cn第1卷·第2期·2015年月工程269研究3D打印-物品工程2015,1(2):269-274DOI 10.15302/J-ENG-2015062基于生物打印的MCF-7人乳腺癌细胞三维球体的高通量构建Kai Ling1,2,Guoyou Huang2,3,Juncong Liu2,Xiaohui Zhang2,3,Yufei Ma2,3,Tianjian Lu2*,Feng Xu2,3*摘要细胞球状体作为体外三维组织模型在病理学研究和药物筛选中的应用越来越受到人们的关注。已经开发了各种方法,特别是包括微孔,用于工程化细胞球状体。然而,由于两步成型和细胞接种,这些方法通常遭受破坏性成型操作或细胞损失以及孔中的不均匀细胞分布。我们已经开发了一种简便的方法,利用细胞包埋的水凝胶阵列作为模板,用于凹面孔的制造和MCF-7细胞球体的原位形成。芯片定制的生物打印系统被应用于以高通量、灵活和受控的方式制造牺牲明胶阵列和顺序凹面孔。实现原位细胞接种的细胞球体建设的能力被证明具有均匀的细胞接种的优势和芯片上的组织模型的编程制造的潜力。所开发的方法在组织工程、再生医学和药物筛选方面具有巨大的应用潜力。关键词MCF-7细胞球状体、生物打印、水凝胶、凹孔、组织芯片1引言体外组织模型,例如基于细胞球体类的那些模型,在细胞生物学、组织工程、再生医学和药物筛选应用中吸引了越来越多的兴趣[1-4]。细胞球状体是多个细胞的三维(3D)聚集体,其尺度通常为数十至数百微米。人们普遍认为细胞在细胞球状体中,与传统的二维(2D)培养板相比,微环境以更自然的方式提示[5,6]。此外,与基于支架的3D模型相比,细胞球状体本质上是无支架的;该特性可能有助于细胞球状体避免生物相容性问题[7]。不同类型的细胞已被工程化为细胞球状体,包括正常细胞[8,9]、癌细胞[10,11]和干细胞[12,13],以及细胞类型的混合物[14,15]。特别是,芯片技术的引入最近激发了组织/器官移植芯片技术的出现和突出发展,该技术被认为在生物医学领域具有很大的前景[16已经开发了各种方法用于通过探索细胞的流体和自组装能力来产生细胞球状体[19]。一种简单的方法是在非粘附性基质上培养细胞[20],其中细胞与细胞的相互作用比细胞与基质的相互作用更强,导致细胞聚集。为了促进细胞的组装,已经探索了重力和磁力,分别导致了悬滴法[21]和磁悬浮法[22]的发展。微孔也被广泛用于限制细胞的生长空间,有利于形成具有受控和均匀尺寸的细胞球状体[11]。在这些方法中,微孔吸引了越来越多的关注;特别是具有凹结构的那些,由于其优点,例如易于操作、良好的可重复性和高的微孔通量能力[23,24]。然而,几乎所有当前的微孔方法都需要在制备微孔板后手动接种细胞,这可能很麻烦,并且可能导致细胞损失和不均匀的细胞接种[25]。此外,需要特殊的模板和仔细的成型过程来获得明确的凹微孔,这限制了它们的可及性。因此1Xi交通大学航空航天学院机械结构强度与振动国家重点实验室,Xi 710049; 2Xi交通大学仿生工程与生物力学中心,Xi 710049; 3 Xi* 通讯作者。电子邮件地址:tjlu@mail.xjtu.edu.cn、fengxu@mail.xjtu.edu.cn接收日期:2015年2月9日;接收日期:2015年3月25日;接受日期:2015年3月30日作者(S)2015出版社:Engineering Sciences Press这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)270工程第1卷·第2期·2015年6www.engineering.org.cn研究3D打印-文章仍然迫切需要一种柔性制造方法球状体,特别是那些具有在芯片上工程化组织的潜力的球状在这项研究中,我们开发了一种基于生物打印的方法,用于在芯片上原位制造凹孔和生成细胞球状体。首先构建并应用定制的生物打印系统,以产生载有细胞的牺牲明胶阵列。这些载有细胞的明胶阵列随后用作模板,用于制造凹孔并在非粘附性水凝胶基底上形成细胞球状体。该方法是简单的,据我们所知,代表了第一次使用生物相容性水凝胶作为模板,用于制造具有原位细胞接种能力的凹孔,用于细胞球状体形成。2 材料和方法2.1 生物打印系统的建立和改进为了获得高可控性的明胶溶胶液滴的产生,应用基于压力传感器辅助的数值传感器的生物打印系统。该系统是定制的,如图1(a)所示。该系统设置在垂直层流清洁工作台中,主要部件为三轴运动台(KDT 180 × 100 mm LM(XY)和MT 105 × 50 mmLM(Z),Feinmess Dresden GmbH,Dresden,Germany)、电磁阀喷射器(型号 G100 × 150300 , TechElan , Mountainside , NJ , USA ) 和 数 字 信 号 发 生 器(Agilent 81101 A,Test Equipment Connection,Lake Mary,FL,USA)。所有这些部件都由计算机控制。图1.生物打印平台。(a)生物打印平台的图像;(b)作为气动压力的函数的平均液滴体积,并且阀打开持续时间为5 ms;(c)作为阀打开持续时间的函数的平均液滴体积,并且气动压力为0.05MPa。误差条表示标准误差(n= 5)。2.2 基于生物打印的牺牲明胶阵列选择明胶作为牺牲性水凝胶阵列是因为其生物相容性以及在温和温度条件下的可注射和可逆胶凝能力。为了制造明胶阵列,将猪皮明胶粉末(凝胶强度300,A型,SigmaAldrich,St.Louis,MO,USA)加入到磷酸盐缓冲的明胶溶液中。线(PBS)溶液中,并在50 °C下轻轻搅拌直至完全溶解。然后将溶胶溶液水浴至37 °C,转移至样品瓶保持注射器,并印刷到涂覆有聚氯乙烯(PTFE)膜的培养皿上。使用PTFE膜是因为其具有物理上的疏水性和化学上的惰性,并且易于使用。在打印期间,注射器中明胶溶液的温度保持在37 °C。调节辅助打印压力和信号的脉冲宽度以控制明胶液滴的打印体积,从而控制明胶阵列的尺寸和形状。将具有打印的明胶阵列的培养皿立即转移到冰箱中,并在4 °C下冷却5分钟,以使明胶前体凝胶化。2.3 凹孔的明胶阵列模板化制造基于聚乙二醇(PEG)的水凝胶由于其生物相容性、光交联性和细胞粘附非粘附性而用于从明胶阵列模制凹孔。这些水凝胶也已被其他人用于制造用于形成细胞球状体的孔[26-28]。在我们的实验中,将PEG二甲基丙烯酸酯(PEG二甲基丙烯酸酯,MW 1000,Polysciences,Inc.,Warrington,PA,USA)以20%(w/v)的浓度溶解在PBS溶液中,然后冷却至4 °C。在将PEG-1,2,3-二甲基乙酰胺溶液浸泡倒在具有明胶阵列的培养皿上之后,将PEG-1,2,3-二甲基乙酰胺溶液暴露于365 nm紫外线(UV)功率为2.9 mW的光。cmelXLE1000A/F , Spectroline ,Westbury , NY , USA ) 20 秒 进 行 胶凝。在光交联过程中,将2-羟基-2-甲基苯 丙 酮 ( TCIShangZhonghaiDevelopment Co.,有限公司、上海,中国)以0.1%(w/v)的浓度用作光引发剂。在37 °C下孵育24小时后,明胶阵列重新溶解成溶胶相,并在PEG-10 DMA基底上形成凹孔。2.4 明胶阵列和凹面孔的表征明胶阵列在用PEG-DMA模塑之前用倒置荧 光 显 微 镜 ( Olympus IX 81 ,Olympus,Irvine,CA,USA)成像。3D打印-物品研究www.engineering.org.cn第1卷·第2期·2015年月工程271为了对孔成像,将PEG-1,2,3,4-二甲基乙酰胺底物从PTFE膜覆盖的培养皿中轻轻分离,并在PBS溶液中溶胀至平衡。从PBS溶液中取出后,用印迹纸轻轻除去PEG-1,2,3,4-DMA基底表面和孔中过量的PBS溶液。为了捕获孔的横截面,用剃刀刀片小心地穿过孔切割PEG PDDMA底物,并立即用IX 81显微镜拍摄图像。用Image Biological Pro Plus(IPP,版本6.0,Media Cybernetics , Silver Spring , Rock Biological ville ,MD,USA)分析图像以量化PEG Biological DMA基底上的明胶阵列和孔的尺寸。2.5 原位细胞接种和细胞球体形成我们使用MCF-7人乳腺癌细胞来验证我们的方法的原位细胞接种能力,用于在芯片上高通量地制造细胞球状体。将细胞在RPMI 1640培养基(HyClone,South Logan,UT,USA)中培养,并补充有10%胎牛血清(Gibco Industries,Inc.,BigCabin,OK,USA)在37 °C下在加湿的5%CO2培养箱中培养。实验前,将细胞用胰蛋白酶(EDTA 1×,Mediatech,Inc.,Manassas,VA,USA)并离心,除去液体上清液。然后将细胞重悬于培养基中。然后将制备的细胞悬浮液与预过滤的明胶溶液轻轻混合,最终细胞密度为5 × 10 5细胞。mL-1 ~ 1 × 106细胞。mL在37 °C下的3%(w/v)的浓度。然后将细胞悬液明胶混合物装入注射器中,用于制备明胶阵列和孔,如第2.2和2.3节所述。孵育1小时后,移除培养皿盖,并每日更换细胞培养基。 用Olympus IX显微镜观察细胞球体的相差图像81. 在 使 用 活 / 死 存 活 力 / 细 胞 毒 性 试 剂 盒 ( Influenzavitrogen,Washington,DC,USA)对球状体或聚集体染色后,观察共聚焦荧光图像(LSM 700,ZEISS,New York,NY,USA)。该试剂盒用钙黄绿素AM将活细胞染色为绿色,用乙锭血红素二聚体-1将死细胞染色为红色。使用IPP从共聚焦切片定量细胞活力。3 结果和讨论我们构建的生物打印系统如图1(a)所示。证明了用于产生nL体积的液滴的生物打印系统的高度可控性;这种控制可控性可以通过改变气动压力或阀瓣打开持续时间来实现,分别如图1(b)和图1(c)所示。发现明胶溶胶溶液的最佳浓度为~3%(w/v),低于该浓度时明胶阵列太软而不能用作模板,高于该浓度时发生阀阻塞和溶液积水。然后将生物打印系统应用于产生受控的明胶阵列,用于制造凹面孔和原位细胞球状体形成,如图2所示。首先,在疏水性PTFE膜覆盖的培养皿上产生不同尺寸的明胶阵列,如图3(a-c)所示。成型后,在PEG微球上形成凹孔图2.用于细胞球状体形成的凹孔制造和原位细胞接种的示意图。(a)用疏水PTFE的膜层覆盖培养皿;(b)将明胶和细胞溶液印刷到PTFE覆盖的培养皿上;(c)当在4 ℃下冷却时形成细胞包封的水凝胶阵列;(d)将冷的PEG-DMA溶液倾倒到细胞包封的明胶阵列上,以及(e)将其暴露于UV光以进行交联;(f)将其翻转并在37 °C下孵育以使明胶溶解并将细胞释放到孔底部;(g)在进一步培养期间形成细胞球状体。如图3(d-f)所示,DMA基底具有与明胶微阵列模板几乎相同的尺寸,证明了高的模塑保真度,因此证明了使用明胶微阵列作为模板的可行性。通过将打印的明胶液滴的体积从0.1μL调整到0.48μL,可以制备半径从 420μm到530μm、深度从230μm至550μm可以很容易地获得,如图3(g)所示。如图3(h)所示,这种方法形成了半径为480微米至530微米、深度为250微米至550微米的凹井。通过调整打印压力或数字信号的脉冲宽度,可以轻松调整液滴体积。由于高压可能会导致细胞损伤和明胶液滴与基底之间的不必要的强制冲击,因此我们仅调整脉冲信号宽度以控制明胶液滴体积。具有高深度的孔可以具有避免在培养基交换期间细胞损失的优点。我们期望通过优化明胶阵列的生产来制造具有更可控的尺寸和更高的成型保真度的孔,这可以通过使用更疏水的基底来改善明胶液滴疏水角来实现。为了证明我们的方法在芯片上形成细胞球状体的原位细胞接种能力,我们首先将MCF-7细胞与明胶前体以1 × 106个细胞的密度混合。mL并以每滴0.48微升的体积打印混合物。在成型并在37 °C下孵育1小时后,明胶阵列反转为溶胶相,并且细胞被封装在凝胶中。在明胶中,被释放并沉积在研究3D打印-文章272工程第1卷·第2期·2015年6www.engineering.org.cn孔形成在PEG-1,2,3-二甲基甲酰胺基底上。在随后的培养过程中,细胞增殖,挤在一起,最后自我组装成紧凑的细胞图3.水凝胶凹面孔的受控制造。(a)印刷明胶阵列的总体视图(b)明胶阵列的俯视显微镜图像(c)(d)在PEG-DMA上形成的凹孔的总体视图(e)PEG-DMA孔的俯视显微镜图像;(f)凹面孔的横截面的侧视图(g)明胶阵列尺寸的可控性;(h)凹孔尺寸的可控性(b)中的比例尺(c)、(e)和(f)为0.5mm。(g)和(h)中的误差条表示标准偏差(n= 5)。第7天的球状体,如图4(a)所示。我们在整个过程中观察到非常少的死亡细胞,如图4(b)所示。具有印刷体积的0.23μL 和 相 同 的 细 胞 悬 液 接 种 密 度(即,1 × 10 6细胞。mL虽然细胞聚集体在培养7天后观察到,这些不像0.48μL组中的那些那样致密,如图4(c)所示。即使在培养14天后,观察到的细胞聚集体 也 没 有 显 著 变 化 ( 此 处 未 显 示 结果)。图4(b)中的水平横截面共聚焦荧光图像显示,存在黑色中央区域,无染色细胞,这可能是由压实细胞球体中活/死溶液的扩散限制引起的。在图4(d)中没有观察到该中心域,表明形成的细胞聚集体具有0.23可以是盘形。从图3(f)和图3(h)中,我们知道每个液滴的打印明胶体积为0.23μL和0.48μL的制造孔的半径为480μm和530 μm,深度为390 μm和550 μ m。,分别。因此,在我们看来,井深可能在致密细胞球状体的形成中起重要作用。我们进一步研究了的 初始 在 原位 细胞接种密度图4.水凝胶凹孔中的细胞球状体形成。(a)细胞球体发育的相差图像;(b)在0.4 8 μL明胶液滴和1 × 10 6个细胞·mL-1的细胞接种密度下培养7天后细胞的钙黄绿素和溴化乙锭染色;(c)细胞球体发育的相差图像;在0.2 3 μL明胶液滴和1 ×10 6个细胞·mL-1的细胞接种密度下培养7天后,对细胞进行钙黄绿素和溴化乙锭染色;(e,f)在由(e)0.48 μL和(f)0.2 3 μL明胶液滴制成的孔中培养7天后细胞球体形成的相差图像,细胞接种密度为5 × 105个细胞·mL-1;(g,h)分别对应于(e)和(f)的活/死荧光图像;(i)细胞球体形成期间的细胞活力。(a)-(h)中的比例尺为200 μm。3D打印-物品研究www.engineering.org.cn第1卷·第2期·2015年月工程273细胞球体的形成。结果表明,当接种密度为5 × 10 5个细胞时,形成的细胞球体积小得多。mL-1,如图4(e)-(h)所示,与1 × 10 6细胞密度相比。mL因此,可以通过调节原位细胞接种密度来控制细胞球体的大小。图4(i)显示在细胞球状体形成期间维持高细胞活力。此外,原位细胞接种能力有效地避免了细胞损失。此外,由于生物打印系统的可控性,实现了接种细胞在孔之间的均匀分布。从形态学上讲,细胞球体可以更好地模拟类器官的结构,从而比传统的2D培养板更好地模拟体内癌细胞的微环境。因此,预期MCF-7在细胞球状体和体内可能表现相似。为了证明这一点,需要进一步的研究,包括药物试验;这些研究将成为我们的下一个工作。虽然我们在这里只测试了MCF-7细胞,但我们相信可以使用其他细胞类型,因为明胶已经广泛应用于细胞包封,并且因为基于聚乙二醇(PEG)水凝胶的微孔板已经成功地用于生产各种细胞类型的细胞球状体,包括胚胎干细胞[29,30]。一些研究人员已经证明了使用模制或印刷的明胶牺牲元件来制造微射流水凝胶。在这项工作中,我们首次采用明胶阵列作为模板来生成用于细胞球状体形成的凹孔。尽管已经开发了其他 模 板 , 包 括 固 体 树 脂 模 具 、 SU 108 、 聚 二 甲 基 硅 氧 烷(PDMS)和冰阵列,用于制造凹孔,但这些方法存在繁琐的模具制备或破坏性脱模操作的问题[23,31此外,后手动细胞接种步骤可能导致细胞损失和不均匀的细胞分布。在这里,通过使用生物相容性和温度可逆性的载有细胞的明胶微阵列模板,我们提供了一种可能的解决方案,以克服上述限制。此外,使用定制的生物打印系统可以使我们能够以受控和高通量的方式在芯片上原位制造细胞类球体,这将对芯片上的工程组织有很大帮助。4 结论这项工作证明了由水凝胶阵列模制的凹孔的制造,其中原位接种细胞以在芯片上形成细胞球状体。使用定制的生物打印方法赋予该方法高可控性和高生物打印通量能力。生物打印和用明胶原位细胞接种的整合可以使芯片上的细胞/组织的高度程序化制造成为可能,并且因此为组织工程、再生医学和药物筛选应用带来了巨大的希望。确认本工作得到了国家自然科学基金(11372243,11532009,11522219)、国家博士后科学基金(2013M540742)、国家高等教育博士点计划(20130201120071)、陕西省自然科学基础研究计划(2014JQ1004)、中央高校基础研究基金。遵守道德操守准则Kai Ling、Guoyou Huang、Juncong Liu、Xiaohui Zhang、Yufei Ma、Tianjian Lu和Feng Xu声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用1.T. M.作者声明:by J. Morgan.多细胞球状体的形成、应用和认识的进展。专家意见。Biol. Ther. 等,2012,12(10):13472.M. Rimann,U.格拉夫·豪斯纳。用于药物开发的合成3D多细胞系统。Curr.Opin. Biotechnol. 2012,23(5):8033.L. Wang等人,工程三维心脏微组织用于潜在药物筛选应用。Curr. Med.Chem. ,2014,21(22):2497- 25094.J. Rouwkema,J. de Boer,C. A.范·布利特斯韦克。内皮细胞在骨组织工程构建体中组装成三维血管前网络。组织工程等,2006,12(9):26855.E. Fennema,N. Rivron,J. Rouwkema,C. van Blitterswijk,J. de Boer.球形类胶质细胞培养作为创建3D复杂组织的工具。Trends Biotechnol. ,2013,31(2):1086.K. Takayama等人,用于药物毒性测试的hESC/hiPSC细胞衍生的肝细胞瘤样细胞的3D球体培养。生物材料,2013,34(7):17817.P. R. Baraniak,T. C.麦克德维特间充质干细胞球状体的无支架悬浮培养保留了多系潜能。Cell Tissue Res. 等,2012,347(3):7018.A. P. Napolitano等人,利用微成型非粘附性水凝胶进行无支架三维细胞培养。生物技术,2007,43(4):494,496-5009.D. M.迪恩,J.R. Morgan.细胞骨架张力介导的张力调节微组织的定向自组装。组织工程A部分,2008,14(12):1989-199710. J. liu等人软纤维蛋白凝胶促进致瘤细胞的选择和生长细胞Nat.板牙. 等,2012,11(8):73411. J. Friedrich,C.赛德尔河埃布纳湖A.昆兹·舒加特。 基于球体的药物筛选:考虑因素和实用方法。自然保护区等,2009,4(3):309-32412. H. F.陈,Y。 Zhang, Y. P. Ho,Y. L.邱湾,澳-地Jung,K. W.梁微环境可控的双相乳化液滴中多细胞球体的快速形成。Sci.众议员,2013,3:346213. F. Langenbach等人,从多能前体细胞中产生和分化微组织用于组织工程。自然保护区等,2011,6(11):172614. M.稻盛和夫H. Mizumoto,T.河原内皮细胞包被肝细胞球体整合形成血管化肝组织的方法。组织工程A部分,2009,15(8):202915. S. F. Wong,D. Y.不Y Y. Choi,D. S.金湾G.钟,S。H.李你基于凹面微孔的尺寸可控的肝球作为三维肝组织模型。生物材料,2011,32(32):8087-809616. D. B D. Matthews,A.Mammoto,M.Montoya Zavala,H.Y. Hsin,D.E.英格伯在芯片上重建器官水平的肺功能科学,2010年,研究3D打印-文章274工程第1卷·第2期·2015年6www.engineering.org.cn328(5986):166217. D.嗯,Y。S.鸟泽湾A. Hamilton,H. J. Kim,D. E.英格伯微工程需要的生理仿生学:在微芯片上的器官移植。实验芯片,2012,12(12):2156-216418. G. Wang , et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barthsyndrome with induced pluripotent stem cell and heart cardiac on chiptechnologies. Nat. Med. ,2014,20(6):61619. R. A. Rezeland等人,用于器官打印的组织球体的可扩展生物制品。ProcediaCIRP,2013,5:276-28120. R. J. Thomas等人,体外肝细胞和肝星状细胞三维共培养对关键肝细胞功能的影响。细胞组织器官(印刷版),2005,181(2):6721. Y. C. Tung,A. Y.萧氏S. G. Allen,Y. S. Torisawa,M. Ho,S.高山使用384悬滴阵列进行高通量3D球状体培养和药物测试。分析员,2011,136(3):47322. G. R. Souza等人,基于磁性细胞悬浮的三维组织培养。天然纳米技术等,2010,5(4):29123. T. Liu,M.温特湾泰瑞超疏水基质上的准球形微孔,用于多细胞球体的长期培养和高通量测定。生物材料,2014,35(23):606024. S. E. Yeon等人,凹微孔在胰腺肿瘤球状体中的应用,可在临床相关耐药模型中进行抗癌药物评价。PLoS ONE,2013,8(9):e7334525. L. 康,M。J. 汉考克,M.D. Brigham,A.卡戴姆侯赛尼单元格约束通过擦拭在微孔阵列中形成图案化的纳升液滴。生物医学杂志。Mater. Res.A,2010,93(2):547-55726. H. Tekin , M. Anaya , M. D. 布 里 格 姆 角 瑙 曼 河 Langer , A. KhademAhhosseini用于形成和回收细胞聚集体的刺激物响应性微孔。实验芯片,2010,10(18):241127. C.金,J. H.砰,Y。E. Kim,S. H.李,J. Y.康关于芯片抗癌通过分布性微通道网络在微孔中形成的规则肿瘤球体的药物测试。实验芯片,2012,12(20):413528. C. Kim等人,用于胚胎体中干细胞的芯片上分化的三维细胞培养。实验芯片,2011,11(5):87429. H. C. Moeller,M. K. Mian,S.什里瓦斯塔瓦湾G. Chung,A. KhademhosMusseini.用于干细胞培养的微孔阵列系统。生物材料,2008,29(6):75230. Y. S. Hwang,B. G. Chung,D. Ortmann,N. Hattori,H. C. Moeller,A.卡戴姆侯赛尼微孔滤膜介导的控制胚状体大小通过WNT5a和WNT11的差异表达调节胚胎干细胞命运。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 等,2009,106(40):16978-1698331. Y. Xia,G. M.怀特塞斯软光刻。Annu.修订材料Sci. 等,1998,28(1):15332. Y. Y.崔湾G. Chung,D. H. Lee,A. Khademhosseini,J. H. Kim,S. H.李你在凹面微孔阵列中控制大小不等的胚状体的形成。生物材料,2010,31(15):429633. A. Y. Hsiao,et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancancer co-culture spheroids. 生物材料,2009,30(16):3020
下载后可阅读完整内容,剩余1页未读,立即下载
![pdf](https://img-home.csdnimg.cn/images/20210720083512.png)
![pdf](https://img-home.csdnimg.cn/images/20210720083512.png)
![pdf](https://img-home.csdnimg.cn/images/20210720083512.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://csdnimg.cn/download_wenku/file_type_ask_c1.png)
![](https://profile-avatar.csdnimg.cn/default.jpg!1)
cpongm
- 粉丝: 5
- 资源: 2万+
上传资源 快速赚钱
我的内容管理 展开
我的资源 快来上传第一个资源
我的收益
登录查看自己的收益我的积分 登录查看自己的积分
我的C币 登录后查看C币余额
我的收藏
我的下载
下载帮助
![](https://csdnimg.cn/release/wenkucmsfe/public/img/voice.245cc511.png)
最新资源
- C++标准程序库:权威指南
- Java解惑:奇数判断误区与改进方法
- C++编程必读:20种设计模式详解与实战
- LM3S8962微控制器数据手册
- 51单片机C语言实战教程:从入门到精通
- Spring3.0权威指南:JavaEE6实战
- Win32多线程程序设计详解
- Lucene2.9.1开发全攻略:从环境配置到索引创建
- 内存虚拟硬盘技术:提升电脑速度的秘密武器
- Java操作数据库:保存与显示图片到数据库及页面
- ISO14001:2004环境管理体系要求详解
- ShopExV4.8二次开发详解
- 企业形象与产品推广一站式网站建设技术方案揭秘
- Shopex二次开发:触发器与控制器重定向技术详解
- FPGA开发实战指南:创新设计与进阶技巧
- ShopExV4.8二次开发入门:解决升级问题与功能扩展
资源上传下载、课程学习等过程中有任何疑问或建议,欢迎提出宝贵意见哦~我们会及时处理!
点击此处反馈
![](https://img-home.csdnimg.cn/images/20220527035711.png)
![](https://img-home.csdnimg.cn/images/20220527035711.png)
![](https://img-home.csdnimg.cn/images/20220527035111.png)
安全验证
文档复制为VIP权益,开通VIP直接复制
![](https://csdnimg.cn/release/wenkucmsfe/public/img/green-success.6a4acb44.png)