软件X 12：一种用于离体心肌细胞缩短分析的工具

软件X 12（2020）100547原始软件出版物ContHeart：用于监测离体心肌细胞缩短的软件作者：Daniel Leal Fagundes，Jair T.古拉特·马格德堡生理科学系，生物研究所，巴西利亚大学-ar t i cl e i nf o文章历史记录：2019年12月5日收到收到修订版2020年5月15日接受2020年关键词：心肌细胞缩短边缘检测Canny方法a b st ra ctContHeart是一款软件，旨在使用Canny的边缘检测方法分析记录视频中的心肌细胞收缩动力学它是一种工具，允许研究人员（用户）对通常在其日常工作中捕获的视频进行后期分析，而无需特殊的捕获设备。该软件具有用户友好的图形界面，用户可以在其中应用滤波器和修改参数，以优化边缘检测和缩短测量。因此，该软件可以快速生成关于细胞尺寸随时间变化的可靠数据，研究人员可以对其进行解释。我们相信，研究人员将在这里找到一个强大的工具，以提高他们的基础心血管研究的范围，使他们能够在他们的工作中包括心肌细胞缩短分析。这可能会增加该领域内的知识范围，因为可以分析不同病理生理条件对心肌细胞收缩的影响。©2020作者由爱思唯尔公司出版这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）中找到。代码元数据（必需）当前代码版本1.0.0此代码版本使用的代码/存储库的永久链接https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX_2019_373Code Ocean compute capsule合法代码许可证Apache-2.0使用的代码版本控制系统无使用Visual Basic.NET的软件代码语言、工具和服务编译要求，操作环境依赖Microsoft visual studio，Emgu CV 3.4.3.3016，.NET Framework 4.6.1如果可用，链接到开发人员文档/手册问题支持电子邮件jair. unb.br软件元数据（可选）当前软件版本1.0.0指向此版本可合法软件许可证Apache-2.0计算平台/操作系统Microsoft Windows安装要求依赖关系Emgu CV 3.4.3.3016，.NET Framework 4.6.1如果可用，请链接到用户手册-如果正式出版，请在参考列表问题支持电子邮件jair. unb.br*通讯作者。电子邮件地址：dlealfagundes@gmail.com，160026041@aluno.unb.br（D.L.）Fagundes），jair. unb.br（J.T.Goulart）。https://doi.org/10.1016/j.softx.2020.1005471. 动机和意义根据世界卫生组织的数据，心血管疾病（CD）每年导致约1790万人死亡，占世界所有死亡人数的1.31%的2352-7110/©2020作者。 由Elsevier B.V.出版。这是一篇开放获取的文章，使用CC BY许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页：www.elsevier.com/locate/softx2D.L. Fagundes和J.T.Goulart/SoftwareX 12（2020）100547与CD相关高死亡率和高成本使其成为重要的研究领域。离体心肌细胞的收缩性评价是心血管研究的重要工具，因为它被广泛用作体外模型[2，3]。研究离体心肌细胞的收缩功能为心脏兴奋-收缩偶联提供了可以应用几种方法来监测心肌细胞收缩（或缩短）。其中最简单的是从视频文件的边缘检测。通过这种方法，研究人员应用一种算法来检测在录制视频的时间过程中由心肌细胞所做的运动。计算检测方法的当前发展允许监测具有不同几何形状的细胞，而不管细胞形状和收缩轴如何，不仅允许心室肌细胞中的缩短测量，其显示出良好确定的收缩轴，而且允许不规则形状的细胞，例如新生儿和培养的心脏细胞[5尽管存在心肌细胞缩短的几种计算解决方案，但其中许多方案的实施需要研究人员-用户具有良好的编程知识。许多解决方案只描述了所使用的算法，这必须在编程语言中实现，使得生物医学研究人员难以在他们的研究中应用这些解决方案。一些软件，如Video Length Sarcomere（Aurora Scientific，ON，Canada），具有用户友好的界面;然而，它们使用肌节-其他商业软件，如IonOptix系统（IonOptix LLC，Westwood，MA，US），提供肌节和细胞边缘检测模块。因此，使用解决方案所需的技术知识以及购买商业软件和视频采集设备所涉及的成本使资金很少的实验室无法进行这种有价值的分析。我们的目标是开发一种简单易用的解决方案，具有用户友好的图形界面，允许没有编程知识的生物医学研究人员测量分离的心肌细胞的ContHeart能够在常规显微镜下捕获的记录视频中进行缩短测量，即使在低分辨率和没有理想细胞定位的视频中也是如此2. 软件描述ContHeart是一个用VB.net语言编写的软件，允许打开各种格式的视频文件（*.mp4，*.avi，*.wmv）。然后通过Canny边缘检测方法[9]分析包含收缩的分离心肌细胞的输入视频，以检测细胞并测量生物医学研究的感兴趣参数。此外，软件还生成一个包含所有结果的输出文本文件（*.txt）。Goulart等人（2017）已经证明，基于Canny方法的边缘检测算法一旦软件运行，用户将能够打开显示第一帧的视频文件该帧将用于定义用于处理视频和检测细胞边缘的所有参数但是，如果第一帧不可靠，用户可以使用轨迹条选择另一帧。可以选择用于分析和检测细胞的参数是：- 细胞旋转：用户可以旋转框架，以实现更好的细胞对齐。- Canny阈值保持：用户设置Canny算法使用的阈值- 灰度：可靠的边缘检测需要将视频中的每一帧转换为灰度。用户设置灰度转换的参数。- 图像处理：它允许用户对帧应用不同的过滤器。可用的过滤器是模糊，中值和高斯。模糊过滤器平滑图像的边缘，使其看起来模糊，只允许检测具有非常尖锐边缘的对象，减少外部对象和细胞内部边缘引起的噪声（图10）。①的人。中值滤波器分析一组像素的颜色，然后将该组中每个像素的颜色定义为相当于整个集合的中值的颜色，平滑图像并去除最后，高斯滤波器改变帧，使得颜色变化遵循高斯分布。- 系数：它是一个重要的变量，范围从0到100。它是一个百分比值，指示检测帧中矩形的阈值（更多细节见下文）。当用户已经设置了最合适的小区检测参数时，缩短分析开始。由于心肌细胞近似为矩形，因此该软件试图从先前描绘的边缘检测矩形角度（图1）。2）的情况。然而，低分辨率的视频不允许在每帧中检测所有细胞边缘。这使得单元检测作为一个连续的直角困难。为了解决这个问题，ContHeart检测帧内的多个直角，如图所示。 2A，并将它们连接在一起，形成一个更大的矩形，联合矩形（UR），这将代表整个细胞（图。2B）。软件仅显示UR，以避免在软件例程期间将用户与小矩形检测混淆。软件使用Emgu CV库（OpenCV图像处理库的.net库包装器）中的矩形检测算法检测每帧中的所有矩形。用于选择包括在UR形成中的矩形的标准是由用户选择的因子。ContHeart仅考虑形成具有最大矩形周长的最小比率的周长的UR矩形。用户将此最小周长比 定 义 为 因 子 变 量 ， 例 如 ， 如 果 用 户 选 择系 数 为 50 ，ContHeart将只考虑周长至少为最大矩形周长一半的矩形。然后，Factor变量的范围从0到100;它定义用于形成UR的小矩形的大小。因子的默认值为50，但用户应始终测试更合适的值，并注意UR的检测是否与感兴趣的心肌细胞一致。我们还在UR内绘制一个椭圆。椭圆形面积可用于估计长球体，其是心肌细胞的真实面积的适当表示以及矩形或三维表示。然而，如Milan等人（2019）[11]所述，长椭球体表示法针对电磁研究进行了优化。ContHeart应用在第一帧或用户选择的代表性帧中设置的分析参数来分析第一帧和所有后续帧。然后，软件在其操作期间记录一系列输出。输出的结果按在导出的.txt中出现的顺序为：UR的初始X和Y位置、UR高度和宽度、UR区域、UR内绘制的椭圆区域、每帧的时间位置（以毫秒为单位）和帧号。UR和椭圆区域的高度、所有这些数据 可以由研究者-用户用来评估时间D.L. Fagundes和J.T.Goulart/SoftwareX 12（2020）1005473Fig. 1. 最上面的图片显示的是原始图像，最下面的图片显示的是模糊后的图像。即使这个小模糊适用于底部的图像平滑的心肌细胞的边缘，使其更准确地检测到的Canny方法。图二. 心肌细胞的边缘检测。A. ContHeart使用Canny方法检测图像中的边缘;然后，使用边缘绘制矩形。B.小矩形（蓝色）连接起来形成一个大的，应该勾勒出细胞（红色）。 (For为了解释该附图图例中对颜色的引用，读者可以理解，参考这篇文章的网络版本心肌细胞收缩活动的过程。通过收集的数据，用户能够绘制显示细胞缩短的图表，其可用于估计心血管研究的重要参数，例如，收缩幅度和弛豫时间过程[10]。此外，输出的.txt文件显示一个标题，显示所用视频文件的路径、分析视频的总持续时间（秒）、视频帧计数、执行分析的初始帧、应用于帧的旋转以及所有用户定义的参数，以确保所执行分析的再现性。3. 说明性示例ContHeart允许用户打开显示收缩细胞的视频，并提取心血管研究的重要参数。图3显示ContHeart主窗口。用户应点击“打开文件”（见图1）。3）选择视频被分析。一旦选择了视频，用户将在ContHeart主窗口上看到视频的第一帧（参见图中的“原始帧”空间）。3）。我们建议用户使用标准参数进行初步分析，以了解如何识别细胞。因此，用户应点击“查找轮廓”（见图2）。 3）。然后，检测到的原始帧的边缘将显示在主窗口的右侧（参见图中的“检测到的单元格”）。3）。此外，用户将看到一个蓝色的矩形和一个绿色的椭圆，应该只勾勒出感兴趣的细胞（图4）。用户可以在原始帧上点击并拖动鼠标，以选择要分析的区域（ROI）如果原始帧上有几个其他细胞或噪声， 用户可以测试不同的参数，以增强对视频的分析，从而更好地检测心肌细胞（图1）。 4）.在该说明性示例中，所分析的视频具有两个屏幕上的黑条阻碍了边缘检测（图4A）。然后，我们选择心肌细胞周围的ROI（图中的红色虚线矩形）。4B）提高检测能力。只有这种方法才能更好地检测细胞（图中的蓝色矩形和绿色椭圆）。 4 B）。 如果心肌细胞是倾斜的，用户可能需要使用按钮CCW/CW（见图3中的6）来对齐它。此外，如果第一帧不适合初始细胞检测，用户可以使用轨迹条选择任何其他帧（见图3中的15）。3）。为了进一步改善本例中的细胞检测（图11）。4），我们改变一些参数：- 系数（见图7） 3）改为30;- Canny阈值（见图8）3）和灰度（见图3中的9）不变;4D.L. Fagundes和J.T.Goulart/SoftwareX 12（2020）100547图三. ContHeart主窗口。有关参考，请参见此屏幕上指示基本对象和区域的红色标签（参见文本）。见图4。 这张图片显示了ContHeart主窗口，其中设置了检测心肌细胞的参数。红色虚线矩形表示用于分析的ROI，蓝色矩形和绿色椭圆表示单元格的已识别界限。(For为了解释该附图图例中对颜色的引用，这篇文章的网络版本- 通过勾选图像处理组框中的“模糊”来应用模糊过滤器（参见图10）。 3）和模糊参数宽度和高度（见图11）。 3）设为5;- 由于未应用中值和滤波器，因此其对照未发生变化（见图12和13）。 3）。在用户找到用于检测细胞的合适参数之后，可以保存所选参数以用于其他分析（通过点击图5中的5）。 3）。此时，用户可以单击“获取数据”（参见图3）对视频进行完整的分析点击“获取数据”，用户将观看每帧被检测到高速，而进度条（见图14）。3）表示分析的进展。在分析过程中，线轮廓显示为细胞收缩检测的预览（图1）。4）.用户可以选择哪个参数将显示在预览：宽度，高度，矩形和椭圆形面积（见图16）。3）。然而，如果用户在这一点上执行缩短评估，则将以任意单位生成所有结果，其表示分析帧的像素中的单元的缩短。用户必须执行校准步骤以获得长度单位的实际缩短。D.L. Fagundes和J.T.Goulart/SoftwareX 12（2020）1005475图五. ContHeart校准窗口。有关参考，请参见此屏幕上指示基本对象和区域的红色标签（参见文本）。(For对于图中颜色的解释，请读者参考本文的网络版本见图6。ContHeart输出结果的示例。A.显示所选参数和结果的输出.txt文件的初始段。心肌细胞缩短可以从细胞宽度（B）、矩形面积（C）和椭圆形面积（D）变化获得校准步骤需要用于测量长度的参考标准。要继续进行校准，用户必须点击“校准”（参见图3中的3）以打开ContHeart校准窗口（图3）。5）。有两种方法可以打开图像进行校准：1.如果在软件主屏幕上有打开的视频，校准窗口将已经显示相同的帧; 2. 用户可以通过点击“选择图像文件”打开保存的图像此外，用户可以输入适当的字段（见图6）。5）在先前校准中获得的校准值。在这个说明性的例子 中 ， 我 们 使 用 了 一 个 刻 度 标 线 （ Carl Zeiss ， Göttingen ，Germany）作为参考（图5）。校准步骤很简单，用户需要绘制一个线（见图5中的红线），然后插入以nm为单位的实际线长度（见图5中的2）。此后，用户必须点击按钮“校准”（见图3）。 5）。ContHeart将显示真实的线尺寸和校准因子（见图4和图5）。 5，分别）。一旦用户执行了校准，ContHeart将以nm表示所有输出值。此外，还可以通过打开一个新图像并绘制另一条线来测量细胞中的结构，这可能对某些研究有用当用户已经设置了所有参数并实现了正确的细胞检测时，用户应单击ContHeart将分析整个视频，并显示保存窗口。输出的.txt文件（图6A）具有所有6D.L. Fagundes和J.T.Goulart/SoftwareX 12（2020）100547|有关已执行分析的信息，包括视频文件的路径、其总持续时间、帧计数、分析开始的帧、应用于帧的旋转以及所有其他用户定义的参数。输出的结果可用于绘制显示单元宽度变化、矩形面积变化和椭圆形面积变化的图表（图11）。6B-D）。输出的.txt文件以表格结构存储数据，即，它是一个制表符分隔的值文件。任何电子表格软件都支持这种文件格式。因此，所有输出的结果可以很容易地绘制，以表示心肌细胞缩短，但用户必须定义哪种表示最适合他们的应用。例如，在该说明性示例中，宽度的变化（图6 B）示出了比矩形面积变化（图6 B）更少的噪声缩短测量。 6 C），和椭圆面积变化（图。 6 D）。然而，这可能因情况而异。4. 影响在ContHeart中实现的方法对于检测典型收缩的幅度和时间过程以及检测小的非同步收缩（“收缩波”）是有效的收缩波的检测对于自发性心肌细胞活动的研究至关重要，自发性心肌细胞活动是促心律失常状态的预测因子[12然而，该过程通常依赖于通过共聚焦显微镜获得的细胞内钙成像[15，16]，这是一种昂贵且棘手的方法。ContHeart还允许在这种情况下分析视频，允许在不需要细胞内钙成像的情况下量化波，从而可以使用更直接和更便宜的实验设置提取收缩信息。一种可靠的检测自发收缩的方法也可能促进促心血管药物的研究，这对心血管药物的开发和药物心脏毒性的评价是非常重要的。ContHeart还允许分析呈现不平行于心肌细胞主轴的缩短轴的不对称细胞，例如在新生儿细胞、心房心肌细胞和培养细胞中发生的通过常规方法对这些电池的缩短评估是困难的，因为它们没有规则的收缩模式，肌节发育不良，形状不规则。此外，ContHeart是一个用户友好的软件，可以使用没有编程知识的用户。因此，ContHeart允许对基础心血管研究感兴趣的研究人员使用在常规工作中记录的视频来扩大他们的分析范围，而不需要昂贵的设备和软件。5. 结论心肌细胞收缩行为的分析是心血管生理学研究的重要工具。它允许了解心肌细胞收缩如何受到不同疾病，药物或环境条件的影响。ContHeart是一个简单而有用的工具，可以生成有关心肌细胞缩短的相关数据。我们预计，Con-tHeart可能会支持许多研究人员扩展他们的分析领域，而不需要昂贵的软件和设备，或广泛的编程专业知识。CRediT作者贡献声明Daniel Leal Fagundes：方法论，软件，调查，写作-原始草稿。Jair T.概念化，方法论，软件，调查，资源，监督，写作-评论&编辑.竞合利益作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作致谢作者感谢巴西利亚大学（UnB）的科学启动计划（PIBIC）以及DPI-UnB的研究和创新。引用[1]世界卫生组织。2015年世界卫生组织非传染性疾病进展监测。第1版Geneva，CH：WHO Press; 2015.[2]Maltsev VA，Sabbah HN，Tanimura M，Lesch M，Goldstein S，Undrovinas AI.慢性心力衰竭犬心肌细胞动作电位、收缩-舒张模式与细胞内钙瞬变的关系CellMolLifeSci1998;54：597-605.http://dx.doi.org/10.1007/s000180050187.[3]Ren J，Wold LE. 离体心脏机械功能的测定通过计算机视频成像从大鼠和小鼠的心室肌细胞。生物学在线处理2001;3：43-53. http://dx.doi.org/10.1251/bpo22.[4]Delbridge LMD，Roos KP.光学方法评价收缩性未负载的分离心肌细胞的功能。分子细胞心脏病学杂志1997;29：11-25.http://dx.doi.org/10.1006/jmcc.1996.0247网站。[5]Bazan C，Barba DT，Blomgren P，Paolini P.图像处理技术用于评估分离的成人心肌细胞的收缩性。Int J Biomed Imaging2009;2009：1-11. http://dx.doi.org/10.1155/2009/352954网站。[6]Hayakawa T，Kunihiro T，Ando T，Kobayashi S，Matsui E，Yada H，et人诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞的收缩-松弛动力学的基于图像的评价：与细胞外电生理学的相关性和互补性。J Mol Cell Cardiol 2014;77：178-91. http://dx.doi.org/10.1016/j.yjmcc.2014.09.010网站。[7][10] Cheryl M，Cheryl M，Cheryl M，Cheryl M，et al.SarcTrack -一种适用于hiPSC-心肌细胞中肌节功能的高效大规模分析的软件工具。《循环研究》，2019年;124：1172-83。http://dx.doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.118.314505网站。[8]帕斯夸兰 C、对 加尼耶 F、 羽 一、 马莱科 CO， 布勒德卢 P， 莫波伊五世SarcOptiM for ImageJ：在刺激的心肌细胞上进行高频在线肌节长度Am JPhysiolPhysiol2016;311：C277-83.http://dx.doi.org/10.1152/ajpcell.00094.2016网站。[9]坎尼·J边缘检测的计算方法IEEE传输模式Anal Mach Intell 1986;PAMI-8：679-98. http://dx.doi.org/10.1109/TPAMI的网站。1986.4767851。[10]Goulart JT，Bassani RA，Bassani JWM. 基于Canny的边 缘 检 测 算 法 用 于 记 录 分 离 的 心 肌 细 胞 的 收 缩 。 Comput Biol Med2017;81：106-10.http://dx.doi.org/10.1016/j的网站。compbiomed.2016.12.014网站。[11]米兰HFM，巴萨尼RA，桑托斯LEC，阿尔梅达ACG，巴萨尼JWM。精度的 电 磁 模 型 来 估 计 心 肌 细 胞 膜 极 化 。 医 学 生 物 工 程 计 算 2019 。http://dx.doi.org/10.1007/s11517-019-02054-2.[12]Penna LB，Bassani RA. 自发活动增加，足电击应激大鼠心室肌细胞对儿茶酚胺的变力性反应Stress 2010;13：73-82.http://dx.doi.org/10.3109/10253890902951778.[13]谢国忠心律失常的机制J Arrhythm 2016;32：75http://dx.doi.org/10.1016/j.joa.2015.11.003网站。[14] 谢毅，杨毅，Galice S，Bers DM，Sato D.大小问题：Ryanodine受体簇大小异质性增强钙波。BiophysJ2019;116：530-9.http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2018.12.017网站。[15]de Souza DS，de Menezes-Filho JER，Santos-Miranda A，de Jesus ICG，Silva Neto JA，Guatimosim S，et al.钙超载诱导的心律失常在大鼠心脏中被法尼醇抑制。欧洲药理学杂志2019;859：172488。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejphar.2019.172488网站。[16]埃赖斯-马丁内斯一、 Llach一、塔里法C、对甘迪亚 J，希门尼斯-萨瓦多五世，Lozano-Velasco E等人，4 q25变体rs 13143308 T将房颤风险与钙稳态缺陷联系起来。2019;115：578-89. http://dx.doi.org/10.1093/cvr/cvy215网站。