纳米颗粒调控细胞内多药耐药菌的精准治疗

工程15（2022）57研究抗菌剂耐药性-供试品一种用于精确和响应性治疗细胞内多药耐药菌的曲少奇a，黄晓勇a，宋祥斌a，吴一凡a，马晓伟a，沈建中a，b，朱奎a，b，刘伟a中国农业大学兽医学院国家兽药安全评价中心，北京100193b岭南现代农业广东省重点实验室，广州510642阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2021年2021年9月26日修订2021年12月24日接受2022年4月12日在线提供关键词：抗生素细菌介孔二氧化硅磷脂刚性A B S T R A C T针对危及生命的细菌病原体的抗生素治疗失败通常是由抗生素耐药性的快速出现和传播目前缺乏抗生素的发现和开发迫切需要新的策略来对抗多药耐药（MDR）细菌，特别是那些在宿主细胞中存活的细菌。功能性纳米颗粒具有良好的生物相容性和可调的表面修饰性，是一种很有前途的细胞内药物传递系统。受纳米颗粒的刚性增强其细胞摄取的事实的启发，制造了涂覆有细菌响应性磷脂的刚性功能化纳米颗粒以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和致病性蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为模型，在4 h内清除99%的MDR细菌，证明了药物的精确递送和高抗菌效果此外，通过改变表面上的磷脂组成来调节RFN的亚细胞分布，从而调节静电效应并通过使RFN精确靶向溶酶体来重新编程RFN的细胞内行为最后，RFN在伤口愈合和菌血症的动物模型中显示出对MRSA相关感染的高功效。这些发现提供了一种具有响应特性的可控刚性调节递送平台，用于精确地重新编程胞质抗生素的积累，从而为未来针对细胞内细菌病原体的精确抗微生物治疗提供了©2022 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍抗生素耐药性被认为是全球性的重大公共卫生危机[1]。例如，金黄色葡萄球菌（S.金黄色葡萄球菌）-尤其是耐甲氧西林的S.金黄色葡萄球菌（MRSA）-引起挥发性慢性和复发性感染，导致人类和动物的严重疾病和高死亡率[2]。此外，细菌已经进化出多种策略来在抗生素胁迫下生存，例如抗生素耐受性[3，4]。抗生素耐受性可以促进体内抗生素耐药性的最终快速发展[3]。令人担忧的是，由宿主介导的抗生素耐受性是普遍的，并且对于不同种类的经典细胞外细菌而言在很大程度上被低估[5例如，S. 金黄色葡萄球菌可以在巨噬细胞或上皮细胞中持续存在和复制，以耐受高水平的抗生素，这是由于后者的细胞增殖差。细胞内病原体如特洛伊木马加剧了抗生素耐药性危机[8]。此外，发现和发展-*通讯作者。电子邮件地址：zhuk@cau.edu.cn（K. Zhu）。新抗生素的开发已经放缓，几乎停止，因为几乎没有新类别的抗生素被批准，美国食品和药物管理局（FDA）自20世纪80年代末以来[9，10]。因此，迫切需要替代干预策略，通过恢复现有抗生素的疗效来解决胞质细菌感染。纳米颗粒是通过表面改性或调整粒径来积累细胞内药物的有前景且有效的递送系统[11，12]。具有高表面积、良好生物相容性和生物可降解性的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）作为药物递送的载体引起了广泛关注[13];然而，MSNs的机械性能在很大程度上被忽视。同时，由固有刚性纳米颗粒（如MSN）介导的药物的细胞摄取仍不清楚[14]。最近，已经表明纳米颗粒刚性在将药物区室化和浓缩到不同的亚细胞区室中起着至关重要的作用[15]。因此，刚性调节的递送系统代表了靶向宿主细胞中的持久细菌的替代策略。此外，被触发以释放药物的药物递送系统保持https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.12.0212095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engS. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5758通过最小化选择性压力和提高药物功效来改善感染治疗的前景可观[16]。例如，通过识别药物释放的内源性刺激，使用纳米凝胶、自组装纳米颗粒和仿生材料已经取得了很大进展[17因此，精确治疗和刚性调节的细胞摄取的组合将揭示未来可调抗生素递送平台的设计，以对抗多药耐药（MDR）细菌病原体。在此，我们设计了容易且生物相容的磷脂涂覆的二氧化硅纳米颗粒，以促进刚性调节的细胞摄取和包封的抗菌剂的亚细胞递送。MSN充当这些刚性功能化纳米颗粒（RFN）递送系统的骨架MSN被磷脂覆盖以形成响应性外膜，并且所得RFN进一步负载抗生素（图1）。RFN可以促进刚性介导的内吞作用和抗生素的按需释放，以精确杀死感兴趣的细菌病原体此外，抗生素的亚细胞再分布可以通过调节RFN的磷脂组成来实现，以增强抗菌功效。我们的研究结果表明，RFN可以很容易地配备精确识别，刚性增强的内吞作用和亚细胞区室化的能力;因此，它们提供了一个有前途的纳米平台，针对细胞内细菌感染。2. 材料和方法2.1. 材料原硅酸四乙酯（TEOS）和三乙醇胺（TEA）从Aladdin（中国）获得磷脂酶A2（PLA2，P9279）和磷脂酶C（PLC，P6621）获自Sigma-Aldrich（USA）。二硬脂酰磷脂酰甘油（PG）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（PC）和胆固醇购自AVT Pharmaceutical Technology Co.，公司（中国）。 荧光亲脂染料3，30-双十八烷基氧碳菁高氯酸盐（Dio）和1，10-双十八烷基-3，3，30，30-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐（Dil）购自Beyotime（中国）.利福平（RIF）购自中国兽医药品监察所（中国）。使用Milli-QPlus水过滤系统（USA）生产去离子水。2.2. 刚性功能化纳米颗粒将PG、PC和胆固醇溶解在氯仿中并以8：2：1的质量比混合。在室温下过夜蒸发含有总共1 mg磷脂的溶液至干。然后，将所得膜与5mg MSN 水合并挤出使用具有200 nm 孔径的两个聚碳酸酯膜（Whatman，USA）进行挤出，并重复22次通过在Microcon- 30 kDa离心过滤装置（EMD Millipore，USA）中以4000g离心15 min纯化RFN。使用相同方法制备Dio和Dil标记的RFN。2.3. 载药量通过润湿浸渍法将RIF加载到MSN中[19]。简而言之，将RIF以5mg·mL-1的浓度溶解于甲醇中，并与浓度为10mg·mL-1的MSN孵育30 min。 通过在4 °C下以10 000 g离心另外15分钟获得负载RIF的MSN。收集上清液以使用以下方法测试未负载的RIF的浓度：Fig. 1.用于精确治疗的通过内吞作用靶向溶酶体中的细菌的RFN的示意图。(a)功能性纳米颗粒的刚性用于增强其细胞摄取以进行精确治疗。将抗生素包封在用磷脂包被的MSN内，随后应用于增强胞质递送，从而提高对胞质细菌的效率。(b)具有特异性识别的磷脂酶可降解RFN的示意图。将酶敏感性磷脂掺入RFN中允许抗生素响应于MDR细菌分泌的磷脂酶而在感染部位快速释放各种磷脂酶的作用位点。（c）随后通过内吞途径内化RFN，这导致细胞溶质细菌的根除PLA 1和PLA 2：磷脂酶A1和A2; PLC和PLD：磷脂酶C和D。S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5759×分光光度法负载有RIF而没有磷脂涂层的MSN表示为NP。2.4. 体外药物释放将含有500μ g RIF的NP和RFN在37℃下在 1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育然后将颗粒在Microcon-10 kDa离心过滤器单元（EMD Millipore）中通过离心（4000 g，4 ℃ 15 min）离心。为了研究PLC触发的药物释放，将终浓度为1单位μ mL-1的PLC与每个样品一起孵育。三环癸烷-9-基-黄原酸酯（D 609;终浓度为11mol·L-1）是一种特异性PLC抑制剂，用于抑制PLC酶活性。通过用多功能酶标仪（Infinite M公司，Tecan，瑞士）在474 nm处测量上清液的吸光度来定量释放的RIF的将纳米颗粒在每个时间点（0.5、1、2、4、8、12、16和24小时）保持在培养箱中用于药物释放。2.5. 杀灭动力学蜡状芽孢杆菌（B.蜡状芽孢杆菌）MHI 241在脑心浸液（BHI;LandBridge Technology ，中国）中在37 ℃下培养过夜，以200r/min-1振荡以达到指数生长期。将微生物溶液的浓度调节至初始McFarland 0.5 溶 液 。 然 后 将 溶 液 进 一 步 稀 释 10 倍 。 用 RIF（1.25μg·mL-1）、NP（40 μg·mL-1）或RFN（160 μg·mL-1）以相当于10倍最小抑菌浓度（MIC）的浓度对细菌种群进行攻击。在37 °C下振荡（200 r/min-1）孵育后，在预定时间点（0、2、4、8和24 h）从每个孔中取出细菌样品，进行一系列10倍稀释。将稀释的细菌悬浮液（100 μ L）涂布到胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂平板（TSA; LandBridge Technology，中国）上，并在37 ℃下孵育16-20 小 时 。 计 数 菌 落 并 计 算 每 毫 升 的 菌 落 形 成 单 位 （ CFU ）（CFU/mL-1）。2.6. 细胞和细胞培养将人肝细胞癌（HepG 2）、小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）和肺癌细胞（A549）在37 ℃、5%CO2的潮湿气氛中保持在含有10%热灭活胎牛血清（FBS;Invitrogen，USA）和1%（w/v）青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，USA）的改良培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM ）; Gibco，USA ）中。2.7. 细胞间分布Dil标记的RFN的分布通过接种来观察在24孔板中的14 mm圆形盖玻片上的5 × 105个细胞，生长至70%-孵育后，将细胞用PBS洗涤三次以除去任何未被吸收的颗粒。将细胞在4%多聚甲醛中固定10分钟，用PBS洗涤5分钟，并用4，0，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和肌动蛋白绿488试剂（高亲和力F-肌动蛋白探针）染色。将盖玻片固定在具有抗淬灭剂的载玻片上，干燥，并保持在黑暗中，直到用Leica TCS SP 8共聚焦激光扫描显微镜（CLSM; Wetzlar，Germany）检查用RFN（50μg·mL-1）处理RAW 264.7细胞，荧光标记B. 蜡状体（复数）感染(MOI)= 40），并在37°C、5%CO2中孵育2h。孵育后，将细胞用PBS（pH 7.4）洗涤三次，去除任何未被吸收的颗粒和细菌。细胞用LysoTracker Deep Red（50nmol/L，Invitrogen）染色。将样品保持在黑暗中，直到通过CLSM检查2.8. PG调节的细胞摄取制备具有不同磷脂组分（PG百分比：0、20%、40%、60%、80%和100%）的RFN以调节细胞摄取。将颗粒处理的RAW 264.7细胞在37 °C、5% CO2中孵育1小时。孵育后，将细胞用PBS洗涤三次以除去任何未被吸收的颗粒。将细胞在4%多聚甲醛中固定10分钟，然后用PBS洗涤三次。细胞用DAPI（Beyotime）和Actin Green 488试剂（Life Technologies，USA）染色并通过CLSM观察。2.9. 细胞摄取将RAW264.7细胞用RFN（50 μg·mL-1）和荧光标记的B.蜡状芽孢杆菌（MOI = 40），然后在37 °C、5%CO2中分别孵育0.5和1h。孵育后免疫荧光法检测细胞内早期和晚期内体。一抗包括兔抗Rab7和小鼠抗EEA1抗体（Abcam，UK），二抗为山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体（Beyotime）。制备样品并在黑暗中保存，直至通过CLSM检查。2.10. 体外抗菌试验用B.蜡状芽孢杆菌用pHrodo Red（Life Technologies）在37 °C下以MOI为40的MIC，并用10倍于RIF、NP或RFN的MIC在37 °C，5%CO2，4h。用100μg·mL-1庆大霉素处理细胞并用PBS（pH 7.4）洗涤3次后，室温下用4%多聚甲醛固定细胞10 min，用溶于PBS（pH 7.4）的0.1%Triton X-100透化10 min。用B.蜡样芽胞杆菌以40的MOI，然后用10倍MIC的RIF、NP或RFN处理，4小时用庆大霉素（100μg·mL-1）杀灭细胞外细菌。用PBS洗涤三次后，用1%Triton X-100裂解细胞2分钟。将稀释的细胞裂解物（100 μL）涂布到TSA平板上，并在37 ℃下孵育16-20小时。计数菌落，并计算每毫升CFU。2.11. 道德声明所有动物程序均按照中华人民共和国国务院批准的实验动物事务管理指南（发布日期：1988年11月14日方案和细节由中国农业大学机构动物管理和使用委员会（IACUC）批准（批准号AW 50301202-2将雄性Wistar大鼠（5周龄）和雌性BALB/c小鼠（18-20g）圈养在受控的12h光照/12h黑暗循环中，并可自由获取无菌食物和水。环境保持在规定的无病原体条件下，恒温（（23 ± 2）°C）和湿度（60%±5%）。S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5760××2.12. 大鼠皮肤伤口感染模型为了评价RFN对MRSA T144临床分离株的治疗效果通过腹膜内（i.p. ））水合氯醛（0.5mL，10% ，w/w），并在手术前用酒精（75%，v/v）擦拭消毒。每只老鼠背上的毛小心地移除，并产生直径为1cm的全层伤口。用悬浮在50 μL PBS（pH 7.4）中的MRSA T144（每个伤口1 × 10 - 8 CFU）感染大鼠。将所有动物分为四组：PBS（ pH 7.4 ） 、 万 古 霉 素 （ Van; 5 mg/kg 体 重 ） 、 NP （ 相 当 于 2mg/kgRIF）和RFN（相当于2 mg/kgRIF）。在治疗后的不同时间点（0、3、6、9和13 d）测试伤口的大小和细菌负荷。收集伤口组织并储存在-20 °C下，直至将其在ImL中均质化。无菌PBS。对于CFU分析，将获得的匀浆在S.金黄色葡萄球菌显色琼脂培养基（CHROMagar，France）中，并在37 °C下孵育16-20小时。此外，记录所有动物的体重和完全愈合时间。在第3天从大鼠收集血清，并储存在肿瘤坏死因子-a（TNF-a）和白细胞介素1b（IL-1b），酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Beyotime）根据制造商的说明 进 行 。 在 第 13 天 ， 切 除 伤 口 并 在 4% 多 聚 甲 醛 固 定 溶 液（Beyotime）中固定。然后将所有组织包埋在石蜡中，并制备4μ m切片用于传统的苏木精和伊红（HE）和Masson染色。2.13. 小鼠菌血症模型将雌性BALB/c小鼠随机分成四组：PBS（pH 7.4）、Van（5mg/kg体重）、NP（相当于10 mg/kg体重）、NPs（相当于10 mg2mg·kg-1RIF）和RFN（相当于2 mg·kg-1 RIF）。通过尾静脉静脉内施用悬浮在100 μ L PBS中的MRSA T144（7.5 × 10 - 7 CFU）。在感染后1小时通过静脉内注射向适当的小鼠施用治疗。对小鼠进行了两天的监测。一旦小鼠死亡，立即收集其心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏并储存在-20 °C下直至分析。48 h后，通过颈椎脱臼法对存活小鼠实施安乐死，以收集不同器官。在1 mL无菌PBS中制备器官匀浆，并连续稀释，在S. aureus显色琼脂培养基中，并在37 °C下孵育16-20小时。测定不同器官中的细菌载量（MRSA T144的Log 10 CFU）。两天后计算各组的存活率2.14. 统计使用软件包GraphPad Prism 7.0确定统计学显著性。 所有数据均表示为平均值±标准差（SD）。使用非配对t检验或单因素方差分析（ANOVA）和其他特殊分析进行P值的所有计算3. 结果3.1. RFN在对抗细菌病原体方面表现出高选择性和功效以生物可降解磷脂为帽的RFN通过MSNs的功能化表面修饰来制造，以主动识别磷脂酶阳性细菌，从而以按需方式释放抗生素以精确杀死靶向细菌（图 2（a））。基于扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）分析，通过使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）作为致孔剂以诱导中孔结构[20]，获得具有高分散性和均匀球形形态的MSN（图1A和1B）。2（b）和（c））。通过透射电子显微镜（TEM;图1B）进一步观察具有小孔径的MSN。 2（b）），并通过氮（N2）吸附-解吸技术（3.8nm，图2（b））定量。 2（c）和（d）。MSNs的密度泛函理论（DFT）表面积和孔体积分别为490.2m2·g-1和0.92cm3·g-1（图2同时，优化CTAB的浓度以获得具有合适尺寸（130 nm）和最高RIF负载容量（9.7% ± 0.9%;图1B）的MSNs。附录A中的S1）。此外，我们通过液相色谱-串联质谱法分析了RFN中的CTAB残留物（67.1 ng·mg-1）（图11）。附录A中的S2），适用于后续研究。将磷脂包覆在MSN的表面，对于非共价键，我们使用水合/挤出方法[18]。用PG和PC包被MSNs以形成磷脂酶反应性RFN用于控制释放。PG和PC以8：2的质量比混合，以防止血液循环过程中的泄漏并保持我们观察到一个明显的核壳结构的基础上TEM分析（图。 2（b）和图。附录A中的S3），表明磷脂成功易位至MSN表面。此外，在磷脂双层包被过程后，MSN的粒度增加，表明磷脂包封（附录A中的图S4）。在474 nm处观察到RIF成功加载到RFN中（图1B）。 2（f）），并通过使用傅里叶变换红外光谱（图2）的特征提取证实。 附录A中的S5）。 我们进一步观察到在-80°C下处理长达30天后RFN的稳定流体动力学直径和表面zeta电位（图1A）。 附录A中的S6）。我们假设，由细菌衍生的磷脂酶催化的磷脂水解可能导致RFN中的孔结构暴露，从而释放负载的抗生素。为了评估使用磷脂酶响应性RFN用于抗菌活性的可行性，我们首先使用来自B. cereus和S. 金黄色葡萄球菌进行体外释放试验。与孵育24小时后培养基中仅释放20%的RIF相比，在PLC存在下，超过60%的RIF从RFN中释放（图1）。2（g））。在存在特异性PLC抑制剂的情况下，PLC响应性释放减少（1lmol·mL-1，D609，图2（g））。RIF从RFN的持续释放通过延长释放持续时间来增强治疗功效。不同的药物释放动力学还表明，RFN孔结构被磷脂涂层覆盖，这与TEM观察到的核-壳结构一致（图1）。 2（b））。此外，我们观察到RFN根除了99.9%的B。蜡状芽孢杆菌孵育8小时后（图 2（g）和图。附录A中的S7），并对MRSA表现出稳健的抗菌活性（图 附录A中的S8）。磷脂酶破坏了涂层，这加速了RIF从RFN中的释放总之，这些结果表明RFN对磷脂酶阳性细菌具有高度响应性，可以作为一个有效的平台以增加抗生素的选择性3.2. RFN通过调节磷脂成分靶向溶酶体进入细胞能力差的抗生素对胞质细菌的功效非常有限[21]。哺乳动物细胞内抗生素的分布在消除胞质细菌中起着关键作用[5]。接下来，我们探索了细胞内RFN的细胞内途径和靶点。纳米颗粒的化学组成和表面性质对其摄取、细胞内分布和治疗功效至关重要[22，23]。所以我们S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5761图二、RFN以高选择性有效地杀死分泌磷脂酶的细菌（a）RFN针对MDR细菌的高选择性的示意图(b)用磷脂酶敏感性磷脂包被的MSN和RFN的代表性图像。箭头表示磷脂涂层。比例尺：100 nm。(c)使用DLS测定用磷脂包被后RFN尺寸的增加（d）氮（f）RIF在不同条件下的吸收光谱，最大吸收波长为474 nm。（g）在PBS中通过PLC引发RIF从RFN释放24小时。PLC特异性抑制剂D609可抑制RIF的释放（h）B. 用10倍MIC的RIF、NP和RFN处理对数生长期的蜡状芽孢杆菌。所有数据均表示为平均值± SD。PDI：多分散性; dV/dlog（D）：孔体积对孔径;p/p0=测试压力/饱和压力。解密RFN上的磷脂组成及其在RAW 264.7细胞中的细胞内分布。RFN表面的PG/PC含量显著影响RFN的细胞内分布（附录A中含80%PC的RFN在细胞内广泛分布，表明涂层中的高PC含量导致纳米颗粒从溶酶体逃逸到胞质溶胶中。与此相反，当RFN含有20%PC时，RFN位于细胞内区域，表明RFN可能被捕获在溶酶体中。值得注意的是，在肺癌细胞A549中观察到了类似的趋势（附录A中的图S10）。此外，RFN的溶酶体积累的增加与PG/PC含量呈剂量依赖性（图3（b））。带正电荷的磷脂和人源磷脂减少了RFN的溶酶体蓄积（附录A中的图S11），这与先前报告的正电荷触发内体膜不稳定的研究一致[24]。然而，目前尚不清楚磷脂的相变温度是否参与其分布调节[25]。总之，这些发现表明，RFN的亚细胞分布可以通过改变它们的磷脂组分，并且高PG/PC比率促进溶酶体靶向过程。考虑到许多细胞内细菌最终被困在溶酶体中[6]，促进抗生素在溶酶体中的积累以根除胞质细菌病原体是至关重要的。我们发现RFN与细菌和溶酶体共定位，这表明RFN和细菌定位于相同的亚细胞区室（图3（c））。因此，来源于细菌的磷脂酶有效地水解RFN上的涂层，以激活抗生素的释放并精确地靶向胞质细菌[25，26]。此外，我们观察到RFN（绿色）与B的广泛结合。蜡状芽孢杆菌（蓝色）（图3（c）），基于PC和细胞壁中主要磷壁酸之间的静电相互作用。cereus [27].具有高PG/PC比的RFN不仅可以靶向溶酶体，而且可以将细菌捕获在亚细胞区室中。因此，我们进一步确定了RFN的细胞摄取途径。观察B.蜡样芽胞杆菌感染RAW 264.7细胞;蜡样细胞用内体标记物染色。RFN和B. 蜡状核与早期核内体和晚期核内体共存S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5762图3.第三章。通过改变PG/PC含量调节RFN的细胞摄取（a）磷脂包被中PG/PC比率的增加介导RFN在RAW 264.7细胞中的点状分布提供了RAW 264.7细胞与由各种PG组合物（80%和20%）组成的RFN孵育1小时的代表性共聚焦图像细胞用DAPI（蓝色）和肌动蛋白绿488（绿色）染色。比例尺：10μ m。(b)在用具有增加的PG/PC含量的RFN处理的RAW 264.7细胞中观察到每个细胞的点的增加。通过非参数单因素方差分析确定统计学显著性。(c)用RFN（50 μg·mL-1）和B.蜡状芽孢杆菌MHI 241（MOI = 40）培养2h。溶酶体（红色）与细菌（蓝色）和RFN（绿色）共定位。比例尺：8μ m。（d，e）RAW 264.7细胞用（d）RFN（50 μg·mL-1）和（e）B. 蜡状芽孢杆菌MHI 241（MOI = 40）处理0.5和1h。细胞用针对EEA1（早期内体）和Rab7（晚期内体）的抗体染色内体）。比例尺：10μ m。(f)RFN通过靶向亚细胞区室来对抗胞质细菌。在处理1小时后（图 3（d）和（e））;这一发现表明RFN和细菌可以通过内吞作用进入细胞，这与大多数聚合物纳米颗粒的内化一致[28]。在S.金黄色葡萄球菌模型，表明RFN的有效可行性和多功能性（图1）。附录A中的S12）。总的来说，这些结果表明，我们成功地制造了一种可控的递送平台，其具有抗生素再分布以靶向胞质细菌病原体（图1B）。3（f））。3.3. RFN在体外宿主细胞内细菌病原体的不完全清除可以使这些感染的细胞充当特洛伊木马，复发和感染的复发[29]。 考虑到RFN将抗生素递送到宿主细胞中的有吸引力的靶向能力，我们进一步研究了RFN对胞质B的抗菌效率。蜡样S.金黄色。我们的结果表明，RFNs有效地降低了细胞质B的负荷。在感染的RAW 264.7细胞中的蜡状芽孢杆菌（图 4（a）和图附录A中的S13）。B的个数。在存在RFN的情况下，蜡状芽孢杆菌中的细胞比仅用RIF处理4小时的细胞中的细胞低约100倍（图1B）。4（b））。 RFN清除胞质细菌的强大能力也在S. 金黄色葡萄球菌模型（Fig. 附录A中的S14），这可归因于精确的靶向递送。以这种方式，RFN证明了它们以亚细胞靶向方式对抗胞质细菌感染的潜力S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5763×考虑到RFN消除胞质细菌的吸引力，我们测试了B.用RFN治疗的蜡状体。我们观察到膜渗透性的剂量依赖性增加（图1）。 S15（a）附录A）和细胞大分子如β-半乳糖苷酶（MW= 130 kDa，图15）的释放。 S15（b）（附录A））和三磷酸腺苷（ATP;附录A中图S15（c））。 用RFN治疗的蜡状体。 进一步的膜去极化分析显示B.在RFN处理后，以剂量依赖性方式对蜡样细胞膜电位进行了测定（图11）。 4（c））。膜电位的去极化损害了膜上发生的许多重要生化反应，包括细菌中ATP的产生[6]。因此，我们测定了细胞内ATP的积累正如预期的那样，RFN治疗导致细胞内ATP减少，B.蜡状体（图4（d））。此外，内源性活性氧（ROS）的积累对于细菌清除至关重要[30]。 我们观察到在B. 蜡样随着RFN浓度的增加（图4（e））。总之，这些结果表明，膜损伤和氧化损伤是必不可少的RFN抗菌活性。3.4. RFN保护动物免受MRSA感染为了确定RFN在体内抗细菌感染的能力，我们使用MRSA T144细胞在两种体内模型中研究了它们的治疗潜力（图5（a））。细胞活力（图在药效学评价前，使用RFN进行了溶血率（附录A中的图S16）和溶血率（附录A中的图S17）。RFN显示出良好的生物相容性，即使在浓度为500μg·mL-1，这是体内无法达到的剂量。大鼠皮肤用MRSA T144感染伤口（每个伤口1 × 10 -8CFU），并根据我们以前报道的方法在感染后1小时在受伤部位进行治疗[22，31]。我们发现用RFN（相当于图四、RFN在体外有效地杀死胞质MDR细菌。（a）感染B. 蜡状芽孢杆菌（红色）在RIF、NP或RFN存在下孵育4小时。细胞核（蓝色）和肌动蛋白（绿色）分别用DAPI和肌动蛋白绿488染色 比例尺：10 μm。（b）在对应于10倍MIC的浓度下不同处理4小时后RAW 264.7细胞中胞质细菌的定量（c）B. 用不同浓度（0、16、32、64、128和256 μg·mL-1）的RFN处理蜡样芽胞杆菌，并用DiSC 3（5）（激发/发射波长为622 nm/670 nm）染色。（d）B. 蜡状芽孢杆菌与RFN一起孵育，使用发光ATP测试。（e）B中ROS的积累。蜡样芽胞杆菌是通过测量20，70-二氯荧光素二乙酸酯的荧光强度来确定的（激发/发射波长为488 nm/525 nm）。所有数据均表示为平均值± SD。统计分析采用非参数单因素方差分析.RLU：相对光单位。S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5764×图五.载抗生素RFN在两种动物感染模型中根除MRSA相关感染。(a)大鼠皮肤伤口感染模型和小鼠菌血症模型的实验方案示意图。(b)用Van（5mg·kg-1）、NP或RFN（相当于2mg·kg-1 RIF）治疗后MRSA T144感染伤口（每个伤口1 × 10 -8比例尺：1 cm。（c）在第3、6、9和10天的不同处理后，记录伤口愈合的分数13. （d）大鼠皮肤伤口感染模型中的细菌负荷在感染后13天，减少细菌载量被发现在感染的伤口与RFN治疗(e)受伤皮肤的HE和Masson染色的代表性显微照片箭头表示表皮。比例尺：100μ m。（f）在用RFN处理的伤口中增加的上皮间隙通过非参数单因素方差分析进行统计学分析（g）静脉内感染MRSA T144（7.5 ×107CFU）后，用Van（5 mg/kg）、NP或RFN（相当于2 mg/kgRIF）处理的菌血症模型中小鼠的存活曲线通过对数秩（Mantel-Cox）检验进行统计分析。（h）从两个肾脏回收的MRSA T144的定量用RFNs处理2 d后，这些肾脏中的细菌负荷显著降低通过非参数单因素方差分析进行统计学分析至2 mg/kgRIF）在13例患者中几乎100%愈合（图1和2）。 5（b）和（c）），而凡（5 mg·kg-1）治疗只有75%的伤口愈合。Van已被用作MRSA感染的金标准治疗数十年[32]。抗体-利福洛糖缀合物对MRSA感染比Van更有效，这可以归因于Van对细胞内细菌的不良功效[6]。RFN促进了细胞内抗生素的积累，从而消除更多的MRSA并加速伤口愈合（图5（d））。这些结果表明RFN在对抗MRSA感染和促进伤口愈合方面是有效的。为了进一步评估RFN在伤口愈合中的作用，在第13天使用HE和Masson三色染色检查伤口的组织学。RFNs显著增加上皮间隙厚度，促进伤口再上皮化S. Qu，X. Huang，X. Song等人工程15（2022）5765×（图2）5（e）和（f））。此外，RFN治疗中通过促进细胞外基质重组而增加胶原沉积，从而加速上皮再生和组织重塑（图5（e））。这些结果与促进伤口愈合过程中急性伤口的生理恢复和再生一致[33]。RFN治疗后，伤口闭合时间显著缩短3天，与PBS治疗相同，第13天体重显著增加，这进一步证明RFN具有更好的伤口愈合能力和效率（附录A中图S18）。与模型组相比，局部RFN治疗后炎症因子也显著降低了50%（附录A中的图S19），这与RFN的抗菌效率密切相关所有这些结果表明RFN具有生物相容性，并且对于治疗急性伤口感染非常有效。在菌血症小鼠模型中进一步评估RFN针对细菌感染的保护能力。通过尾静脉向小鼠注射MRSA T144细胞（7.5 × 10 -7CFU）。感染后1小时，与PBS组（存活率为40.0%）相比，用RFN（相当于2 mg·kg-1RIF）处理的小鼠显示出显著增加的存活率（90.0%）（图5（g））。此外，静脉内施用RFN两天后，不同器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中的细菌负荷显著降低（附录A中的图5（h）和图S20）。小鼠的器官组织病理学进一步证实了RFN的抗菌活性。接受RFN治疗的小鼠没有显著的病理变化，例如非创伤性脾出血或肾脏病变（附录A中的图S21）。这些结果表明RFN作为针对MDR细菌感染的有效抗生素递送平台的潜力。4. 讨论由于侵入性细菌在宿主细胞中的高度隐蔽性和抗生素耐受性，因此难以有效消除此类细菌[34]。研究表明，亚细胞结构在细菌病原体在细胞中的侵袭和存活中起着重要作用[35，36]。因此，开发高效的载体将抗菌药物精确地递送到亚细胞区室是至关重要的.具有特定表面改性和增加的刚性的纳米颗粒有望实现增强的细胞摄取和精确的亚细胞靶向[37调整纳米颗粒的磷脂组成是调节其细胞内化的有效方法[41]。在这项工作中，我们设计了一个刚性的抗生素输送系统，通过加载RIF到MSN和涂层的颗粒与细菌响应的磷脂，以打击胞质细菌感染。这些RFN具有脂质纳米材料的特征，其易于调节和修饰，以及由介孔二氧化硅核心提供的刚性，以通过内吞作用增强细胞摄取。先前的研究表明，纳米颗粒刚性是控制细胞摄取的关键参数[14]。通过增加RFN的刚性，避免了内吞过程中形态学变化引起的细胞摄取减少[15]。通过调节表面上磷脂的比例来调节RFN的静电效应允许有效载荷选择性地定位于其靶向亚细胞区室。RFN的效率和安全性通过磷脂酶控制的药物在溶酶体中释放而最大化。我们的策略成功地规避了通过结合同时具有增加的刚性、亚细胞靶向和环境响应性的系统，来开发针对胞质细菌感染的抗生素。因此，我们初步得出结论，RFN的抗菌过程应该以逐步的方式发生，如下：①靶向细菌病原体的精确识别;②刚性增强的内吞速率;③可重新编程的药物分布;以及胞质内的细菌杀伤。5. 结论制造安全、有效和可调的纳米平台用于精确的细胞溶质药物递送是一个严峻的挑战。在这项研究中，我们表明RFN是一种有效的递送平台，其通过主动靶向亚细胞区室并触发抗生素的按需释放来在体外和体内对抗MDR细菌相关感染。改变RFN的磷脂组成增强了它们的溶酶体靶向，从而通过增加抗生素积累来增强它们的效率。此外，细菌来源的磷脂酶可以水解RFN的表面，以减少抗生素的副作用和选择压力。因此，RFN提供了一个有前途的战略，打击胞质细菌，在医疗保健中的一个关键问题。致谢本工作得到了岭南现代农业工程重点实验室（NT2021006）和兽医生物技术基金国家重点实验室（SKLVBF 202102）的支持。遵守道德操守准则曲少奇、黄晓勇、宋祥斌、吴一凡、马晓伟、沈建中和朱奎声明，他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.12.021上找到。引用[1] 库普费施克反抗军战士。Science2016;352（6287）：758-61.[2] Turner NA ，Sharma-Kuinkel BK，Maskarinec SA，Eichenberger EM ，ShahPP，Carugati M，et al. 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