埃及Mansoura大学医院CRKP耐碳青霉烯菌株的病因特征与耐药机制分析

埃及基础与应用科学杂志4（2017）37完整文章Mansoura大学医院重症监护病房分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的患病率和特征DaliaMoemen，Doaa T.马萨拉埃及曼苏拉大学医学院医学微生物学和免疫学系1. 介绍肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae，K.肺炎杆菌）是一种革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，其在急性护理环境中，特别是在免疫功能低下的患者中具有显著的发病和死亡的巨大潜力[1]。此外，K.肺炎是世界范围内显示出多重抗生素耐药性的最常见生物体之一[2]。这些细菌很容易通过质粒和转座子获得和转移耐药基因[3]。这些基因的获得导致产生β-内酰胺酶，其中超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是最常见的[3]。ESBLs能够水解超广谱青霉素、头孢菌素和单环内酰胺类抗生素，使得碳青霉烯类b-内酰胺抗生素成为唯一的治疗选择，因此碳青霉烯类抗生素被用作治疗这些多重耐药微生物引起的感染的最后手段[4，5]。然而，已经出现了耐碳青霉烯的肠杆菌科，最常见的是耐碳青霉烯的克雷伯氏菌。肺炎（CRKP），由于抗生素使用率高、患者自我用药和医院缺乏抗生素政策的实施，其在全球范围内流行[6]。描述的碳青霉烯耐药机制包括产生不同种类的碳青霉烯酶、外膜孔蛋白突变的AmpCβ-内酰胺酶的过度产生、孔蛋白突变或药物外排的ESBL产生.碳青霉烯酶的产生是最常见的碳青霉烯耐药机制，K. pneumoniae [8]. 碳青霉烯酶是能够水解所有β-内酰胺抗生素的β-内酰胺酶，包括单环内酰胺类、超广谱头孢菌素和碳青霉烯[9]。最常见的碳青霉烯酶包括维罗纳整合子金属β-内酰胺酶型（VIM）、亚胺培南酶（IMP）型、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）、苯唑西林酶-48（OXA-48）和新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1），分别由碳青霉烯耐药决定基因bla VIM、bla IMP、bla KPC、blaOXA-48样和bla NDM编码[10]。表型试验用于鉴定碳青霉烯酶的活性，而分子试验已开发用于鉴定*通讯作者：曼苏拉大学，微生物学系，医学院，Elgomhouria街，Mansoura35516，埃及.电子邮件地址：dr_daliamoemen@yahoo.com（D. Moemen）。碳青霉烯酶编码基因[10，11]。疾病控制和预防中心（CDC）对医院监测数据的分析表明，所有克雷伯菌属分离株中有8%对碳青霉烯耐药[12]。其他研究表明，在住院患者中鉴定的克雷伯菌分离株[13]。在埃及，碳青霉烯类抗生素耐药性正在出现并令人担忧，一项研究报告在44.3%的克雷伯菌中检测到碳青霉烯类抗生素耐药性。苏伊士运河大学医院的肺炎分离株[14]。碳青霉烯类抗生素耐药性的检测对于正确选择抗生素治疗以及感染控制措施至关重要以防止耐药菌株在医院环境中传播。因此，本研究旨在确定临床肺炎克雷伯菌中碳青霉烯类耐药和碳青霉烯酶编码基因的流行情况。从Mansoura大学医院（MUH）重症监护病房（ICU）患者中获得的肺炎分离株，考虑到碳青霉烯类在我们机构的ICU中经常用作经验性治疗。2. 受试者和方法2.1. 研究设计这是一项横断面研究，时间为2015年1月至2016年3月。 所有患者均入住MUH的不同ICU，并已证实感染K。pneumoniae的患者入组本研究。ICU床位数从4到27不等，中位数为10。本研究经曼苏拉大学医学研究伦理委员会批准进行。2.2. 病例定义一个病人的培养阳性的K。肺炎克雷伯氏菌被认为有感染，如果K。 从无菌部位（例如，血液、腹膜液、脑脊液或胸膜液）与感染的临床体征和症状的组合。根据临床症状和体征（咳嗽、呼吸困难、发热）、胸部X线片上浸润的表现以及脓性气管分泌物或支气管肺泡灌洗液中大量微生物生长（>104菌落形成单位/ ml）诊断肺炎。在革兰氏染色后检查这些样本，以检测和定量白细胞和微生物。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2017.01.0012314- 808 X/©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas38D. Moemen，D.T. Masallat/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 4（2017）37-41×尿路感染的诊断需要分离至少10000个微生物/ml，与以下至少两种相关：排尿困难;频率;和/或脓尿（每个高倍视野>10个白细胞）[15]。2.3. 样本采集和处理样本根据感染部位不同而不同;它们包括血液、腹膜液、尿液、呼吸道分泌物、伤口拭子和脑脊液。每例患者仅包括一个分离株在采集后1-2 h内，在微生物学诊断和感染控制室（MDICU）处理所有采集的样本2.4. 分离和鉴定K.肺炎通过血液和麦康凯琼脂平板（oxoid，UK）上的菌落形态、革兰氏 染 色 膜 、 包 括 氧 化 酶 、 运 动 性 、 吲 哚 、 甲 基 红 、 voges-proskauer、柠檬酸盐和尿素酶试验的生物化学反应进行细菌鉴定至物种水平Hazelwood，MO）。2.5. 抗生素敏感性测试按照CLSI M100-S24[16]的建议，采用纸片扩散法在Muller-Hinton琼脂上测定敏感性特征。使用由（Oxoid，UK）提供的以下盘：亚胺培南（IPM）（10μg）、美罗培南（MEM）（10μ g）、厄他培南（ERT）（10μ g）、阿莫西林/克拉维酸（AMC）（30μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）（110μ g）、头孢他啶（CAZ）（30μ g）、头孢吡肟（FEP ）（30μ g）、环丙沙星（CIP ）（10μg）、庆大霉素（CN）（10μ g）、阿米卡星（AK）（30μg）。CRKP定义为K。根据CLSI定义的折点，对厄他培南检测为中间或耐药的肺炎分离株[16]。2.6. 碳青霉烯酶产生碳青霉烯酶的产生通过以下试验来证实：a）改良的霍奇试验（MHT）：将0.5McFar-1标准的E.制备大肠杆菌ATCC 25922（添加0.5- 4.5ml盐水）并在整个平板上划线拭子。然后，将10L厄他培南盘置于测试区域的中心。将供试分离株从圆盘上沿直线划线，盘子的边缘根据CLSI（2014）[16]对阴性和阳性检测进行解释。b）硼酸协同作用测试：通过划线0.5McFarland标准悬浮液进行测试分离物的量。然后将10μ g厄他培南和400μg苯基硼酸（PBA）盘置于接种板上，中心与中心间隔15 mm，并孵育24小时。认为在卡巴培南纸片和硼酸纸片之间存在增强的生长抑制区对于KPC酶产生是阳性的[17]c）乙二胺四乙酸（EDTA）测试：将测试分离物的0.5McFarland标准悬浮液涂布在Mueller Hinton琼脂平板的表面上。将两个10μ g厄他培南圆盘放置在琼脂上，间隔15 mm中心到中心。将10μ l的0.5 M EDTA加入到其中一个厄他培南盘中，以获得750μ g浓度，并在37℃下孵育过夜抑菌圈直径增加大于用EDTA增强的纸片中的5 mm被认为对金属-b-内酰胺酶的产生是阳性的[18]。2.7. 碳青霉烯酶编码基因使用CDC方案通过煮沸法进行DNA提取[19]。采用聚合酶链反应（PCR）技术在热循环仪（MJ Research，Inc.，美国）。使用Karuniawati等人（2013）[7]描述的引物和条件扩增基因blaIMP、blaVIM、blaKPC、blaOXA-48-like和blaNDM-1。将1μ L体积的模板DNA加入到包含12.5 μL Taq PCR Master Mix的最终体积为25μL的（发酵，英国），其中，1PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl 2、0.15 mmol/L dNTP和1.25 IU Taq DNA聚合酶，每种引物1 L 0.8l mol/L（OXA 0.4l l除外），9.5 L无菌蒸馏水。引物对进行了测试，单一PCR（对于blaNDM-1基因，仅筛选一个基因）和多重方法。在1.5%琼脂糖凝胶中通过电泳分析扩增子。2.8. 数据分析数据分析在STATA版本12中进行。产出以表格形式按比例和百分比3. 结果3.1. 患者和分离株特征本研究包括125例确诊为K。肺炎感染，其中42例为CRKP感染。从23名男性和19名女性患者中获得CRKP分离株患者通常为老年人（中位年龄为60岁，范围为43呼吸道样本（62%）是CRKP的主要来源，其次是尿液（14%）、伤口（9.5%）、血液（9.5%）和导管头端（5%）样本。3.2. 药敏使用CLSI（M100-S24）推荐的碳青霉烯判读的当前折点，125例中有42例（33.6%）K。 肺炎分离株对厄他培南不敏感（中间和耐药）。对美罗培南和亚胺培南的不敏感率分别为25.6%和20%。供试药物的完整图谱见表1。两株分离株对所有检测抗生素均耐药（泛耐药），但这些分离株对最后使用的抗生素粘菌素和替加环素的临床反应3.3. 基于表型检测用MHT法检测26/42（61.9%），硼酸法检测22/42（52.4%），EDTA法检测5/42（11.9%）。18株分离株对MHT和硼酸法均呈阳性。总体而言，42例CRKP中的35例（83.3%）对一种或多种碳青霉烯酶的产生呈阳性。分离株中碳青霉烯酶活性的详细信息见表2。3.4. 碳青霉烯酶基因基于PCR检测，39/42株CRKP分离株对一种或多种碳青霉烯酶基因呈阳性，而在3株供试分离株中未检出任何供试碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM-1、blaIMP此外，根据MHT、硼酸和EDTA检测，这三种分离株在表型上不表达碳青霉烯酶。这些分离株的碳青霉烯类耐药性可能是由于ESBL和外膜蛋白（ESBL/Omp）变化的组合[20]。在39株携带碳青霉烯酶基因的分离株中，有5株（12.8%）携带两种或两种以上的基因。如表3所示，最普遍的基因是blaKPC47.8%，其次是blaVIM-1D. Moemen，D.T. Masallat/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences （2017）3739表1CRKP分离株的药敏模式。抗生素CRKP分离株（n. =42）易感n.%中间n.%耐n.%厄他0037.13992.9美罗培南1023.824.83071.4亚胺培南1740.5002559.5头孢呋37.1716.73276.2头孢他152.7004197.6头孢霉素000042100Cefepime1740.51228.61330.9哌拉西林/他唑巴坦0012.44197.6大霉素3173.837.2819.0米卡星1945.212.42252.4Ciprofloxacin24.8004095.2表2CRKP分离株表型试验阳性。测试CRKP分离株（n. = 42）n.%MHT2661.9硼酸2252.4MHT和硼阳性1842.9EDTA511.9总3583.3表3CRKP分离株中碳青霉烯酶编码基因的分布碳青霉烯酶编码基因基因总数n.%blaKPC2247.8blaVIM-11021.7BlaIMP715.2blaOXA-48样510.9blaNDM-124.3基因总数4610021.7%，blaIMP 15.2%，blaOXA-48样10.9%和blaNDM-1 4.3%。每个分离株的基因数目示于表4中。3.5. 碳青霉烯类抗生素耐药表型与基因型的相关性研究在26株MHT阳性分离株中，仅18株PCR检测KPC阳性，5株OXA-48阳性22株硼酸阳性菌中，18株MHT阳性，20株PCR阳性。EDTA法检测金属β-内酰胺酶阳性的5株菌，PCR法均为阳性（IMP4株，NDM-1 1 1株）.EDTA试验检测金属β-内酰胺酶，尤其是IMP和NDM-1的准确性更高表4每个分离株的基因数。4. 讨论我们的研究结果显示了中东地区令人担忧的抗菌药物耐药性趋势，因为CRKP在K中的患病率为33.3%。 肺炎分离株。先前的埃及文献显示CRKP分离株的患病率为44.3%[14]，其他文献报告的发病率较低，埃及国家癌症研究所为13.9%[21]，爱资哈尔大学医院为14.2%[22]。类似地，其他研究显示纽约和希腊的患病率从20%到40%不等[23，24]。在美国的一项研究中显示了83%的更高结果[25]。本研究中CRKP的高趋势可归因于我们机构在ICU中频繁使用碳青霉烯类作为经验性治疗，以及缺乏抗菌药物管理计划的实施我们的研究受试者是ICU住院患者，因为在之前的研究中记录了ICU住院是CRKP获得的主要风险因素[26]。在本研究中，痰液样本是CRKP的主要来源这些发现与印度尼西亚的一项研究观察到的结果相似，其中痰液中携带碳青霉烯酶编码基因的细菌数量最多[7]。这可能是由于多重耐药克隆的交叉感染或呼吸道微生物群长期暴露这些耐药微生物可能会导致呼吸道感染[27]。在本研究中，根据更新的CLSI标准，对厄他培南不敏感用于CRKP分离株的监测。建议使用厄他培南筛查肠杆菌科中的碳青霉烯耐药性[28]。Endimiani等人（2009）报告称，近60%的CRKP分离株对IPM或MEM敏感，对厄他培南耐药[29]。本研究中收集的分离株对β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类高度耐药CRKP的抗生素耐药性显示出令人担忧的趋势，因为2例患者出现泛耐药分离株。因此，迫切需要为CRKP开发新的抗微生物药物，特别是严格的感染控制措施手部卫生到控制的交叉感染K.肺炎。在42个CRKP等位基因中，lates基因为blaKPC，占43.5%，这与之前在埃及的研究中观察到的结果不同，在埃及，blaOXA-48样类型占28.6%，bla KPC仅占19%[30]。OXA-48基因的检出率为10.9%。自从这种基因在土耳其出现后，中东和CRKP分离株数量基因/分离株存在的基因北非已成为水库，并扩展到印度、塞内加尔和沙特阿拉伯[31，32]。我们的结果只检测到两个（4.3%）1 3 NDM-1、VIM-1、KPCVIM-1、OXA-48、KPCVIM-1、OXA-481 2IMP，NDM-120 KPC、6 VIM、6 IMP、2 OXA-48blaNDM-1基因。在我们的研究中观察到的blaNDM-1基因的低流行率与Morsi等人的一致，在那里，2.4%的CRKP分离株[30]。此外，blaNDM-1基因与其他碳青霉烯酶基因在两个分离株中同时存在，这解释了为什么这些分离株40D. Moemen，D.T. Masallat/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 4（2017）37-41是耐泛烤面包的。当比较表型检测与PCR结果时，我们注意到在26株MHT阳性分离株中，PCR检测18株blaKPC阳性，5株blaOXA-48样阳性假阳性结果（3株分离株）可能是由于ESBL对碳青霉烯的水解，以及其他人报告的孔蛋白表达被破坏[33 ，34]。相反，如Miriagou etal.（2010）[11]所报告，假阴性结果（4株分离株）可能是由于存在碳青霉烯酶活性较弱的产金属β内酰胺酶分离株。MHT在检测OXA-48方面比KPC碳青霉烯酶更有效。该观察结果与其他观察结果一致，其中MHT对检测OXA-48碳青霉烯酶具有高灵敏度[35]。在硼酸检测的22株分离株中，20株经PCR检测为阳性如前所述，2株分离株中不存在KPC可解释为硼酸可检测其他A类碳青霉烯酶，如IMI、Sme、NMC和GES[36]。在我们的研究中，EDTA试验检测的5株分离株中，PCR均为阳性，而PCR检测的金属β-内酰胺酶大多数被EDTA试验漏诊这一结果与Khosravi的一项研究报告一致等人（2012）[37]，其中EDTA试验显示100% 敏感性，因为EDTA试验检测的所有分离株均为PCR阳性然而，他们观察到43.1%的低特异性MHT的主要局限性是耗时长，不能区分blaKPC和ESBL产生菌Omp变异株。这一观察结果已被其他人报道，但没有明确的解释[20，34]。硼酸可以提供超过MHT的一些准确度，但仍然耗时。这些局限性表明多重PCR可用于碳青霉烯酶的最佳检测和早期选择适当的抗生素。5. 结论CRKP分离株的传播对我们的医院构成了严重威胁，这促使开发新的CRKP抗菌剂，以及严格的感染控制措施，包括手部卫生宣传、患者 使用更新的厄他培南CLSI折点，通过纸片扩散法进行的药敏试验检出了大多数碳青霉烯类不敏感的克雷伯菌。pneumoniae分离株，而不需要其他表型测试。多重PCR是检测碳青霉烯酶基因的有效方法，克服了表型检测的局限性。资金一个都没有。相互竞争的利益未申报。引用[1] 悉尼MF。厌氧革兰氏阴性杆菌。In：Sherris JC，Ryan KJ，Ray CG，editors.传染病导论。New York：McGraw Hill; 2004. p. 2004年。[2] PournarasS，Poulou A，Voulgari E，Vrioni G，Kristo I，Tsakris A. 肺炎克雷伯菌中新金属β-内酰胺酶VIM-19以及KPC-2、CMY-2和CTX-M-15的检测J AntimicrobChemother 2010;65：1604-7.[3] 帕特森湾革兰氏阴性菌的耐药性：肠杆菌科。美国感染控制杂志2006;34：20-8.[4] Moquet O，Bouchiat C，Kinana A，Seck A，Arouna O，Bercion R，et al. 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