亨德拉病毒多表位肽疫苗的免疫信息学研究

医学信息学解锁25（2021）100678免疫信息学辅助亨德拉病毒多表位肽疫苗蛋白质组学研究Mohammad Imran Hossana，Afrin Sultana Chowdhury a，*，Mohammad Uzzal Hossainb，Md Arif Khanc，Tousif Bin Mahmood a，Shagufta Mizan daNoakhali科技大学生物技术和遗传工程系，Noakhali，3814，孟加拉国b孟加拉国达卡国家生物技术研究所生物信息学司，邮编：1349。c孟加拉国达卡发展替代大学生物技术和遗传工程系，1209d吉大港大学遗传工程和生物技术系，吉大港，4331，孟加拉国A R T I C L EI N FO保留字：亨德拉病毒多表位疫苗免疫信息学动力学模拟A B S T R A C T亨德拉海尼帕病毒（Hendra henipavirus，HeV）是一种由蝙蝠传播的人畜共患副狂犬病病毒，可引起人类严重的公共卫生并发症。它促进人类和马的呼吸系统和神经系统疾病。目前，还没有针对致命HeV的治疗方法或疫苗。我们的目的是通过免疫信息学方法设计一种有效的和新的预防性嵌合疫苗针对HeV。 进行全蛋白质组筛选以鉴定抗原蛋白，然后进行细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、线性B淋巴细胞（LBL）和辅助性T淋巴细胞（HTL）表位鉴定、保护性分析、群体覆盖、分子对接以及细胞和体液免疫应答的计算机模拟。 从最高抗原性的蛋白质，即糖蛋白、融合蛋白和核蛋白中鉴定了总共17个T和B细胞表位（7个CTL、5个HTL和5个LBL）用于疫苗设计。该疫苗具有高度免疫原性、抗原性、非毒性、非过敏性和稳定性，可有效对抗HeV。此外，二硫键工程和密码子适应，以提高稳定性和有效表达在E。杆菌分子对接和动力学模拟分析表明该疫苗对TL4受体具有较强的亲和力和稳定性。免疫模拟数据证实了B细胞和T细胞对疫苗亚单位的应答升高。根据我们的计算机模拟数据设计的疫苗足以阐明实质性的免疫应答，因此可以被认为是控制HeV感染的潜在免疫原性试剂。但其有效性和安全性还需要进一步的实验验证和临床试验来证实1. 介绍亨德拉亨尼帕病毒（Hendra henipavirus，HeV）是副粘病毒科亨德拉亨尼帕病毒属的一种，近年来在澳大利亚热带地区引起了多次暴发[1]。1994年9月，一种以前未知的病毒成为布里斯班郊区亨德拉严重呼吸道疾病流行的原因，13匹马死亡，2人感染。这是第一例致命的人畜共患病毒性呼吸道感染的正式病例。这种致命的病毒最初被命名为马麻疹病毒（EMV），后来被命名为亨德拉病毒从它出现的地方开始[2HeV可在广泛的哺乳动物宿主中引起致命疾病[5];例如，人类和严重的呼吸道和神经系统感染[6]。自首次出现以来，每年都有HeV暴发的报告，从2006年到2010年，HeV暴发的发生频率显著增加，除2010年发生一起事件外，每年报告两起事件[3，7]。截至2019年6月，共有84匹马死于HeV感染[8]。HeV的天然宿主是狐蝠属（Pteropus果蝠但也有最近的研究声称，当人类接触受感染的马时，病毒颗粒会传播给人类[1估计HeV的培养期为7此后，疾病进展开始为流感样疾病，伴有恶心、呕吐、发热、头痛、恶心、呕吐、恶心、恶心、呕吐、恶心、呕吐疼痛嗜睡肌肉疼痛这些症状因患者而异。 在病毒感染的后期阶段，疾病进展为暴发性脑炎，导致多器官衰竭。口腔-鼻腔途径出现* 通讯作者。电子邮件地址：afrin.bge@nstu.edu.bd（A.S.Chowdhury）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100678接收日期：2020年12月3日;接收日期：2021年7月17日;接受日期：2021年2021年7月28日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuM.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006782是这种病毒感染的主要途径，病毒复制的主要部位是口鼻上皮和上呼吸道[4]。马和人感染HeV的病死率分别为70%和57%[1，2，7]。HeV是大包膜的，多形性的，并且它们的尺寸范围从40到600 nm直径。HeV基因组为18，234 nt长的非分段单链负极性RNA，包含六个转录单位，即基质蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、糖蛋白基因（G）、大聚合酶蛋白基因（L）、核蛋白基因（N）和磷蛋白基因（P），它们编码九种不同的蛋白[1，2，4]。RNA与N蛋白紧密结合，与P和L蛋白质的复合物病毒通过高度保守的哺乳动物蛋白Ephrin B2（EFNB 2）在G蛋白的帮助下与宿主细胞表面附着。宿主细胞膜和病毒细胞膜的融合在F蛋白的帮助下发生，F蛋白促进病毒体释放到宿主细胞中[1]。P基因产物磷蛋白，非结构蛋白W，非结构蛋白V，和非结构蛋白C可以通过抑制干扰素活性来改变免疫应答[4]。自从HeV被确定为一种新出现的病毒以来，它已成为人类和动物健康的经常性威胁。遗传多样性、机会性、高毒力、极高致死率、感染广泛哺乳动物宿主的能力使其成为 对人类健康造成严重临床并发症的最具破坏性的病毒。然而，HeV感染的治疗选择仍然非常有限。据报道，利巴韦林在HeV感染金黄地鼠模型中的作用不显著。此外，抗疟药氯喹单独给药或与利巴韦林联合给药时，在感染HeV的仓鼠中均未显示出显著的治疗效果[8，9]。虽然有一种注册疫苗（Equivac® HeV）可用于预防马的HeV疾病[8]，但没有许可的抗病毒治疗或疫苗可用于人类。考虑到该病毒在人类中临床表现的严重性，开发一种可以帮助预防未来HeV感染的疫苗是必要的。图1.一、 用于设计抗亨德拉亨尼帕病毒疫苗的总体工作流程示意图。M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006783≤秩序由于HeV对公众健康的威胁不断出现，且缺乏合适的药物治疗策略，我们的目的是设计一种预防性嵌合疫苗，以促进针对HeV的免疫反应。通过计算机模拟方法设计基于多表位的疫苗已成为后基因组时代疫苗开发的黄金标准，因为其特异性和成本效益[10]。因此，我们对HeV的蛋白质组进行了虚拟筛选，以找出最具抗原性的蛋白质，然后从所选的抗原蛋白质中预测多个T细胞（细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞）和B细胞（线性B淋巴细胞）表位。2. 材料和方法本研究的完整方法如图所示。1.一、2.1. 蛋白质序列检索仔细检查HeV的整个蛋白质组，然后使用以下登录号O 89343（G蛋白）、O 89342（F蛋白）、O 89341（M蛋白）、O 89339（N蛋白）、O 55778（P蛋白）、O 89344（RNA指导的RNA聚合酶）、O 55777（非结 构 蛋 白 V ） 、 O 55779 （ N 蛋 白 ） 从 UniProtKB （ https ：www.uniprot.org/help/uniprotkb推荐的2020.04方法（NetMHCpan EL 4.0）。在本研究中，HLA来源物种参数设定为人类，使用HLA参考集，阈值被认为是0.052.5. HTL表位使用IEDB MHC-II结合（http://tools.iedb.org/mhcii/）工具，采用IEDB推荐的方法22.2 [18]预测基于多表位的疫苗的15个氨基酸长度的HTL表位及其相应的HLA II类等位基因。该工具通过比较来自SWISS-PROT数据库的一组随机肽和提交的肽生成百分位数排名[18]。因此，在我们的本研究中，将百分位数秩2视为阈值，因为较低的百分位数秩意味着较大的结合亲和力。从这些预测的表位产生干扰素-γ（IFN-γ）的HTL通过IFN表位（http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/）工具[19]用IFN-γ对非IFN-γ模型和混合方法（Motif和SVM）参数过滤表位。 两个在线工具使 用 IL 4pred （ http://crdd.osdd.net/raghava/il4pred/ ） [20] 和 IL 10pred（http://crdd.osdd.net/raghava/il10pred/predict.php）[21]分别用杂交和SVM方法评价预测的HTL表位的白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）产生特性，同时保持其他默认参数。此外，AllerTOP2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）的网站上进行了介绍。[15]和（非结构蛋白C）、P0C1C6（非结构蛋白W）。这些到XinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toX inpred/）[16]软件进一步分析蛋白质以寻找它们在病毒生命周期中的重要性。2.2. 最高抗原性蛋白的鉴定采用VaxiJen2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html），所有必需蛋白的阈值均为0.5，以计算合理候选疫苗的抗原性[11]。此服务器专注于自动互协方差（ACC）转换以及保持70-89%的预测准确度的不依赖于时间的预测选择抗原性高于阈值的蛋白质进行进一步分析[11]。2.3. 跨膜拓扑预测利 用 专 注 于 隐 马 尔 可 夫 模 型 的 TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）服务器找出所选蛋白质的外、内和跨膜螺旋区[12]。2.4. CTL表位使用NetCTL 1.2（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）工具，阈值为1.25，以从先前选择的蛋白质序列预测9个氨基酸长度的CTL表位[13]。这服务器 结合 人类 白细胞 抗原 （HLA） 类 -Ibinding，C-末端切割和TAP转运效率预测算法，以预测12种（A1、A2、A3、A24、A26、B7、B8、B27、B39、B44、B58、B62）HLA超型的CTL表位[13]。为了评估每个预测表位的抗原性和免疫原性，Vaxijen服务器2.0[11]和IEDB I类免疫原性（http://tools.iedb. org/免疫原性/）工具[14] 。 另 外 两 个 在 线 工 具 -AllerTOP 2.0 （ https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）[15]和ToX inPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toX inpred/）[16]用于评估所有选择的表位的变应原性和toX性，以确保其安全性。AllerTop 2.0通过结合自互协方差（ACC）反-形成和κ-最近邻算法[15]，而ToX inPred被设置为SVM方法以预测toX icCTL表位。预测HLA I类基于抗原性、免疫原性、毒性和过敏原性，最初选择的CTL表位的结合等位基因，IEDBHLAI类工具（http://tools.immuneepitope.org/mhci/）[17个]是使用关于IEDB对所选抗原表位的致敏性和毒性进行了评价，以保证其安全性。2.6. LBL表位对于来自蛋白质序列的不同长度的线性B淋巴细胞（LBL）表位预测，使用两种IEDB工具（http://tools.iedb.org/bcell/），即Emini表面可及性工具[22]和BepiPred线性表位预测2.0 [23通过提交至Vaxijen2.0工具[11]阈值为0.5。2.7. 表位保护性分析IEDB表位保护分析工具（http://tools.iedb. org/conservation/）[24]用于计算在100%同一性水平下选择的CTL、LBL和HTL表位2.8. 人口覆盖率分析IEDB人群覆盖率（http://tools.iedb.org/population/）工具[25]用于计算特定地理区域中可能对最终选择的CTL和HTL表位及其各自的HLA I类和II类等位基因产生免疫应答的人群的总百分比，表3和表4中列出。2.9. 肽模拟和分子对接模拟研究在 线 工 具 PEP-FOLD 3.0 （ https://mobyle.rpbs ） 。 univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3）是uti-使用sOPEP分选方案使用200次模拟来模拟所选择的CTL表位。该工具使用前向回溯/禁忌采样算法预测小肽（5- 50个氨基酸）构象[ 26 ]。来自RCSB蛋白质数据库（https://www.rcsb. org/search）[27]，复杂的晶体结构（蛋白质和表位）以PDB格式检索待用作受体的最保守等位基因HLA-A*24：02（PDB ID：2BCK）。利用Discovery studio对HLA-A*24：02复杂的结构进行简化，便于对接研究，然后利用Autodock工具进行分子对接[28]和AutodockVina软件[29]。网格框X中心在X、Y和Z轴上分别设置为35.376、17.076和3.458 mm，M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006784+在X、Y和Z维度上分别将网格大小设置为76、60和86 μ m，以获得HLA-A*24：02与HLA沟处的表位最后，使用AutoDockVina工具在0.681 μ m间距参数下进行对接模拟研究为了制备和可视化对接的受体-表位复合物，分别使用PyMOL [30]分子图形系统和Discoverystudio 2017。在RCSB蛋白库中未发现预测HTL表位的两种常见HLA II类等位基因（HLA-DRB 3 *02：02和HLA-DRB*15：02）的实验验证晶体结构，因此未进行HTL表位的对接。2.10. 多表位疫苗TLR4的表达在感染期间增加，并且TLR4激动剂经常用作基于肽的亚单位疫苗的一部分[31]。佐剂在增强针对抗原的免疫应答并在各种免疫机制的帮助下启动特异性、持久的免疫应答方面发挥重要作用[32]。出于这个原因，从UniProtKB数据库（登录号P9 WHE 3）检索50 S核糖体蛋白L7/L12（Toll样受体4（TLR 4）激动剂）以用作序列N末端的佐剂。从RCSB蛋白质数据库中检索另一种蛋白质，即人β-防御素2（Accession No.1FD3），并将其添加到疫苗序列的C-末端。两个肽接头，即GPGPG和AAY，用于分离表位并确保人体内的个体免疫应答。GPGPG接头用于分别在疫苗序列的N端和C端连接两种佐剂50 S核糖体蛋白L7/L12和人β-防御素[34]。2.11. 疫苗构建体使用VaxiJen2.0[11]和ANTIGENpro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu）[35]工具评估构建疫苗的抗原性。通过IEDB免疫原性工具[14]和AllerTOP 2.0 [15]评价免疫原性和变应原性构建的疫苗的理化特征，即，使用EXpasy服务器的ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）评价分子量（MW）、脂肪族指数（AI）、理论等电点（PI）、不稳定指数（II）、亲水性总平均值（GRAVY）以及体外和体内半衰期[36]。此外，SOLpro工具（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu）[37]用于预测疫苗蛋白在E.通过Protein-Sol（www.example.com）工具预测并确认https://protein-sol.manchester.ac.uk/了大肠杆菌的蛋白质含量[38]。2.12. 预测疫苗PSIPRED v4.0（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）[39]用于预测疫苗具体迭代爆炸）[39]。接下来，我们使用了迭代线程自动化细化（I-TASSER ） 工 具 （ https://zhanglab.ccmb.med ） 。 umich.edu/I-TASSER/）[40]来预测我们最终疫苗构建体的3D结构。该工具通过迭代的基于模板的片段组装模拟生成同源模型[40]。Pymol用于可视化I-TASSER输出的最佳3D模型2.13. 疫苗3D结构的优化和验证生 成 的 疫 苗 蛋 白 质 原 始 模 型 首 先 通 过 3Drefine 工 具（http://sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/）[41]进行优化，该工具通过 最 小 化 原 子 级 能 量 和 优 化 氢 键 网 络 来 优 化 结 构 。 之 后 ， 使 用GalaxyRefine（http://galaxy.seoklab.org/refine）[42]通过分子动力学模拟的结构弛豫来细化结构，以改善结构。平均全局和局部结构质量。因此，将改进后的结构提交给ProSA网站（https://prosa.services.came.sbg）。ac.at/prosa.php）[43]通过计算整体质量得分进行结构验证。天然和预测质量评分范围之间的差异是预测三级结构中可能错误的指示。此外，EXpasy服务器的Swiss模型交互式工作 空 间 （ swissmodel.expasy.org/assess ） [44] 用 于 结 构 验 证 并 生 成Ramachandran图。2.14. 疫苗构建体为了确认疫苗构建体中线性和构象B细胞表位的存在，使用IEDB服务器（http://tools.iedb.org/ellipro/）[45]的ElliPro工具和默认参数。2.15. 最终疫苗构建体将 改 进 的 疫 苗 结 构 提 交 给 设 计 二 硫 键 （ DbD ） 2.12（http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/）[46]工具，以通过在潜在残基对之间产生二硫键来增加稳定性基于一组标准，选择潜在的残基对并用半胱氨酸残基突变[46]。2.16. 密码子优化、计算机克隆和mRNA结构预测为了保证疫苗蛋白在大肠杆菌中的高效表达，coli K12，使用Java密码 子 适 应 工 具 （ JCAT ） （ www.example.com ） 进 行 密 码 子 适 应http://www.jcat.de/[47]。在密码子适应过程中，检查三个参数以避免限制性酶切位点、rho非依赖性转录终止和原核核糖体结合位点。此外，将EcoRI和BamHI限制性位点分别引入疫苗序列的N和C末端。最后，在对应于所设计的疫苗构建体的适应的核苷酸序列和对应于所设计的疫苗构建体的适应的核苷酸序列之间进行克隆模拟。E. coli pET 28a （ ） 表 达 载 体 ， 通 过 使 用 SnapGene 4.2 软 件（https://www.snapgene.com/）进行。RNAfold （ http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibi/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）在线工具用于产生mRNA二级结构，其预测mRNA的结构，并作为最小自由能得分的标志[48然后通过DNA>RNA>Proteintool（http://biomodel.uah.es/en/lab/cybertory/analysis/trans.htm）将JCat工具生成的优化DNA序列转化为RNA序列。 和 提交 到 的 RNA 倍服务器维护默认参数。2.17. 疫苗与TLR4受体的为了检查TLR4（作为受体，PDB ID：4G8A）和设计的多表位疫苗（ 作 为 配 体 ） 之 间 的 结 合 亲 和 力 ， 在 HPLCPro 2.0 服 务 器（cluspro.bu.edu/）的帮助下进行分子对接研究[51]。BMPPro是蛋白质-蛋白质对接的顶级工具，通过结合三个连续步骤产生结合亲和力：刚体对接，最低能量结构的聚类和通过能量最小化的结构优化[51]。2.18. 疫苗稳定性通过i-MODS工具（http://imods.chaconlab.org）[52]进行分子动力学模拟，以评估受体-疫苗复合物在生物环境中的稳定性。该工具通过计算变形性、B因子、特征值、协方差和弹性网络来估计蛋白质-蛋白质复合物动力学[52]。M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006785==2.19. 计算机模拟免疫应答采用C-ImmSim （http://www.cbs.dtu.dk/services/C-ImmSim-10.1/）工具来评价工程化嵌合疫苗的真实免疫原性特征[53]。它是一种基于抗原的免疫表2跨膜拓扑 的的糖蛋白。融合蛋白质核蛋白蛋白质名称位置氨基酸糖蛋白内部1-46一种模拟器，通过结合机器TMheliX47-69学习算法和位置特定评分矩阵（PSSM）[53]。 大多数疫苗的标准规则是，室外70-602融合蛋白Inside 1两次给药之间的间隔应为4周[54]。 共TMHeliX7-29在8周时注射三次，每次1000个抗原，30-495在1、168和504个时间步（每次）首次注射后间隔24周TMheliX496-518步长等于现实生活中的8小时，时间步长1是在时间0处注射）。模拟步数参数设置为1050，其他参数保持不变参数默认值。 多样性指数D（Simpson多样性指数）索引）从生成的数字中进行解释3. 结果3.1. 最高抗原蛋白预测为了诱导细胞介导和体液免疫，必须选择病毒的高抗原性蛋白[55]。采用VaxiJen 2.0工具来评估HeV蛋白的抗原性，其通过分配得分来呈现抗原性;高于阈值（0.5）的较高得分指示较大的抗原性。根据我们的发现，与其他HeV蛋白相比，G蛋白、F蛋白和N蛋白具有最高的抗原性（表1）。因此，选择这些蛋白质以有效地诱导细胞介导和体液免疫，并进一步分析。3.2. 所选蛋白质的跨膜拓扑结构在疫苗设计中，选择的表位必须位于蛋白质的暴露区域，以激发有效的免疫应答。利用TMHMM对G、F和N蛋白进行跨膜拓扑分析，结果表明，外切-外切-内切-外切-内切-糖蛋白、融合蛋白和核蛋白的膜氨基酸序列分别为703.3. CTL表位T细胞表位大多是具有诱导免疫应答能力的小肽，并且特异性抗原识别通过由细胞毒性T细胞表达的特异性T细胞受体（TCR）发生[56]。在本研究中，我们通过NetCTL1.2工具.抗原表位应是非致敏性和非致敏性的，因为致敏性和致敏性抗原表位会影响疫苗开发的目的。因此，对预测的表位进行抗原性、免疫原性评价（补充表1、2、3）。 其中，选择同时具有阳性免疫原性和抗原性（>0.5）的表位用于进一步的变应原性和通过免疫原性和抗原性预测。AllerTop和ToX inPred工具（补充表4、5、表1HeV蛋白的预测抗原性蛋白预测抗原性核蛋白0.5308磷蛋白0.4676非结构蛋白V 0.4864非结构蛋白W 0.4667非结构蛋白C 0.3450基质X蛋白0.4332融合蛋白0.5529糖蛋白0.5367聚合酶蛋白0.4806内部519-546核蛋白外1-5326）。在此基础上，对G蛋白、F蛋白和N蛋白分别进行了免疫原性、抗原性、非致敏性和非致敏性的筛选，筛选出17、20和17个表位。HLA I类分子结合并提出这些肽可以诱导针对CD8+的细胞免疫，外来抗原因此，通过IEDB服务器的HLA I类等位基因预测工具对这些表位进一步进行相应的HLA I类结合等位基因预测（补充表7、8、9）。3.4. HTL表位辅助性T细胞是适应性免疫系统的免疫应答的关键介质，并且HLA II类分子结合并向CD4+细胞提供肽，所述肽可以诱导体液和细胞免疫应答。抗病毒药物[57]对G蛋白、F蛋白和N蛋白分别预测了55、94和26个五聚体HTL表位及其相应的HLA II类结合等位基因。使用IEDB HLA II类绑定工具。之后，评估预测的HTL表位的细胞因子诱导（即，IFN-γ、IL-4和IL-10）能力。（补充表10、11、12）。细胞因子在抗病毒免疫应答的启动和决定中起着至关重要的作用，下游效应机制。IFN-γ诱导T辅助细胞1IL-4通过多种机制如诱导细胞凋亡、激活APC、上调HLA I类和II类分子诱导Th-1应答，而IL-4则激发2型辅助T细胞（Th-2）应答[58]。IL-10是一种抗炎细胞因子，IL-10的作用取决于感染部位、病毒和抗病毒反应的时间[59]。它可以通过刺激有助于病毒清除、B细胞增殖和抗体形成的各种机制来积极平衡病原体特异性免疫应答[59]。 在流感感染中，IL-10和IFN-γ的产生促进抗流感抗体在肺粘膜中的积累[60]。仅10、6和4个HTL表位发现G蛋白、F蛋白和N蛋白分别能够诱导IFN-γ、IL-4和IL-10细胞因子（补充表13）。分别通过AllerTop和ToXinpred进一步评价了精氨酸诱导HTL表位的抗原性和毒性（表4）。3.5. LBL表位B细胞表位主要是可以被免疫球蛋白分子识别以诱导B细胞应答的蛋白质的抗原区域。B细胞表位在基于肽的疫苗设计中以及在疾病诊断中发挥重要作用[60]。B细胞表位必须是抗原性的并且表面可接近以引发足够的免疫应答。通过BepiPred线性表位预测2.0工具分别预测糖蛋白、融合蛋白和核蛋白的总共21、20和16个可变长度表位。 另一方面，IEDB的Emini表面可及性工具分别预测了糖蛋白、融合蛋白和核蛋白的13、11和9个表位（补充表14、15和16）。然后通过Vaxijen对两种工具预测的共同表位进行抗原性评价（补充表17）。M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006786表3最后从糖蛋白、融合蛋白和核蛋白中筛选出CTL表位蛋白质名称表位序列综合得分抗原性免疫性过敏性致xicityHLA I类结合等位基因糖蛋白FLPRTENY 369-377 0.9256 1.0880 0.21165否否HLA-B*15：01，HLA-A*01：01，HLA-A*30：02 HLA-B*35：01 ， HLA-A*02 ： 06 HLA-B*53 ： 01 ， HLA-B*58 ：01，百分百HLA-A*68：02，HLA-B*15：01，HLA-A*02：03（0.4193，1.0）HLA-A*02：06（0.0503，3.7）HLA-A*02：06，HLA-A*32：01，HLA-A*23：01，HLA-A*24：02，HLA-A*30：01，HLA-A*30：02，表4最后从糖蛋白、融合蛋白和核蛋白中筛选出HTL表位蛋白质表位序列位置HLA II类结合阿莱莱抗原性IFN-γ诱导IL4诱导IL10诱导变应原性致xicity糖蛋白PLRVQWRNNSVISRP 474-融合蛋白CIGLITFISFVIVEK 506-核蛋白KGKTPFVDSRAYGLR 140-154 HLA-DRB 1 *07：01 0. 4467阳性否否3.6. CTL、HTL和LBL表位最后，通过组合佐剂（121个氨基酸长的50 S核糖体蛋白L7/ L12）和17个T和B细胞表位（7个CTL、5个HTL和5个LBL）构建424个氨基酸长的多表位疫苗。表位HLA-A*68：01，HLA-B*35：01，HLA-A*26：01，HLA-A*32：01，HLA-A*23：01，HLA-A*24：02，ITIPANIGL118–1261.13571.10900.19617没有无 HLA-A*02 ： 06 ， HLA-B*58 ： 01 ， 100.00%HLA-A*68：02，HLA-B*57：01，HLA-A*32 ： 01 ， HLA-A*02 ： 01 ， HLA-A*02 ：03，HLA-A*30：01， HLA-A*26 ： 01 ， HLA-A*23 ：01，RIIGVGEVL258–2560.87490.74530.25802没有HLA-B*51：01，HLA-A*30：02，HLA-A*68：01，HLA-A*24：02，HLA-B*53：01，HLA-B*35：01，HLA-A*01：01，无HLA-A*32：01（0.6498，0.07）100.00%HLA-A*02：06（0.4764，0.34）HLA-B*15：01（0.4067，0.39）HLA-B*58：01（0.3085，0.68）HLA-A*02：01（0.2710，0.83）HLA-A*02：03（0.2015，2.3）HLA-B*57：01（0.1956，0.82）HLA-B*07：02（0.1941，0.65）HLA-A*68：02（0.1262，1.5）HLA-A*30：01（0.1147，1.7）HLA-A*23：01（0.0905，2.0）HLA-A*30：02（0.0673，2.0）HLA-A*24：02（0.0634，2.4）融合VMAGIAIGI蛋白114–1221.18441.12660.34535没有没有HLA-B*35：01（0.0509，2.0）HLA-A *02：03，HLA-A*02：01，HLA-B*51：01，HLA-A*68：02，HLA-B*58：01，HLA-B*15：01百分百ISIVPNFVL309–3171.59730.92480.19077没有无HLA-B*58：01，HLA-B*57：01，100.00%HLA-B*08：01，HLA-A*32：01，HLA-A*02：06，HLA-B*51：01，HLA-A*68：02，HLA-无HLA-B*08：01，HLA-B*15：01，100.00%HLA-B*15：01，HLA-A*24：02，M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006787在合适的位置通过特异性接头进行融合，例如，EAAAK接头用于连接佐剂和第一CTL表位，即369FLPRTESTAY377，118ITIPANIGL126，362LYFPAVGFL370，114VMA-GIAIGI122，309ISIVPNFVL317，407NMQAREAKF415，321KFAPGGYPL329被发现被最高数量的HLA I类等位基因识别M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006788-具有最高的免疫原性和抗原性，和非变应原性的被选为多表位疫苗设计的潜在表位（表3）。我们选择了100%保守的5个高度保守的抗原HTL表位即474PLRVQWRNNSVISRP488，473DPLRVQWRNNSVISR487，506CIGLITFISFVIVEK520，508GLITFISFVI-VEKKR522、140KGKTPFVDSRAYGLR154具有诱导所有三种细胞因子的能力（表4）。此外，100%保守的5个LBL表位具有最高抗原评分165PLPFREYRPI 174、372RTEF-1。QYNDS380，48IKSNPL54，402GRQDNNMQAREA413，427QDIDEEEEPI436用于疫苗设计（表5）。3.7. 所选表位的保守性和群体覆盖率分析保守性表示蛋白质序列的特定区域，其代表表位并显示具有特定同一性水平的可用性。评估了大多数潜在表位的保护性，因为在疫苗设计中，表位必须显示出相当大的保护性[61]。HLA I类和II类等位基因的表达在不同种族间存在显著差异，因此评估HLA等位基因分布（人群覆盖率）是合理疫苗设计的重要标准[61]。如果表位在特定人群中以100%或接近100%的频率与HLA等位基因结合，则这些表位被认为是用于疫苗设计的合理表位。最后，计算了所选12个T细胞表位（7个CTL和5个HTL）及其相应HLA等位基因的个体和组合群体覆盖率，如补充表18所示。CTL和HTL表位的全球人群覆盖率分别为92.8%和34.78%。在这项研究中，由于CTL和HTL表位均用于构建疫苗，因此重点关注组合人群覆盖率。结果表明，在秘鲁，发现95.3%的组合人群覆盖率和99.9%的个体将对所选表位产生应答。澳大利亚的人口覆盖率为85.05%，病毒首次出现。2）的情况。3.8. HLA-A*24：02与CTL表位分子对接模拟研究是检查受体和配体分子之间的相互作用和计算结合亲和力的最佳方法。为了获得最大的群体覆盖率，选择对最大数量的等位基因显示结合亲和力的表位是疫苗设计的先决条件。在这项研究中，我们选择了实验验证的HLA-A*24：02，其与大多数选定的表位具有结合相互作用。选择7个CTL表位与HLA-A*24：02进行分子对接。对于每个表位生成总共9个结合模型，并且根据氢键的数量和结合能选择最佳结合模型。最佳模型及其结合能、氢键数和相互作用残基如图所示。 3并列于表6中。3.9. 多表位疫苗构建体最后，通过组合两种佐剂（130个氨基酸长的50S）表5最后从糖蛋白、融合蛋白和核蛋白中筛选出LBL表位图二. 所选CTL和HTL表位的组合群体覆盖率。 X轴表示合并的人口覆盖率（HLA I和II），Y轴表示国家名称。红点表示HeV首次出现的区域。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）核糖体蛋白L7/L12和41个氨基酸长的人β-防御素）和17个T和B细胞表位（7个CTL、5个HTL和5个LBL）。表位通过特定的接头在适当的位置合并，例如，GPGPG接头用于在疫苗的N-末端连接第一佐剂，AAY和GPGPG接头将CTL内表位、HTL内表位和LBL内表位连接在一起。佐剂和表位与其连接接头的排列如图1所示。 四、3.10. 多表位疫苗构建体为了在施用后引发足够的免疫应答而没有任何副作用，疫苗构建体具有高度抗原性和免疫原性、非毒性和非过敏性是至关重要的先决条件[55]。 结果将疫苗构建体标记为可能的抗原和免疫原以及非过敏原（表7）。基于理化性质的评价，预测疫苗构建体在大肠杆菌中过表达后是稳定的、碱性的、亲水的、热稳定的和高度可溶的此外，发现疫苗在哺乳动物网织红细胞（体外）中的半衰期为30 h，在酵母（体内）和大肠杆菌（体内）中的半衰期分别为20 h和10 h。理化参数分析结果见表7。3.11. 疫苗构建体的二级和三级结构预测经PSIPRED分析后，结果表明，在疫苗构建体中，由242个氨基酸形成无规卷曲，由148个氨基酸形成α-螺旋，仅由34个氨基酸形成β-链。总体二级结构预测结果表明，57.07%为无规卷曲，34.90%为α-螺旋，8.01%为β-链（补充图）。 ①的人）。通过I-TASSER针对疫苗蛋白生成总共5个模型，并且基于预测的C评分（0.89），选择模型1。 C-得分是指模型的预测质量一般位于蛋白质名称表位序列位置长度抗原性保护协会糖蛋白PLPFREYRPI165–174101.3026百分百RTEYNDS372–38091.1542百分百融合蛋白IKSNPL48–5361.3014百分百核蛋白GRQDNNMQAREA402–413121.086百分百QDIDEEEEPI427–436100.5533百分百M.I. Hossan等人医学信息学解锁25（2021）1006789图三. 以HLA-A*24：02为表面，CTL表位为粘性形式的分子对接模拟研究。1. HLA-A*24：02和FLPRTECHNOLOGY 2。HLA-A*24：02和ITIPANIGL 3。HLA-A*24：02和LYFPAVGFL 4。HLA-A*24：02和VMAGIAIGI 5。HLA-A*24：02和ISIVPNFVL 6。HLA-A*24：02和KFAPGGYPL 7。HLA-A*24：02和NMQAREAKF。表6CTL表位与HLA-A*24：02的分子对接模拟结果债券Q156、T163、F1、Q8、T163、K66、H114、Y123、Y159、Y116、K146、R402 ITIPANIGL-7.1 07 K66，T73，