原发性开角型青光眼视网膜神经节细胞特异性基因调控研究

文章原发性开角型青光眼视网膜神经节细胞特异性基因调控图形摘要亮点d人iPSC衍生的视网膜类器官的大规模scRNA-seq研究D 23个亚群分布在247，520个细胞d鉴定了312个显著的视网膜神经节细胞特异性eQTLD 鉴定的与POAG作者放大图片作者：John H.阿良，JosephE.放大图片作者：Alex W.休伊特通信j. garvan.org.au（J.E.P.），apebay@unimelb.edu.au（美联社），hewitt. gmail.com（A.W.H.）简言之Daniszewski等人在源自110个人iPSC系的视网膜类器官上进行他们鉴定了97个特异于神经节细胞群体并与POAG相关的表达定性性状位点这些数据是一个宝贵的资源，可以提高我们对青光眼等遗传复杂疾病的理解。Daniszewski等人，2022，细胞基因组学2，1001422022年6月8日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100142会会开放获取文章原发性开角型青光眼视网膜神经节细胞特异性基因1，2，3，13安妮·塞纳布斯，4，13海伦娜·H.梁、2、3、韩锡坤、5、格蕾丝·E.1，2，3米·赫尔南德斯，1，2，3米·西瓦库马兰，3米·乔丹·E.Clarke，3Shiang Y.Lim，2，6Jarmon GLees，6，7路易丝·鲁尼，1，2，3勒纳·古鲁扬，1，2，3艾曼纽·苏佐，8斯图尔特·L。Graham，9Chia-Ling Chan，4UyenNguyen，4Nona Farbehi，4Vikkitharan Gnanasambandapillai，4Rachael A.McCloy，4Linda Clarke，3Lisa S. 卡恩斯，3岁David A.麦基，10，11杰米E。克雷格，8斯图尔特麦格雷戈，5约瑟夫E。鲍威尔，4，12，13，*爱丽丝佩贝，1，2，3，13，*和亚历克斯W。休伊特2，3，11，13，14，*1解剖学和生理学系，墨尔本大学，Parkville，VIC 3010，澳大利亚2墨尔本大学外科，Parkville，VIC 3010，澳大利亚3Centre for Eye Research Australia，Royal Victorian Eye and Ear Hospital，East Melbourne，VIC 3002，Australia4Garvan Weizmann细胞基因组学中心，Garvan医学研究所，Kinghorn癌症中心，Darlinghurst，NSW 2010，澳大利亚5QIMR Berghran医学研究所，布里斯班，QLD 4006，澳大利亚610狮子会眼科研究所，视觉科学中心，西澳大利亚大学，克劳利，WA 6009，澳大利亚11塔斯马尼亚大学医学院，孟席斯医学研究所，霍巴特，TAS 7005，澳大利亚12新南威尔士大学细胞基因组学未来研究所，新南威尔士大学，悉尼，新南威尔士州2052，澳大利亚13这些作者贡献相等14引线触点* 通信：j. garvan.org.au（J.E.P.），apebay@unimelb.edu.au（美联社），hewitt. gmail.com（A.W.H.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100142总结为了评估疾病特异性细胞群的转录组学特征，将来自原发性开角型青光眼（POAG）患者的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），然后分化为视网膜类器官，并与来自健康个体的成纤维细胞进行比较我们对总共247，520个细胞进行了单细胞RNA测序，并确定了簇特异性分子特征。通过比较病例组和对照组的基因表达谱，我们发现了这种致盲性疾病的新的遗传表达定量性状图谱在所有细胞类型中鉴定了总共4，443个显著位点，其中312个特异于视网膜神经节细胞亚群，其最终在POAG中退化。全转录组关联分析确定了先前与POAG相关的基因位点，并以疾病状态为条件进行分析，涉及97个统计学显著的视网膜神经节细胞特异性表达数量性状位点。这项工作突出了大规模iPSC研究的力量，以揭示遗传复杂疾病的特定背景。介绍青光眼是全球不可逆失明的主要原因，专家预测到2040年将影响约8000万人。1最常见的亚型-原发性开角型青光眼（POAG）-特征为开放的虹膜小梁网角和视网膜神经节细胞（RGC）的进行性变性，最终导致视野丧失2目前的治疗选择有限;所有治疗都是针对降低眼内压（IOP），这已被证明可以减缓但不能完全预防或逆转视力丧失。3眼压升高长期以来被认为是POAG的一个显著特征;然而，现在清楚的是，它不是疾病发展4IOP升高的患者可能不会发生青光眼性视神经病变，而IOP在正常人群范围内的患者可能会持续显著的RGC损失。5-7POAG是所有常见和复杂疾病中遗传率最高的疾病之一，8，9，许多工作都集中在解剖其遗传结构上。POAG的遗传病因是多种多样的：罕见的遗传变异，例如，myocilin（MYOC ） 10和optineurin（OPTN）11引起具有高突变率的疾病，而常见变体具有较小的效应量。全基因组关联分析（GWAS）已经确定了超过100个独立的基因座，这些基因座携带与开角型青光眼风险增加相关的常见风险等位基因，12尽管其中许多与IOP的变化13细胞基因组学2，100142，2022年6月8日，2022年作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics2，100142，2022通过改变蛋白质编码而导致疾病，常见变异主要通过基因调控的变化起作用。21绘制表达数量性状基因座（eQTL）是一种强有力的方法，用于提供常见遗传变异机制的功能证据，使变异对疾病风险的等位基因效应与基因表达的变化联系起来。为了避免虚假关联，并最好地理解基因表达变化的细胞效应，需要对与疾病病理生理学相关在青光眼的情况下，这包括小梁网细胞和RGC。正常和患病组织中RGC的分子谱将提高我们对承担疾病风险或促成青光眼发展的机制的理解不幸的是，不可能以非侵入性方式从活体供体获得RGC或对其进行分子分析。为了克服这一点 ， 体 细 胞 可 以 重 新 编 程 为 患 者 特 异 性 诱 导 多 能 干 细 胞（iPSC），22，23然后可以分化为RGC。24，25多年来，已经开发了多种方案来体外产生RGC。26人类视网膜类器官显示出与发育中的人类神经视网膜非常相似的分层细胞组织，27 -32，因此现在可以产生类器官衍生的RGC用于下游应用，包括疾病建模25、33、34和细胞移植。这些构建体也可以进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以基于其独特的转录特征区分细胞类型，并检查使用批量RNA-seq会遗漏的罕见群体。36-我们鉴定了许多细胞类型特异性和疾病特异性eQTL。利用加性线性模型，共发现4,443个eQTL与3,860个SNP相关。通过将我们的数据与全转录组关联研究（TWAS）中最近的GWAS结果相结合，鉴定出7个基因与青光眼发展显著相关。结果患者iPSC的大规模产生，分化为视网膜类器官，以及scRNA-seq我们招募了一个由183名个体组成的大型队列，其中包括健康（n = 92，其中50名为女性）和晚期POAG患者（n = 91，其中50名为女性）（表S1）。对照组活检时的平均年龄±SD为68.1±8.2岁，病例组为69.1± 14.4岁。参与者接受皮肤活检，并培养成纤维细胞并使用我们先前描述的附加型载体重编程为iPSC39基因分型数据也从参与者中产生，并且在质量控制和插补之后，产生了7，691，208个常染色体SNP，次要等位基因频率高于0.01。iPSC细胞系分批（25批，每批6 - 8个细胞系，具有相等数量的对照和POAG细胞系）在贴壁培养物中分化然后切除视网膜类器官，在悬浮液中培养7天，并在Matrigel上铺板另外2周的时间，以允许神经元细胞生长。从RGC长出，并收获用于scRNA-seq（图1A）。该时间轴是基于其他人的工作，其描述了视网膜类器官分化29的第35天RGC出现和解离的类器官铺板后第40天RGC神经突延伸3022个细胞系未分化为视网膜类器官并被丢弃（健康，11个细胞系，其中1个为雌性; POAG，11个细胞系，其中5个为雌性）（图S1）。收获来自剩余161个单独细胞系的细胞并分成25批用于scRNA-seq，每批含有来自6至8个细胞系的细胞，其中靶向捕获每系2，000个细胞。通过scRNA-seq捕获总数为330，569个细胞，并测序至每个细胞41，020个的平均读取深度（表S2）。使用基于转录组和基因型的方法的组合，将单个细胞追溯至其细胞系供体（表S3）。根据以下标准删除细胞系：基因型和虚拟核型分析质量控制失败、单基因POAG、非欧洲背景和低细胞捕获数（图S1）。如STAR方法中所述，基于scRNA-seq度量去除单个细胞。保留来自110个iPSC系（健康，56个，其中35个为女性，样品的平均值±SD年龄为67.5± 7.8岁;POAG，54个，其中33个为女性，71.8± 11.5岁）的总共247，520个细胞（健康，128，175个; POAG，119，345个）用于后续分析。从247，520个细胞中鉴定和表征23个聚类鉴定了分布在所有细胞系和条件下的23个亚群（图1B和1C）。基于典型标志物40-43，使用差异我们比较了POAG患者和健康对照之间的细胞类型分布，在校正多重检验后，未观察到组间存在统计学显著性差异（图S2;表S6）。然而，各个细胞系之间的亚群比例不同（Pearson视网膜祖细胞（RPC）占所有细胞的77.4%，分布在16个亚群中。RPC表达PAX6和S0X2转录因子，其是神经元命运的关键调节因子，44，45LHX 2，其是在视网膜发生46和胶质细胞发生47期间维持开放染色质所需的，以及RPC标志物VSX2和ASCL1（图1D和S2B）。细胞周期基因在祖细胞亚群中分布不均匀。G2/M期标志物MKi 67主要由RPC 1、RPC 2和RPC 5中的细胞表达。S期标志物PCNA分布更广;然而，大多数PCNA阳性细胞在RPC簇1、2、4和5中鉴定（图1D）。RGC是第二大主要细胞群，占整个队列中所有细胞的17.0%。基于先前的工作，RGCs通过以下基因的表达进行分类：POU4F 2、ISL 1、RBPMS、SNCG、GAP 43、NEFL/M、ELAVL4、EOMES和DCX。48-伪时间分析证实了RGC 1 -3细胞类型的谱系发育，Cell Genomics2，100142，2022年6月8日3RGC2RGC3RPC5RGC1RPC9中间神经元RPC13RPC1起源RPC3RPC15RPC6 RPC11RPC10锥RPC12镜头RPC14RPC4RPC6RPERPC2RPC7RGC2RGC3RPC5RGC1RPC9中间神经元RPC13RPC1起源RPC3RPC15RPC6 RPC11RPC10锥RPC12镜头RPC14RPC4RPC6RPERPC2RPC7文章会开放获取一B细胞分类DC细胞谱系RPC的过渡RGCRPEACHCBCPRMG透镜RPCsRGCsSOX2PAX6VSX2LHX2ATOH7FABP7HES6DLL3PTF1APOU4F2GAP43NEFMISL1EOMESSNCGRBPMSELAVL4DCXTYRP1MITFPMELTTRRPE65GAD 1TFAP 2APRDM13ELAVL3ONECUT2PROX1VSX1CABP5GRM6OTX2CRXTHRBNRLRHORLBP1AQP4SLC1A3CARBONAB LIM2AQP5MIPCYP26A1图1.视网膜类器官的产生以及细胞亚群的鉴定和表征(A) 视网膜类器官在49天的时间内从iPSC产生iPSC在前28天分化为单层，然后在3D中作为悬浮液培养7天。然后将所得的类器官接种到基质胶上并生长，直到视网膜神经节细胞在49天时开始从类器官中伸出。收获这些用于scRNA-seq。(B) 均匀流形近似和投影（UMAP）表示的细胞分为23个亚群，确定了鲁汶聚类。(C) 细胞类型和谱系的UMAP图，如通过分析单个亚群的差异表达基因和轨迹分析所确定的RGC集群形成轨迹的一个分支其他类型的细胞--视网膜色素上皮细胞、中间神经元、感光细胞和晶状体--则来自这条轨迹的另一个分支最后一个RPC，视网膜祖细胞; RGC，视网膜神经节细胞; RPE，视网膜色素上皮。(D) 每个亚群中细胞类型特异性基因标记物的平均表达热图。表达值已被缩放并转换为Z分数，基因已按细胞类型分组。AC，无长突细胞; BC，双极细胞;HC，水平细胞;MG，米勒神经胶质;PR，光感受器;RPC，视网膜祖细胞; RPE，视网膜色素上皮; RGC，视网膜神经节细胞。单个祖细胞群体（图S3），随着细胞从祖细胞状态进一步分化，POU4F2和ISL 1显示出增加的表达（图1D）。这两个基因的表达是RGC特化和分化所必需的。51RGC1和RGC2亚群中ISL1的表达高于RGC3，而RGC1和RGC3中ISL1的表达高于RGC2。RGC1和RGC3中ATOH 7的低水平表达，以及这些亚群中的细胞表达分化的RGCs的标志物，如SNCG，9111130617182741415211210192220531682 1 0RGC3RPC13RPC3RPC1起源RPC15RPC6 RPC11镜头RPC4RRPERPC7RPC14PC6RPC12锥RPC2RPC109RPCRGC1RGC2InterneuronsRPC5023456781014151620211911131819121722RPE中间神经元锥体透镜4Cell Genomics2，100142，2022会开放获取文章RBPMS、GAP 43和NEFM（图1D）表明，与来自RGC2的那些相比，这些亚群代表更成熟的RGC。我们还鉴定了表达光感受器/双极细胞（2.6%）和间神经元（1.7%;表S4）标志物的细胞。视网膜色素上皮（RPE）细胞位于一个亚群中，占所有细胞的1.3%（表S4）。 未发现Muller细胞。各种亚群在数据S1中有充分描述。这些数据与Sridhar等人的数据一致他还发现RPC和RGC是早期视网膜类器官内的主要细胞群。最后，为了直接比较我们的iPSC衍生的视网膜细胞类型与实际体细胞的相似性，我们使用scPred-一种无偏基因标记的细胞分类方法。54基于先前描述的成人视网膜RNA-seq数据集55对我们的细胞进行重新分类，并且观察到细胞类型分类之间的强烈重叠（图S3C）。亚群的轨迹分析揭示了RGC谱系我们研究了亚群在伪时间上的排序，方法是使用STAR方法中描述的弹弓包进行轨迹推断。轨迹推断揭示了由12个谱系组成的复杂分支轨迹（图1C和2A）。这些谱系中的三个（6、7和9）包含从RPC 9分支出的RGC亚群（图2A和2B）。我们通过研究与疾病和伪时间相关的基因表达模式，更详细地研究了这些谱系。RGC谱系的基因本体分析揭示了参与神经发生的基因的过度表达（图2C）。除此之外，基于疾病状态，在以RGC 3终止的谱系 （ 谱 系 7 ） 中 ， 跨 伪 时 间 的 细 胞 分 布 存 在 显 著 差 异（Kolmogorov-Smirnov检验：p = 0.028）。然后，我们使用tradeSeq57来研究该品系的性质我们鉴定了1，471个基因，其在假时间内在条件之间差异表达（Benjamini-Hochberg FDR 0.05）（表S7）。使用基因集富集分析进行这些基因的疾病本体论，58并揭示了与四种疾病途径-精神分裂症、精神病性障碍、精神健康疾病和认知障碍的关联，如疾病本体论数据库所注释的。我们还将伪时间应用于cis-eQTL作图，以确定基因型和POAG之间是否存在显著的相互作用。这揭示了一个新的eGene-HMGB 1-，其在SNP rs 9578147处具有假时间作为显著的相 互作用 项（p = 1.76× 10- 7）（ 图2D ）。 有趣的 是，HMGB1参与核小体稳定，并从受损细胞中释放并诱导炎症反应。[60]已显示其在NMDA介导的视网膜神经变性中诱导RGC死亡，[61，62]并且存在于青光眼视网膜中。63基因表达的遗传控制具有高度的细胞类型特异性我们独立地测试了每个细胞群体的cis-eQTL，并鉴定了总共4，443 个 eQTL ， 其 超 过 了 FDR 0.05 的 研 究 范 围 显 著 性 阈 值（Benjamini-Hochberg程序），并且eGene在至少30%的测试供体中表达（表1;完整结果参见表S8）。平均每个细胞亚群鉴定的eQTL的±SD为202±120（表2），表明检测eQTL的一致能力和每个群体中细胞类型的相似性，如预期的那样。我们评估了eQTL在细胞类型之间的重叠，发现大多数顺式eQTL是细胞类型特异性的（图3A）.在超过一种细胞类型中检测到3，091个具有eQTL（eGenes）的基因中的总共647个，并且这些eGenes中仅215个具有在两种或更多种细胞类型中观察到的eQTL（图3B和3C;表S9）。RPE和RPC14不具有与任何其它细胞类型的任何重叠eQTL，而RPCl和RGCl具有最大数量的重叠eQTL（27）（皮尔逊由于大多数亚群是视网膜祖细胞，非RPC亚群与RPC亚群之间共享更多的eQTL信号。两个基因在除了RPC 2-RPS 26和GSTT 1之外的所有亚群中具有eQTL（图3D）。在16个亚群中，只有GSTT1具有重叠的eQTL，表明与该eQTL相关的变异体要么彼此连锁不平衡，要么针对同一个致病变异体。在RGC亚群中检测到的约一半的eGenes（RGC 1，46.9%; RGC 2，58.9%;和RGC 3，51.1%）专属于该细胞类型，并且仅发现了这些eGenes中的7个（PPP 1 R17、RASD1、NXPH 1、IGFBPL 1、SAPCD 2、KRTAP 5-AS1和TK1在至少一个研资局亚群中（图3D）。为了鉴定在不同疾病状态下具有替代等位基因效应的eQTL，我们在第一轮分析鉴定的每个eQTL的原始线性模型中包括相互作用项（SNP：疾病状态）。基于互作项的FDR 0.05的阈值，具有互作效应的eQTL我们测试了4，443个已经用原始线性模型定位的eQTL，从这些eQTL中，我们确定了1，399个eQTL，这些eQTL有证据表明SNP等位基因效应和POAG疾病状态之间存在显著的这些eQTL中的97个对RGC谱系亚群是特异性的，并且是特别感兴趣的，因为数据表明SNP的等位基因效应由于疾病而不同（图4A;表S10）。有趣的是，发现染色体9 p21处的rs28368130（与POAG明确相关的基因座）12、64影响疾病状态为FDR p = 7.973 10- 4的RGC 1细胞群中的CDKN 2B表达。在进一步的分析中，我们确定了CDKN2B基因非零表达的供体数量存在变化，这支持了先前显示该启动子区域等位基因特异性甲基化的工作。65然后，我们检验了病例和对照的非零表达供体百分比与基因型类别之间是否存在亚型（c2，RGC1 p = 5.173 10- 11;RGC2 p = 9.423 10- 10，RGC3 p = 1.00）1.57310- 14）（图4B）。IGFBPL 1调节RGC中的轴突生长66，并且还发现在RPC 9、RGC 1和RGC 2细胞亚群中具有统计学显著的疾病-状态相互作用eQTL（图4C）。类似地，参与ER至高尔基体之间的运输并与 轴 突 生 长 相 关 的 SAR1A67 在 RGC1 细 胞 类 型 中 具 有 由rs4746023鉴定的eQTL。在POAG患者中，携带每种额外的Cell Genomics2，100142，2022年6月8日5RPC1RPC5RPC4RPC11RPC15文章会开放获取A BRPC3RPC8RPC14RPC12RPC10RPE锥RPC7透镜InterneuronsRPC2RPC9RPC13RGC3RGC2RGC1RPC6CRGC血统GO过度代表性分析蛋白靶向蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢过程突触组织RNA剪接，通过酯交换反应RNA剪接，通过与作为亲核试剂的mRNA剪接，通过剪接体前脑发育细胞投射组织的正调控神经元分化的正调控蛋白定位于膜的建立mRNA代谢过程的调控含细胞内转运蛋白复合物分解染色体分离D2.01.81.61.4HMGB1（rs9578147）RGC1A/A A/G基因型2.42.11.81.5RGC2A/A A/G基因型参与分化的细胞形态发生的调节神经系统发育的含大自噬蛋白复合物定位有丝分裂核分裂负调控神经发生神经元投射引导神经元投射发育2.252.00RGC3RPE2计数150200250300p.adjust5.78e−263.30e−196.59e−199.89e−191.32e−18轴突引导DNA复制细胞蛋白复合物分解负调控神经元分化翻译起始姐妹染色单体分离有丝分裂姐妹染色单体分离 0.0150.0200.0250.030 0.035GeneRatio1.751.50A/A A/G基因型条件对照POAG10A/A A/G基因型条件对照POAG图2.细胞亚群的轨迹分析和假时间相关疾病途径的表征(A) 使用增殖亚群构建全局谱系，RPC1作为起点，亚群RGC1、光感受器、中间神经元、RPE和晶状体作为终点。这导致了一个分支轨迹，RGC亚群-RGC 1，RGC 2，RGC 3，以及它们的祖先-RPC 9和RPC 13，在RPC 11处分割出主轨迹。(B) 分支轨迹由12个谱系组成。其中三个谱系，6，7和9，属于RGC亚群。(C) 与RGC谱系相关的途径随假时间的变化。(D) RGC1、RGC2、RGC3和RPE亚群中HMGB1 rs9578147位点基因型与表达谱的关系A等位基因的拷贝导致每个细胞平均增加1.4个转录本，这比健康对照高大约2倍（图4C）。疾病特异性基因在不同细胞类型中的差异表达鉴定了POAGRGCs接下来，我们试图评估疾病状态与转录组调控和细胞水平之间的关系，测试每个细胞群体中基因表达水平的差异。总的来说，在Bonferroni校正后，我们确定了3,118个基因，其表达在POAG病例中相对于对照组上调或我们可以确信，这些结果是由于POAG风险的遗传效应，因为在iPSC生成、分化、细胞捕获和文库制备的所有步骤中，细胞系要么在共享条件下管理，要么根据疾病状态随机化（STAR方法）。此外，没有任何环境因素z分数z分数z分数z分数6Cell Genomics2，100142，2022会开放获取文章表1.在整个队列中检测到的显著cis-eQTL的分类以及疾病状态条件检验模型eQTL数量eGenes数量eSNP数量人口4,4843,1023,892疾病4,4433,0913,860控制2,9852,3942,492POAG2,4602,0902,136基因型和表达之间的关系进行了测试，在每个基因的1 MB内的位点，使用四种不同的模型。使用所有供体的分位数标准化平均表达的Z评分来测试群体和疾病模型，并且群体模型分别用于测试对照和POAG供体。eQTL基于以下标准是显著的：FDR 0.05，基因在至少30%的供体中表达。已经发现，明确地易患POAG风险，并且不太可能解释成纤维细胞衍生的iPSC的表观遗传特征在重编程期间被重置的情况下，分化的细胞中基因表达的差异68，69关注三个RCG群体，我们鉴定了144个在POAG病例和对照之间差异表达的基因（图5A;表S10和S11）。与我们对细胞类型特异性eQTL的观察一致，68.06%的基因被鉴定为仅在一种细胞类型中非特异性表达，这加强了POAG的遗传效应具有高度细胞类型特异性的结论表2.每个亚群的前导cis-eQTL总结亚群前导cis-eQTLeGenes数量eSNP数量RPC1539539537RPC2233233232RPC3180180180RPC4377377368RPC5245245245RPC6115115115RPC7108108103RPC8268268263RPC9122122113RPC10261261257RPC11205205201RPC12227227226RPC13147147147RPC14383838RPC15208208206RGC1382382381RGC2124124123RGC3131131130Interneurons245245239感光细胞184184183RPE979794透镜777通过以下阈值过滤来自疾病模型的cis-eQTL：FDR 0.05; eGene表达>30%。基于具有最低FDR值的SNP-基因相互作用选择前导顺式有趣的是，发现TTR在所有RGC亚群中在POAG病例和健康对照之间差异表达（图5A）。已知TTR中的编码变体引起家族性淀粉样多发性神经病，其通常与青光眼相关。七十，七十一TWAS确定了青光眼的新的和完善的已知我们利用这些iPSC衍生的视网膜类器官单细胞eQTL数据与我们最近报道的多性状青光眼GWAS汇总统计，以优先考虑TWAS中的青光眼风险基因。12在以前的工作中，我们结合了多个遗传相关性状的GWAS，因此使用了整个基因组中SNP的拟南芥特异性效应大小估计值和p值。在单细胞TWAS中，我们在Bonferroni校正后鉴定了与POAG相关的七个基因（图5B）。在RGC1亚群中鉴定的5个基因中，有一个位于最近与POAG相关的基因座（染色体17q21）。在此，我们涉及KANSL 1-AS 1，其也被鉴定为RGC的主要eGene（图3B）。TWAS还发现KANSL 1-AS 1与RPC 9亚群中TWAS的结果还有助于在已知的GWAS基因座上精细定位潜在的致病基因。73，74，75，76大多数已鉴定的基因定位于先前与POAG相关的基因座。72简而言之，2号染色体上的5个TWAS基因位于GWAS报告基因BRE附近，并且共享相同的GWAS变体rs6741499（或强LD），12其也与IOP相关。其中，最高TWAS命中MPV 17编码参与活性氧代谢的线粒体内膜蛋白75，并且已发现在RGC损伤的发病机制中起重要作用[76]RGC 2亚群11号染色体上的CTD- 3074O7.5基因位于MALAT 1附近，也与垂直杯盘比相关。然后，我们将基于scRNA-seq数据的TWAS结果与批量RNA-seq数据进行了比较。先前描述了大量视网膜在具有可用的整体TWAS结果的三个基因中，在Bonferroni校正后仅KANSL 1-AS 1是显著的（P整体TWAS= 5.993 10- 6）。讨论在这里，我们提出了iPSC衍生的RGC的大规模scRNA-seq分析。我们产生了超过100个患者特异性iPSC系，并使用视网膜类器官将它们分化为RGC。在捕获超过330，000个细胞后，我们分析了来自110个个体的258，071个细胞。我们使用汇总的单细胞水平表达数据在所有细胞类型中鉴定了总共4，443个eQTL，包括312个RGCs特异性eGenes。我们测试了一个以上亚群共有的647个eGenes的eSNP之间的共享等位基因效应，发现只有215个是由于共享eQTL。与测试eGene重叠相反，该策略有助于确保共享eQTL的估计比例不会由于发生其中相同基因的表达与不同细胞类型中的两个独立eQTL相关联的情况而被夸大POAG在RGC的损失中达到高潮，并且在iPSC衍生的RGC中，我们鉴定了疾病相关基因座。分析，以疾病状态为条件会开放获取文章Cell Genomics2，100142，2022年6月8日7一400e基因在亚群B中的分布相关性300RGC2001000镜头RPC14RPERPC7RPC6RPC9RGC2RGC3RPC13RPC3锥体RPC11RPC15RPC12RPC2InterneuronsRPC5RPC10RPC8RPC4RGC1RPC10200400eGenesRPCPPP1R17（rs2284227）1.51.00.50.0A/AA/CC/C A/AA/CC/C A/AA/CC/C A/AA/CC/C基因型RPS 26（rs1131017）210C/CC/GG/G C/CC/GG/G C/CC /GG/G C/CC/GG/G基因型GSTT1（rs5760147）0.60.40.20.0A/AA/CC/C A/AA/CC/C A/AA/CC/C A/AA/CC/C基因型图3.细胞亚群特异性eQTL-细胞亚群特异性eQTL的(A) 具有显著eQTL（eGenes）的基因的最小重叠表明它们主要是亚群特异性的。(B) 对于存在于多于一个亚群中的eGene，我们比较了来自一个亚群中的原始前导eQTL的等位基因效应与用来自另一亚群的相同eGene的 eSNP调节eQTL后的等位基因效应热图表示每个测试亚群的等位基因效应之间的成对相关性散点图表示针对RGC 2调节的RGC 1和针对RPC 1调节的RGC 1中的等位基因效应-测量为β原始β值绘制在x轴上，条件β值绘制在y轴上。点的颜色显示等位基因效应的变化是否显著（红色）。(C) RGC亚群RGC1（浅橙色）、RGC2（红色）、RGC3（深橙色）和RPE（蓝色）中重要基因座的染色体图谱如果FDR 53 10-8，则标记位点显著。表S8包含了重要基因座的全部详细信息。(D) 与RPE亚群内的相应基因座相比，常见eQTL（RPS 26[rs1131017]和GSTT1[rs5760147]）和RGC排他性eQTL（PPP1R17[rs2284227]）的实例的基因型和Z分数之间的关系。CDRGC1RGC2RGC3RPE01视锥中间神经元RGC1RGC2RGC3RPC1RPC2RPC3RPC4RPC5RPC6RPC7RPC8RPC9RPC10RPC11RPC12RPC13RPC14RPC15RPE0.040.030.020.000.010.000.0000.00不UE虚假RGC1RGC2RGC3RPEeGene交叉点RGC1RGC2RGC3RPEz分数z分数vz分数v视锥中间神经元RGC1RGC2RGC3RPC1RPC2RPC3RPC4RPC5RPC6RPC7RPC8RPC9RPC10RPC11RPC12RPC13RPC14RPC15RPERGC1RGC2RGC3RPE会开放获取文章8Cell Genomics2，100142，2022LINC00311FBXO39CCINCDKN2BRP11−337N6.1IGFBPL1SAR1ACACNG7ABCA8CTD−3203P2.2ERICH1−AS1TLCD2NEUROG3RHBDL 2RP11−881M11.1RP11−807H7.2C1orf141IGFBPL1Linc00961RP11−775D22.2AC024940.1GLT6D1NAA11RP11−807H7.2HLA-DRB1VAMP2一显著的SNP-基因型相互作用12.510.07.55.01.000.750.500.250.001.000.750.500.250.001.000.750.500.250.00CDKN2B（rs28368130）每个基因型对照POAG对照POAG对照POAG条件表示不表达0.060.040.020.000.060.040.020.000.060.040.020.00每个基因型的对照POAG条件基因型A/AA/GG/G2.512.510.0CIGFBPL1RGC10.200.150.100.050.30.20.1RGC20.060.040.02RGC37.50.00T/T T T/C C C/C基因型0.0T/T T T/C C C/C基因型0.00T/T T T/C C C/C基因型5.02.50.8SAR1ARGC10.6RGC20.6RGC312.510.07.55.02.510 20−log10（P值eQTL）+10.60.40.20.02.01.51.00.5G/G G/A基因型VAMP2RGC10.40.20.01.51.00.5G/G G/A基因型RGC20.40.20.02.01.51.00.5G/G G/A基因型RGC3仅RGC eGene正确错误0.0G/G G/A基因型0.0G/G G/A基因型0.0G/G G/A基因型条件控制POAG图4.细胞亚群特异的疾病相关cis-eQTL对每个细胞亚群的每个基因的一个MBP内的所有SNP测试SNP与疾病的相互作用(A) 将RGC亚群RGC1、RGC2和RGC3中显著eQTL的p值（x轴）相对于SNP与疾病相互作用的p值（y轴）作图红色虚线表示SNP与疾病相互作用的p值阈值0.05红色的点和标签代表仅在RGC亚群中显著的相互作用(B) 基于POAG病例和对照的rs28368130基因型的CDKN2B表达谱。表达式以Z分数显示。(C) 显示以下基因的Z评分的箱形图：IGFBPL 1、SAR1A和VAMP 2按疾病和基因型分组。每个条件的回归线代表基因型和表达之间的关系。表S8包含了重要基因座的全部详细信息。涉及97个具有统计学意义的RGC eQTL，单细胞TWAS在先前与POAG相关的基因座上鉴定出7个基因。最近的几项研究已经使用scRNA-seq来表征使用胎儿组织的人视网膜发育期间的转录组学变化，50、79视网膜类器官，8042，43我们的结果补充了这些发现，并与Sridhar等人的结果他们还观察到RPC是早期类器官中的主要细胞类型，其次是RGC、光感受器和中间神经元。Lu et al. 43在我们的数据集中，视网膜类器官中没有神经胶质细胞并不奇怪，因为这些细胞通常是最后发育的视网膜细胞，83并且在老年视网膜细胞类器官42此外，我们没有观察到来自健康对照和POAG患者的类器官的细胞组成的统计学显著差异，这表明分化批次之间的高度一致性。在TWAS框架中，基因表达数据（SNP和基因之间的关联）用于训练预测模型，以通过遗传变异（遗传调节基因表达，GReX）确定基因表达水平预测模型用于基于来自多SNP预测模型的训练权重来估算GWAS数据集中的基因表达水平，其可进一步用于评估估算的基因表达水平与GWAS表型之间的关联（即，青光眼），并确定与疾病相关的基因RGC1RGC2RGC3一A/A A/GG/GRGC1 RGC2 RGC3RGC1 RGC2 RGC3−log10（P值交互作用）+1z分数z分数比例z分数z分数z分数zscorez分数z分数z分数一z分数B会开放获取文章Cell Genomics2，100142，2022年6月8日9MPV17NRBP1CTD−3074O7.5SUPT7LCCDC121KANSL1−AS1KANSL1−AS1对数10便士一B10.07.55.02.50.0123456789101112131415161718 19 20 21 22染色体图5.青光眼风险基因的优先顺序（A和B）（A）显示POAG病例和健康对照之间差异表达的基因的Volcano图和（B）显示来自scRNA-seq数据的全转录组关联分析的Manhattan图。性状在这项研究中，我们进行了第一个青光眼TWAS的基础上细胞类型特异性表达谱。不同组织之间的基因表达谱（例如，大块视网膜与属于RGC谱系的亚群）可能显著不同。在我们的TWAS分析中，来自不同亚群的单细胞基因表达数据用于训练预测模型，然后基于汇总统计量对GWAS数据集中的基因表达水平进行插补86单细胞水平分辨率TWAS可以为特定细胞类型中青光眼的潜在致病基因提供新的见解人们越来越普遍地认识到，药物开发的制药管道已经停滞，迫切需要人类疾病模型来提高我们对常见复杂疾病的分子理解，并促进临床前试验。我们通过eQTL定位研究了遗传背景和疾病状态对基因表达的影响。这项工作突出了大规模iPSC研究揭示疾病特异性特征的能力，为特定背景的药物筛选奠定了基础，并强调了使用干细胞模型解剖复杂疾病的效率。