抗菌剂耐药性-供试品中嗜热链球菌Cas9的基因编辑器在分枝杆菌中的应用

工程15（2022）67研究抗菌剂耐药性-供试品PAM扩增的嗜热链球菌Cas9 C-to-T和C-to-G碱基编辑器用于分枝杆菌张宏远a，b，张逸飞a，b，王伟晓c，陈伟忠a，张霞d，黄兴旭e，f，陈伟c，刘伟，季泉江a，e，f，刘伟a上海科技大学物理科学与技术学院，上海201210b中国科学院大学，北京100049c南京中医药大学附属南京第二医院临床研究中心，南京210003d南京中医药大学附属南京第二医院结核科，南京210003e上海科技大学生命科学技术学院基因编辑中心，上海201210f广州实验室，广州510120，中国阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年11月8日收到2022年2月13日修订2022年2月15日接受2022年4月29日网上发售保留字：CRISPRCas9结核分枝杆菌基因编辑碱基编辑A B S T R A C T快速有效地治疗耐药结核病的新治疗策略是非常需要的，并且它们的开发可以通过结核分枝杆菌中的简易遗传操作方法来显著加速（M.肺结核）。常规间隔的短回文重复序列（CRISPR）碱基编辑器允许快速、稳健和程序化的单碱基取代和基因失活，但目前在M. 结核通过筛选不同的CRISPR碱基编辑器，我们发现只有不寻常的嗜热链球菌CRISPR相关蛋白9（St 1Cas 9）胞嘧啶碱基编辑器（CBE）-而不是广泛使用的化脓链球菌Cas9（SpCas 9）或毛螺菌科细菌Cpf 1（LbCpf 1）CBE-在分枝杆菌中具有活性尽管存在显著的C至T转化，但StlCas9 CBE存在高比例的不期望的副产物。因此，我们通过尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）或尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）融合来工程化St1Cas9 CBE，产生两种新的碱基编辑器（CTBE和CGBE），其能够在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smeglobium）（M. smeg-）。由于野生型StlCas9识别相对严格的前间区序列邻近基序（PAM）序列用于DNA靶向，我们通过碱基编辑器的结构指导蛋白质工程改造PAM扩增的StlCas9变体，从而显著拓宽靶向范围。我们首先在M. 将CTBE应用于M. 结核我们的方法大大减少了精确遗传操作所需的工作量和时间，将有助于M.结核病和相关生物。©2022 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.）2018年，结核病在全球造成1000万例感染和145万例死亡[1]。目前推荐的抗药物敏感结核病（TB）的治疗此外，*通讯作者。电子邮件地址：njyy039@njucm.edu.cn（W. Chen），quanjiangji@shanghaitech.edu.cn（Q. Ji）。多重耐药和完全耐药的TB使得这种疾病更加难以治愈[2，3]。因此，非常需要快速有效治疗TB的新的治疗方法的发展，M.简便、精确和无标记的基因操作方法可以大大加速结核病感染，这些方法可以快速识别和表征新的药物靶点in M. 结核 目前的基因操作方法M. 结核病的基因工程包括使用长线性DNA片段的等位基因交换[4]、基于分枝杆菌噬菌体的特化转导[5]、由噬菌体编码的重组系统介导的重组工程[6]、https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.02.0132095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engH. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6768×通过Bxb1整合酶靶向[7]，以及通过高度特异性双链断裂诱导的非同源末端连接（NHEJ）[8]。这些方法要么使用多个转化步骤，因此需要数月至数年的编辑，要么只能产生非精确的突变，因此不适合单碱基分辨率的基因功能探索。最近，成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）已被工程化用于在多种生物体中进行快速和精确的遗传操作，包括许多真核细胞和多种细菌物种[9通过与邻近前间区序列邻近基序（PAM）的基因组序列的碱基配对，Cas/指导RNA（gRNA）复合物可以特异性结合靶基因组位点并产生双链DNA断裂（DSB）。借助于细胞同源性定向修复（HDR）途径或NHEJ途径，可以分别容易地实现精确和非精确的遗传操作。此外，CRISPR-Cas系统可以进一步工程化为转录抑制（CRISPRi）系统，用于直接基因敲减，而不依赖于细胞DNA修复机制[18，19]。In M.已经开发了分别允许非精确编辑和部分基因敲低的CRISPR辅助的NHEJ [8]和CRISPRi [20 -23]策略用于遗传操作。然而，尽管它们是非常可取的，精确和完整的基因失活方法目前是不可用的，可能是由于缺乏一个兼容的HDR系统。最近，胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的开发和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）为精确的遗传操作提供了新的策略[24由核苷酸脱氨酶和死Cas9或Cas9切口酶的融合物组成的碱基编辑器可以通过催化脱氨反应直接实现精确的C至T或A至G转化，而不需要HDR;因此，它们广泛适用于具有不同遗传背景的各种微生物中的精确遗传操作[27然而，目前在M中没有这样的系统。结核在这项研究中，我们开发和表征了耻垢分枝杆菌（M.然后将CTBE应用于M. 结核通过筛选不同的CRISPR碱基编辑器，我们确定只有不寻常的嗜热链球菌Cas9（St 1Cas 9）CBE-而不是广泛使用的化脓链球菌Cas9（SpCas 9）或毛螺菌科细菌Cpf 1和M.在补充有0.2%甘油、0.05%Tween 80、1白蛋白葡萄糖过氧化氢酶（ADC）（M.斯美克霉）或油酸ADC（OADC）（M. 结核病）和适当的抗生素。当注意到，抗生素或化学品被用于以下浓度：卡那米Cin，M. smegalgae和M. 结核病，和50lg·m L-1为E.杆菌TOP10;亮氨酸（50μg·mL-1）、异烟肼（INH，16μg·mL-1）和脱水四环素（ATc，20 ng·mL-1）。2.2. 质粒构建用于质粒构建的引物列于附录A表S3中，本研究中使用的质粒列于附录A表S4中2.2.1. CBE_dSt1Cas9、CBE_dSpCas9和CBE_dLbCpf1质粒的构建J23119驱动的单向导RNA（sgRNA）表达盒由GENEWIZ（中国）合成，并使用T4 DNA连接酶组装到pLJR962[22]质粒（通过Esp3I和SapI线性化）的骨架中。从pBECKP[33]中聚合酶链反应（PCR）扩增APOBEC1基因，并通过Gibson组装[36]克隆到pLJR962质粒的骨架中，得到CBE_dSt1Cas9质粒。APOBEC 1和dSt 1Cas 9基因通过32个氨基酸的接头连接，并且APOBEC 1-dSt 1Cas 9融合蛋白的表达在ATC诱导型启动子Ptet的控制下。CBE_dSpCas9和CBE_dLbCpf1质粒使用与所用策略类似的策略构建在CBE_dSt1Cas9质粒的构建中。2.2.2. pMF1_CBE_dSt1Cas9、pJAZ38_CBE_dSt1Cas9和pAL5000_CBE_dSt1Cas9质粒的构建从pYC 1640扩增pMF 1复制子和Tet阻遏蛋白（TetR）基因，并通过Gibson组装将其组装到pLJR962_CBE_dSt1Cas9质粒的骨架中，得到 pMF1_CBE_dSt1Cas9 质 粒 。 使 用 类 似 的 策 略 构 建pJAZ38_CBE_dStlCas9和pAL5000_CBE_dStlCas9质粒。2.2.3. 构建pMF1_CTBE_cons、pMF1_CGBE_cons、（LbCpf 1）CBEs-在M. 耻垢 通过系统pMF1_CTBE_cons和pMF1_CGBE_cons质粒通过尿嘧啶DNA糖基化酶工程化St1Cas9 CBE工程师工程师通过使用UGI抑制剂（UGI）或尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）融合和StlCas9的PAM扩增，我们创建了具有增强的编辑产物纯度、拓宽的靶向范围和多重编辑能力的C至T碱基编辑器和此外，我们通过全基因组测序评估了C-to-T碱基编辑器的脱靶效应，并且在M中没有观察到可检测的脱靶编辑事件。耻垢我们的方法只需要一个质粒和一个转化步骤，就能进行有效和无疤痕的编辑，显著减少了在分枝杆菌中进行精确遗传操作所需的努力和时间2. 材料和方法2.1. 菌株和培养条件本研究中使用的菌株列于附录A的表S1中，本研究中使用的试剂列于附录A的表S2中大肠杆菌（E. coli）T0 P10用于质粒构建，并在37 °C下在 Luria-Bertani （ LB ） 肉 汤中培养。 M. 结 核 分 枝杆 菌H37Rv、M.本研究中使用了耻垢病菌株MC 2 155及其衍生菌株。M.结核UGI 由 Sangon （ China ） 合 成 ， 并 通 过 Gibson 组 装 组 装 到pJLR962_CBE_dStlCas9质粒的骨架中。从pYC 1640扩增pMF 1复制子和TetR，并组装到上述质粒中，得到pMF1_CTBE_cons质粒。E.coliUNG（eUNG）基因组中扩增得到一个重组质粒。coli MG 1655中，并通过Gibson组装组装到pMF1_CBE_dSt1Cas9质粒的骨架中，得 到 pMF1_CGBE_cons 质 粒 。 通 过 Gibson 组 装 将 D939 K/E1057Q/N1081 K/K1086 L 突 变 引 入 pMF1_CTBE_cons 质 粒 中 ， 产 生pMF1_CTBEengineer_cons质粒。APOBEC1从pMF1_CTBEengineer_cons扩增并组装到pMF1_CGBE_cons质粒的骨架中，得到pMF1_CGBEengineer_cons质粒。这些质粒用于M. 耻垢2.2.4. pMF1_CTBE工程质粒通过Gibson组装将Tet-driven sgRNA 表达盒引入pMF1_CTBEengineer_cons中，产生pMF1_CTBE engineer。在该质粒中，APOBEC 1-该质粒用于M. 结核H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6769××2.3. 感受态细胞制备和电穿孔M.将结核菌株H37 Rv（ATCC 27294）接种在来自冷冻储备液的Lowenstein-Jensen斜面中，并在37 °C下孵育2周;然后将其转移并在补充有0.05%吐温80、0.2%甘油和OADC的100 mL Middlebrook 7 H9肉汤中生长另外2周。将培养物在冰上冷却5分钟并使用离心收集。用30mL 10%预冷甘油洗涤小丸两次，重悬于5mL10%冷甘油中。对于电穿孔，将1μg重组质粒与100μL感受态细胞在0.2cm比色皿中;用GenePulserXcell电穿孔系统（Bio-Rad，USA）在以下条件下进行转化：2.5kV、1000X和25μF。后休克后，立即加入1 mL补充有OADC的7H9肉汤。最后加入比色皿中 将培养物在37 °C下孵育2天，并铺在补充有OADC 、 20μg/mL L-1 卡 那 霉 素 和 20μ g/mL L-1 无 水 四环素的Middlebrook 7 H10琼脂上。渐变群将板用石蜡膜密封并孵育20- 30分钟在37 °C下30天。M.将耻垢病菌株mc 2155（ATCC 700084）接种于7小时10分钟，其中10%ADC富集自冷冻储备液，并在37 °C下孵育4天。一个M.在37 °C下，将耻垢病菌株接种到2mL补充有0.05%Tween 80、0.2%甘油和ADC的Middlebrook 7H9肉汤中24小时。将细胞以1：100稀释到100mL补充有0.05%吐温80、0.2%甘油和ADC的Middlebrook 7 H9肉汤中，再持续12-15 h。当培养物在600 nm处的光密度达到0.8至1时，将培养物在冰上冷却20分钟，并通过离心收集在50 mL锥形管中在4000r/min-1下搅拌10 min。将30 mL 10%预冷甘油重悬于10 mL10%冷甘油对于电穿孔，将100 ng质粒与100μL感受态细胞在0.2cm比色皿中混合;用Gene Pulser Xcell Electropo.定量系统在以下条件下：2.5 kV、1000 X和25lF。休克后，将1mL添加ADC的7H9肉汤立即加入比色皿中。将培养物在37 ℃下孵育3小时，并将10%部分的培养物接种在补充有ADC（20 μ g/ml）的Middleb rook7 H10琼脂上。卡那霉素和20ng·mL-1无水四环素。 板用石蜡膜密封，并在37 °C下孵育7 -10天。2.4. 编辑效率评价本研究中使用的sgRNA靶序列列于附录A的表S5中。转化后，将平板用石蜡膜密封并在37 °C下孵育。所有的M. 或M.从平板上收集结核菌，并使用快速细菌基因组DNA分离试剂盒（Sangon Biotech）提取基因组DNA。用Easy Taq DNA聚合酶（TransGen，中国）扩增靶区域，使用靶区域的特异性引物。PCR产物进行Sanger测序，计算编辑效率使用EditR 1.0.10[37]。2.5. 使用CTBE工程化leuB或 leuC敲除设计间隔物并将其插入CTBE工程塑料中。将构建成功的质粒电穿孔到M. smeglycemc 2 155感受态细胞。休克后，立即将ImL具有ADC和亮氨酸的Middlebrook 7H9肉汤加入比色皿中。将培养物在37°C下孵育3小时，并将10%部分的培养物接种到Middle-1000 ml平板brook7 H10琼脂平板，加入ADC，20μg/mL卡纳霉素，20ng/mL美国脱水公司四环素e和50lg·mL-1亮氨酸。将板用石蜡膜密封并在室温下孵育。37 °C。电穿孔后7天，使用第2.4节中描述的方法评价总体编辑效率。将单个菌落在5mL补充有ADC和亮氨酸的7H9肉汤中在37 °C下在不存在卡那霉素的情况下 单 独 培 养 2 天 。 然 后 将 细 胞 接 种 到 补 充 有 ADC 和 亮 氨 酸 的Middlebrook 7H10琼脂平板上。分离leuB或leuC突变株并通过测序确认。2.6. 质粒消除对M.在碱基编辑后，将一个菌落在不存在卡那霉素的情况下在具有ADC的Middlebrook 7H9肉汤中培养。在生长至稳定期（4d）后，将细胞铺在补充有ADC的Middlebrook 7H10琼脂板上。挑取单个菌落，并稀释至5 mL Middlebrook 7H9中。将一部分稀释的细胞接种到补充有不含卡那霉素的ADC的Middlebrook 7H10琼脂板上，并将另一部分接种到补充有含卡那霉素的ADC的Middlebrook 7H10琼脂板质粒被成功消除的细胞只能在不加卡那霉素的平板上生长。2.7. 亮氨酸营养缺陷型测定通过使用CTBE工程质粒引入一个前终止密码子来敲除leuB或leuC基因将菌株在补充有ADC和亮氨酸的Middlebrook 7H9肉汤中生长至稳 定 期 。 将 一 部 分 细 胞 接 种 到 补 充 有 ADC 而 不 含 亮 氨 酸 的Middlebrook 7H10琼脂板上，并将另一部分接种到补充有ADC和亮氨酸的Middlebrook 7H10琼脂板将平板用石蜡膜密封并在37 °C下孵育4天。2.8. 异烟肼耐药性测定通过使用CTBE 工 程质粒在Gln3处引入提前终止密码子（CAA至TAA）来敲除katG基因。使菌株在含有OADC的Middlebrook 7H9肉汤中生长至稳定期。将一部分细胞铺在补充有OADC 的Mid-dlebrook 7 H10琼脂平板上，的INH，并将另一个级分铺在补充有OADC和INH（16μg/ml L-1）的Middlebrook 7 H10琼脂平板上。将平板用石蜡膜密封，并在37 °C下孵育20天。2.9. 聚集试验通过使用CTBE工程质粒在Gln16处引入提前终止密码子（CAG至TAG）来敲除ctpE基因使菌株在Middlebrook 7H9肉汤中生长至对数中期。将细胞以1：100稀释，并在含有1.0 mmol·L-1亚乙基双（氧乙烯基三酮）四乙酸或0 mmol·L-1 EGTA的Middlebrook 7 H9肉汤中培养。细胞在37°C下以200r/min-1振荡生长48 h;然后，细胞在室温下静置1.0 h以进行细胞聚集。2.10. 全基因组测序将野生型（ WT ）和两种编辑菌株的基因组发送给IlluminaHiSeq/Nova进行全基因组测序。2150 bp平台。根据Illumina HiSeq/Nova测序系统对2 150 bp平台协议。使用cutadapt（v1.9.1）处理通过滤波器数据以获得干净的数据，使用BWA（版本0.7.17）将其与参考基因组（登录号：NC_008596）进行比对。然后，使用H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6770Picard和基因组分析工具包（GATK）用于重复删除，局部重新对齐和碱基质量重新校准。使用由GATK提供的单倍型调用者模块检测单核苷酸变体（SNV），并使用Excel（Microsoft，USA）重排。将输出SNV与潜在脱靶位点进行比对，所述脱靶位点含有与PAM近端1-8个核苷酸（nt）处的靶位点相同的序列2.11. sgRNA的制备通过GENEWIZ化学合成sgRNA的转录模板（双链DNA），并通过PCR扩增sgRNA模板。按照制造商的说明书，使用HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒（NEB，USA）体外转录sgRNA。扩增和转录的模板在37 °C下孵育过夜后，加入脱氧核糖核酸酶I（DNase I）以消除DNA模板。使用苯酚/氯仿萃取，然后用乙醇沉淀进一步纯化产物。纯化后，将sgRNA储存在-80 °C。2.12. StlCas9蛋白的体外DNA切割测定按照先前的研究进行蛋白质制备和切割试验[43]。简言之，首先将含有间隔区和AAAGAA PAM的序列克隆到基于pUC 19的载体（称为pUC 19-AGAA）中。通过位点特异性诱变构建具有不同PAM位点的质粒（附录A中的表S6 通过Kpn I消化过夜使质粒线性化，并使用TIANquick Midi Purification Kit（TIANGEN，中国）作为切割底物纯化产物。对于体外切割测定，将250 nmol·L-1纯化的StlCas 9 或 其 变 体 与 500 nmol·L-1sgRNA 在 反 应 缓 冲 液 （ 10mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）、500 mmol·L-1NaCl、1.5 mmol·L-1MgCl2和1 mmol·L-1二硫苏糖醇（DTT））中混合。接着，将线性化质粒加入反应缓冲液中（最终浓度为100 mg/ml）。5 nmol·L-1）。将反应物在37 °C下孵育40分钟，然后立即转移到液氮中。然后，将25mmol/LEDTA和10μg蛋白酶K加入到反应物中反应管终止反应。在58 °C下孵育30分钟后，10分钟后，使用1%琼脂糖凝胶分析反应产物。将产物用4S Red Plus（Sangon Biotech）染色并通过ChemiDoc MP系统（Bio-Rad）可视化。3. 结果和讨论3.1. 耻垢分枝杆菌SpCas9中活性胞嘧啶碱基编辑器的鉴定已经广泛适用于在大肠杆菌中的遗传操作。许多微生物[16，29，38然而，由于其显著的细胞毒性和低DNA靶向效率，其在分枝杆菌中的应用受到限制[8，22]。为了在分枝杆菌中开发活性CBE，我们筛选了由大鼠APOBEC1胞嘧啶脱氨酶和不同Cas核酸酶的融合物组成的各种CBE，包括dSpCas9（无催化活性的SpCas9）、dLbCpf1 （ 无 催 化 活 性 的 LbCpf1 ） 和 dSt1Cas9 （ 无 催 化 活 性 的St1Cas9）。Cas核酸酶的表达在ATC诱导型启动子的控制下，而相应gRNA的表达在合成组成型启动子J23119的控制下。为了定量评估靶向碱基编辑的效率，将相同量的每种不同CBE质粒电穿孔到M.耻垢CBEdSt1Cas9（CBE_dSt1Cas9）诱导在所有测试位点处，CBE dSpCas9（dSpCpf1 CBE）和CBEdLbCpf1（dLbCpf1 CBE）的编辑效率均低于10%， 其 中显著的C至T转化（4%至15%）和不期望的C至G转化（18%至70%）作为主要编辑产物 ， 而 CBEdSpCas9 （ dSpCpf1CBE ） 和 CBEdLbCpf1（dLbCpf1CBE）的编辑效率在所有靶位点处均低于10%（图1（a））。此外，与先前的研究[42，43]一致，对于CBE dStlCas9或 CBE dLbCpf 1 没 有 观 察 到 显 著 的 细 胞 毒 性 ， 而 对 于 CBEdSpCas9观察到高细胞毒性（图11）。 1（b））。因此，我们选择CBEdSt1Cas9作为进一步工程化的起始系统为了在碱基编辑后治愈质粒，我们用可复制的pMF 1骨架替换CBEdSt1Cas9系统中使用的非复制型L5我们发现，所得的基于pMFl骨架的CBE dStlCas9质粒没有显示出显著的细胞毒性，并且可以通过在不存在抗生素的情况下培养细菌而容易地治愈（图1A和1B）。附录A中的S1和S2）。3.2. 头孢霉烯类抗生素CTBE和CGBE的研究进展细 胞 中的 G ： U 错 配 对通 常 通 过 UNG 介 导 的碱 基 切 除修 复（BER）过程来修复。UNG的抑制将保护编辑的G：U中间体免于切割，从而提高C 至T转化效率和编辑产物纯度[24，44]（图1（c））。我们将两个UGI融合到dStlCas 9的C末端以创建C-to-T碱基编辑器（CTBEWT）。为了检查CTBE WT的C至T编辑效率，将靶向五个不同基因座的五个CTBE WT质粒分别电穿孔到M.耻垢 CTBEWT实现了范围从69%至86%的高水平的C-to-T碱基编辑频率，并且显著减少了不期望的副产物的形成（图1B）。 1（d））。最近的研究表明，通过UNG或其他DNA修复蛋白融合到SpCas 9CBE来促进BER途径可以将靶C：G碱基对转化为G：C或A：T碱基对，而不是预期的T：A产物[45考虑到CBEdStlCas 9存在高比例的意想不到的C-to-G副产物，我们预期UNG与CBEdStlCas 9的融合将产生新的碱基编辑器。因此，我们将eUNG融合到CBE dSt1Cas9中dSt1Cas9的C末端，以创建新的碱基编辑器CGBEWT，并比较CGBEWT和CBEdSt1Cas9的碱基编辑效率。如图1（e）所示，CGBEWT可以有效地实现C至G转化，在所有五个测试位点处具有增强的编辑产物纯度。3.3. 用于碱基编辑器的PAM扩展的St1Cas9变体的工程化StlCas 9需要相对严格的PAM序列（50-NNRGAA-30，其中R是A或G）用于DNA靶向[43]，显著限制了CTBEWT和CGBEWT的编辑范围。我们先前通过引入D939 K/E1057 L/N1081 K/K1086 L突变来工程化StlCas9变体KLKL，以减轻PAM特异性[43]。在野生型StlCas 9中，当使用50-NNAGGA-30PAM时，Q1084和K1086与第三个A和第四个G形成双齿氢键，并且Q1084通过氢键被E1057进一步稳定（图2（a））。E1057L和K1086L突变会破坏碱基特异性相互作用，而D939K和N1081K突变会引入非碱基特异性相互作用[43]。我们最近发现，KLKL变体中L1057 Q的突变将增加对含50-NNTTAA-30PAM 和50-NNCTAA-30PAM的DNA的体外DNA切割活性（图1B）。 2（b））。因此，我们设计了含有D939 K/E1057 Q/N1081 K/K1086 L突变的StlCas 9 KQKL变体以进一步减轻PAM特异性。全面的体外DNA切割测定显示，与WTStlCas 9 的50-NNRGAA-30 特 异性 相比 ，D939 K/E1057 Q/N1081K/K1086 L的突变显著扩大了具有50-NNNNAA-30PAM特异性的KQKL变体的PAM识别范围（图1B）。 2（c））。H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6771图1.一、St1C as9 介导的M. 耻垢（a）鉴定M. 耻垢 三种不同的碱基编辑器，S。嗜热链球菌Cas9 CBE（CBE_dSt1Cas9）、嗜热链球菌Cas9 CBE（CBE_dSt1Cas9）、嗜热链球菌Cas9 CBE（CBE_dSt1Cas9）、嗜热链球菌Cas9CBE（CBE_dSt1Cas9）。化脓性链球菌Cas9 CBE（CBE_dSpCas9）和L. 细菌Cpf1 CBE（CBE_dLbCpf1）。APOBEC1胞嘧啶脱氨酶通过32个氨基酸的接头与Cas核酸酶的N末端融合（b）M. 将100 ng的每种质粒用于电穿孔。(c)胞嘧啶脱氨基作用的可能细胞DNA修复机制最初的编辑产物，U：G错配对，可以通过DNA修复和复制直接转化为T：A对，UGI可阻断内源性UNG活性。（ d，e）用UGI或UNG融合物工程化StlCas9 CBE，产生两种新的碱基编辑物，（d）CTBE和（e）CGBE，其能够在M中进行C至T或C至G转化。具有显著增强的编辑纯度的smegalone 。接下来，我们用KQKL变体替换CTBE WT的WT StlCas 9以扩展C-to-T碱基编辑器的编辑范围（图1B）。 3（a））。首先对所得CTBE工程化系统进行ATc浓度优化，因为ATc是工程化StlCas9变体表达的诱导物。我们筛选了六种不同浓度的ATc，范围从5到100ng/mL，但没有观察到编辑效率的显著差异（附录A中的图S3）。我们选择20 ng/mL作为后续实验中碱基编辑的诱导剂浓度。系统描述CTBE工程师的PAM偏好在体内，我们组装了48个间隔区，靶向48种不同的内源性基因组位点，每个50-NNNAA-30PAM具有三个间隔区。我们在每次转化后收集所有菌落，并对靶位点的PCR产物进行测序以评估编辑效率。与体外DNA切割测定一致，CTBE 工 程 师具有扩大的PAM偏好，具有50-NNNNAA-30PAM特异性（图1B）。 3（b））。我们还注意到，当靶向具有较低活性PAM的位点时，如50-NNTTAAA-30，50-NNTCAA-30，50-NNTGAA-30和50-NNTTAA-30，间隔区序列含量可显著影响CTBE工程的编辑效率（图3（b））。此外，我们还对CTBE工程师的编辑窗口进行了分析，发现CTBE工程师更喜欢H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6772图二. St1Cas9通过结构导向工程的PAM扩展。(a)WT StlCas9（PDB：6M0X）的PAM识别机制。(b)StlCas9的两种工程化突变体的体外DNA切割测定。(c)WT StlCas9和KQKL变体的体外DNA切割测定。M：马克笔。在窗口内从位置4到12编辑Cs（图3（c））。当Cs位于窗口外的位置4到12，但位于窗口内的位置2到15时，Cs有时仍然可以高效率地编辑（图2）。 3（c））。类似地，我们用StlCas9工程师工程化CGBEWT以构建CGBE工程师系统（图3（a））。我们通过测试29个内源基因组位点的编辑效率来全面表征CGBE工程师有趣的是，只有位置5到8的窗口内的Cs可以用CGBE工程师系统编辑（图1）。 3（d）），尽管相同的Cas9蛋白和脱氨酶用于CGBE工程化和CTBE工程化。此外，只有具有TC基序的Cs可以被编辑，即使它们位于编辑窗口内的位置5至 8（图 11 ）。 3（d））。此外，我们将CGBE工程师中的eUNG替换为M. mUNG）以促进M中的C至G转化。磺胺甲恶唑（附录A中的图S4）。构建了四种形式的C-to-G碱基编辑器，其中eUNG或mUNG与StlCas 9蛋白的C或N末端融合，用于M中的碱基编辑。耻垢我们发现，mUNG或eUNG与StlCas9的C末端的融合在所有测试位点处产生相似的编辑效率，而mUNG或eUNG在N末端的融合不产生有效的C至G编辑（图S4）。考虑到使用mUNG或eUNG的类似编辑效率，我们将eUNG保存在CGBE工程师中用于进一步表征。3.4. CTBE基因工程在耻垢分枝杆菌中的基因失活CRISPR C-to-T碱基编辑器可以将CAA、CGA、CAG和TGG密码子转化为过早终止密码子;因此，它们是基因失活的有前途的工具[49，50]。我们通过设计三个不同的间隔区来检测CTBE工程师的基因失活能力，这些间隔区针对必需的L-亮氨酸生物合成基因leuB和leuC。为了评估总体编辑效率，提取板上所有菌落的基因组DNA，并对靶区域进行扩增和测序。观察到所有设计的间隔区的有效编辑（附录A中的图3（f）和图S5），以及对分离的纯突变体进行表型分析。在leuB或leuC中产生提前终止密码子使得细菌在不存在L -亮氨酸的情况下不能生长，证实L-亮氨酸生物合成的失活（图1B）。 3（f））。此外，通过用CTBE工程师产生提前终止密码子，将类似的策略成功地应用于cDNActpE。与先前的研究[51]一致，通过引入提前终止密码子使ctpE（钙转运腺苷50-三磷酸）失活增加了EGTA存在下的细菌聚集（附录A中的图S6总之，这些结果证实了CTBE工 程 师是一个强大的和可靠的工具，基因失活在M。耻垢3.5. 在M： smegalloy中进行多重编辑在生长缓慢的病原体中对多个基因进行连续基因组编辑非常耗时，而多重基因组编辑可以大大加快基因组编辑的进程。我们将两个sgRNA表达盒组装到一个CTBE工程质粒中，以测试CTBE工程在M. smeglycemc 2155菌株（附录A中图S7（a））。如附录A中的图S7（b）所示，在8个随机挑选的菌落中的6个菌落中同时突变了2个基因（sigF和Ms6753）。此外，通过将三种sgRNA组装到CTBE工程质粒中，同时靶向三个不同的基因组位点（cysS、sigF和Ms6753），并且所有三个靶向位点在八个随机挑选的菌落中的七个中成功突变（图1A和1B）。4（a，b））。类似地，我们将两个或三个sgRNA表达盒组装到单个CGBE工程质粒中，并测试了M. smeglycemc 2 155菌株（附录A中的图S8（a）和图4（c））。如附录A中图S8（b）所示，CGBE工程师在8个分析克隆中的6个中进行了双重诱变。对于三重诱变测定，所有三个靶向位点在八个分析的菌落中的六个中成功突变（图4（d））。总之，这些结果表明CTBE工程师和CGBE工程师都适合于M. 耻 垢3.6. CTBE工程的全基因组脱靶评价为了评估CTBE工程系统的全基因组脱靶编辑，两个编辑的M。随机选择耻垢病菌落并进行全基因组测序。H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6773图三.对M.耻垢(a)不同St1Cas9 CBE的组成。(b)CTBE WT与CTBE工程师在M. smeigrant（条形图反映编辑窗口内的最大编辑频率）。（c，d）编辑（c）CTBE工程师和（d）CGBE工程师的窗口。(e)M. L-亮氨酸生物合成途径. 耻垢靶基因（leuC和leuB）以红色突出显示（α-KIV：α-酮异戊酸;α-IPM：α-苹果酸异丙酯; IPM：3-异丙基苹果酸酯）。(f)通过CTBE工程化通过产生过早终止密码子使leuB和leuC失活。leuB或leuC的失活在缺乏leuB或leuC的情况下引起营养缺陷型。L-亮氨酸。方框和倒置方框分别指示靶序列和PAM。H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6774图四、 多重编辑在M. 耻垢（a）CTBE 工程介导的多重诱变的单质粒系统的图谱（b）CTBE工程介导的多重编辑测定的编辑结果方框和倒置方框分别指示靶序列和PAM编辑后的碱基以红色显示，并以黄色突出显示。（c）CGBE工程介导的多重诱变的单质粒系统的图谱（d）CGBE介导的多重编辑测定的编辑结果 方框和倒置方框分别指示靶序列和PAM。编辑后的碱基以红色显示，并以黄色突出显示未检测到含有与原型间隔区近端1-8 nt的PAM相同序列的潜在脱靶编辑位点这些结果证明了CTBE工程系统的高编辑保真度，并且与之前的发现一致，即StlCas9是高保真酶，并且其编辑对间隔序列中的突变高度敏感[43]。3.7. 结核分枝杆菌的基因组编辑给定的成功的基地编辑与CTBE工程师在M.因此，我们试图在M. 结核将靶向四个不同内源性位点的四个不同间隔区分别克隆到CTBE工程系统中，并将所得编辑质粒克隆到CTBE工程系统中。H. Zhang，Y.张文--X. Wang等人工程15（2022）6775图五.在M中进行碱基编辑。结核病与CTBE工程师。(a)条形图显示CTBE工程师在M.不同部位的结核病。底部的编号指示原型间隔区中碱基的位置，其中一个是最PAM远端的碱基。箭头指示具有C至T转化的胞嘧啶（b）CTBE工程师通过产生提前终止密码子使katGkatG的失活使M.结核病对异烟肼耐药。方框和倒置方框分别指示靶序列和PAM。（c）CTBE工程师在分枝杆菌ORF中最早诱导可靶向的终止密码子的相对位置（累积百分比）。分别电穿孔到M.结核病H37Rv感受态细胞。通过收集所有转化体并对靶位点测序来测量C至T转化效率对于所有四个测试位点观察到显著的C到T转换，编辑频率范围为12%至95%（图1B）。 5（a））。此外，我们通过在katG中引入提前终止密码子来应用该系统进行基因失活（图1B）。 5（b））。katG的失活是表型分析进一步证实，katG突变株比WT株对INH处理的抗性更强（16μg/mL[52]（Fig. 5（b））。因为引入的预-开放阅读框（ORF）中的成熟终止密码子可以显著影响基因失活效率，我们用CRISPR-CBEI系统地计算了分枝杆菌中CTBE工程的可能靶向密码子[50]。如图5（c）所示，超过75%、60%和40%的所分析的分枝杆菌种（M.结核分枝杆菌（M.分别为耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌）可能被CTBE工程改造靶向，以分别在ORF体的前75%、50%和25%内引入至少一个提前终止密码子，这表明在分枝杆菌中许多基因可能被CTBE工程改造失活。4. 结论遗传操作对促进M.结核病生物学和药物靶点探索。虽然这是非常可取的，无疤痕，精确，无标记的编辑在M。结核病依赖于HDR，并且需要数月至数年的编辑。已经开发了CRISPR辅助的HDR方法用于在许多细菌物种中进行快速和精确的基因组编辑[13，15，17，34]。然而，它不适用于M。肺结核，这可能是由于缺乏与CRISPR兼容的HDR系统。已经开发了使用无催化活性的St1Cas9、SpCas9或新杀弗朗西斯菌Cas12a（FnCas12a）的CRISPRi系统用于分枝杆菌中的基因沉默。然而，这些系统只能实现部分基因敲低，并将引起极性效应，其中Cas蛋白结合位点下游的opronic基因也被沉默[21，22]。为了解决分枝杆菌基因编辑中的这些挑战，我们开发了高效PAM扩展的St 1Cas 9 C-to-T和C-to-G碱基编辑器，用于分枝杆菌中的程序化碱基编辑。这些系统可以通过单个转化步骤实现精确的单碱基取代，从而大大减少遗传操