乌藨子苷和omega-3脂肪酸对大鼠肝脏炎症和纤维化的影响

例如，《生物多样性和生物多样性科学杂志》2（2015） 65e74主办方：完整文章乌藨子苷和omega-3脂肪酸对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纳达湾Abo El-Magda，*，Amro El-Karefb，Mamdouh M.El-Shishtawya，莱拉·A Eissaa，*a埃及曼苏拉35516曼苏拉大学药学院生物化学系b埃及曼苏拉35516曼苏拉大学医学院病理学系A R T I C L E I N F O文章历史记录：收到日期：2014年11月8日2014年12月17日接受2015年1月15日在线发布保留字：肝纤维化皂苷Omega-3脂肪酸NF-κBMDAAB S T R A C T核因子κ B（NF-κB）是一种重要的转录调节因子，在慢性肝病的肝脏炎症和纤维化的发病机制中起重要作用。NF-κB活化导致促炎性和纤维化细胞因子的产生。据报道，甘草甜素（GL）抑制肝纤维化和肝硬化。ω-3脂肪酸（ω-3）具有抗炎作用，据报道，它们可以减少硫代乙酰胺（TAA）纤维化模型中的肝损伤。我们研究了GL和u-3对大鼠肝脏炎症和纤维化的影响，并阐明了这些天然化合物对NF-κB水平的影响。50只雄性Wistar大鼠随机分为5组：对照组和4组，TAA 200 mg/kg i. p.每周2次，共8周：TAA组、GL组（接受GL25 mg/kg/d经口管给药）、u-3组（每日经口管给药u-3150 mg/kg）、（GL-3u-3）组（接受两种天然化合物相似的联合剂量）。GL和u-3单独或组合保护肝脏免受TAA肝毒性作用，因为它们显著降低血清AST活性和血清总胆红素水平，它们还显著增加血清白蛋白和总蛋白水平。 GL和u-3的肝保护作用通过组织病理学分析证实，因为它们显著降低坏死性炎症评分和纤维化程度。GL和u-3均能显著降低肝组织丙二醛含量（P<0.005），肝脏NF-κ B水平免疫<组化检测其组织表达。结论：单用或联合使用的胡萝卜素和ω-3脂肪酸具有有效的抗炎、抗氧化和抗纤维化作用。版权所有2014年，曼苏拉大学。由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。*通讯作者。电子邮件地址：Dr.nada. gmail.com（N.F.Abo El-Magd），lailaeissa2002@yahoo.com（L.A.Eissa）。由曼苏拉大学负责进行同行审查。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2014.12.0052314- 808 X/版权所有2014年，曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持 这是一篇CC BY- NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp66埃及生物多样性公约和议定书科学杂志2（2015）65e741.介绍慢性肝病是较发达国家发病率和死亡率不断增加的原因[1]。大多数慢性肝病，包括病毒性肝炎（乙型和丙型），酒精性肝病和胆道疾病，最终导致肝纤维化[2]。肝纤维化是肝脏对许多慢性损伤原因的伤口愈合反应。反复肝损伤引起炎性损伤、基质沉积、实质细胞死亡和血管生成，导致进行性纤维化。瘢痕基质通常积累非常缓慢，但一旦形成肝硬化，逆转这一过程的可能性就会降低，并发症就会发生[3]。如果在早期阶段没有有效的治疗，可逆的肝纤维化将导致不可逆的肝硬化和肝细胞癌（HCC）[4]。补充抗氧化剂以降低氧化应激是预防肝纤维化的有效策略[5]。开发用于管理和治疗肝炎的靶向疗法需要更好地了解肝病发病机制中涉及的免疫应答机制[6]。抗纤维化治疗正在出现，可以减缓，停止或逆转纤维化进展[3]。甘草皂苷（GL）是甘草根提取物的主要活性成分.GL是一种糖基化皂苷，由一分子大黄酸和两分子葡萄糖醛酸组成[7]。据报道，GL用于治疗不同原因引起的慢性肝炎，如病毒感染、毒素暴露和缺血再灌注损伤[8]。GL具有有效的抗炎特性，被认为在其肝脏保护作用中发挥重要作用[9]。据报道，GL直接与高迁移率族蛋白1（HMGB1）结合，因此降低了HMGB1浓度[10]。HMGB1是一种高度保守的蛋白质，由受损或死亡的细胞释放，作为致病产物的结果。HMGB1在无菌性和感染性炎症的发病机制中起核心作用[11]。HMGB 1可通过激活TLR-4（Toll样受体-4）途径触发炎症反应，TLR-4途径激活核因子-κ B（NF-kB），因此可增强肿瘤坏死因子-κ B（TNF-κ B）、白细胞介素-1b（IL-1b）和一氧化氮的产生[12]。选择性靶向HMGB1的实验策略有效地防止先天免疫和炎症的激活，从而保护不同组织免受损伤和损害[11]。ω-3脂肪酸（ω-3）如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）是生物活性的膳食化合物。海洋来源的食物来源，如脂肪鱼，海藻，贝类，微藻和磷虾富含铀-3[13，14]。据报道，U-3补充剂用于肝损伤和脂肪变性[15]。EPA和DHA通过转化为较少的炎症介质来保护免受花生四烯酸产生的促炎分子的影响，因此EPA和DHA具有抗炎作用[16]。u-3也被报道改变炎症介质如趋化因子、生长因子和基质蛋白酶的产生[17]。肝炎受多种机制调节，如炎症信号通路和先天免疫应答[18]。炎症由宿主对感染和多种组织的先天防御机制受伤炎症过程经历不同的阶段，包括急性、适应性和消退，并且更重要的是，炎症可能变成慢性病症，如在自身免疫性疾病中[19]。NF-κB系统在调节不同细胞类型中的先天免疫应答和细胞应激中起着至关重要的作用[19，20]。在未受刺激的细胞中，NF-κB作为与抑制性κ B蛋白（I-kB）的复合物在细胞活化过程中，I-kB被磷酸化并溶解，暴露出NF-κ B的核转位位点，导致NF-κ B转位至细胞核并与DNA结合[21，22]。NF-κ B在巨噬细胞中由p65/p50异源二聚体组成，并结合各种促炎基因的启动子区，导致基因反式激活。NF-κB在促炎介质的肝巨噬细胞表达中起重要调节作用[22]。本研究旨在评价GL和u-3单独或联合应用对TAA诱导的大鼠肝纤维化的潜在保护作用，并通过其对NF-κB和氧化应激的影响来阐明其潜在的分子机制。2.材料和方法2.1.药物和化学品硫代乙酰胺和甘草素（甘草酸氨盐）来自甘草（Glabra甘草）根（Sigma-eAldrich：Sigma，St. Louis，MO，USA）. Omega-3脂肪酸，含有3：2比例的EPA和DHA（Lifeplan：Alfrethan Way，Lutterworth，英国）。2.2.动物从 “Egyptian Organization for Biological Products andVaccines”，Giza，Egypt购买50只雄性Spraguee Dawley大鼠，体重（180g和 200 g）圈养动物，并使其自由获取标准大鼠饲料和自来水一周以适应环境。本研究中描述的动物护理和实验符合“研究伦理委员会”药学院，Mansoura University，Egypt，其符合“实验动物护理原则“（NIH出版物No. 85-23，1985年修订2.3.诱导肝纤维化根据Esmat等人[23]和Furtado等人[24]的方法诱导肝纤维化。将42只雄性Sprague-Dawly大鼠腹膜内（i. p.）每周两次（第2天和第6天）连续8周注射在0.2ml无菌盐水中的新鲜制备的TAA（200 mg/kg体重）2.4.实验设计将大鼠随机分为5组：对照组（8只大鼠）：每周两次（第2天和第6天）腹腔注射0.2 ml无菌盐水，连续8周;TAA组（12只大鼠）：TAA诱导的肝纤维化组; GL组（10只大鼠）：用GL（25 mg/kg/天，通过口服管溶于67例如，《生物多样性和生物多样性科学杂志》2（2015） 65e74蒸馏水）[25]治疗8周，u-3组（10只大鼠）：用u-3（150 mg/kg/天，通过口服管）[26，27]治疗肝纤维化8周，用TAA开始，GL+u-3组（10只大鼠）：用GL和u-3（接受相似剂量）与TAA的组合治疗肝纤维化2.5.血液样本和肝组织实验结束时，大鼠禁食12 h，在轻度乙醚麻醉下，从眶后穿刺处采集5 ml血样。将凝结的血液样品以5000rpm离心5 min用于血清分离。将血清分成等分试样进行分析。处死动物，切下肝脏，用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4冲洗，并在滤纸上吸干。从肝右叶切下一小部分并固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林（pH 7.2）中用于组织病理学检查。将部分剩余肝组织在冷PBS中匀浆，然后以5000 rpm离心15 min。取出上清液用于测定丙二醛（MDA）。另一部分肝组织用冷PBS匀浆，超声匀浆器5000 rpm离心15 min，取上清液测定肝组织NF-κB。将血清样品和来自肝匀浆的上清液储存在-80° C下用于生化分析。2.6.生化分析● 使用来自Biodiagnostic（Cairo，Egypt）的商业试剂盒，血清用于测定ALT、AST活性、血清总胆红素、总蛋白和白蛋白水平● 肝组织匀浆用于通过使用来自Biodiagnostic（Cairo，Egypt）的商业试剂盒测量MDA来测定脂质过氧化，并使用来自Mybiosource（MBS 722386）（SanDiego，CA，USA）的ELISA试剂盒测定大鼠NF-κB2.7.组织病理学检查用磷酸盐缓冲福尔马林固定的肝组织，石蜡包埋后，切成4μ m厚的切片，苏木精-伊红（HE）染色，Masson三色染色，进行组织病理学检查。2.8.坏死性炎症活动分级根据Ishak活性指数[28]，评估用（HE）染色的肝脏样本的总活性和个体活性参数。根据以下参数分类：面间肝炎（片状坏死）（P1和 P4）、融合性坏死（C0和C5）、局灶性小叶坏死和变性（FN 0和 FN 4）以及门静脉炎症（PI 1和 PI 4）。2.9.纤维化区域采用形态计量学方法对Masson三色染色肝组织中胶原纤维沉积进行定量分析图1e硫代乙酰胺（TAA）（200 mg/kg，每周两次，持续8周）、胡萝卜素（GL）（每日25mg/kg）和ω-3脂肪酸（U-3）（每日150 mg/kg）单独或组合对血清ALT和AST活性的影响。数值：（平均值±SE）。**P 0.005 vs.<对照组#P 0.05，<##P 0.005 vs. TAA组。<$$P 0.005与GL组。<与u-3组相比，P <<0.05，P <<0.005。分 析 [29] 。 通 过 安 装在 BX 51 Olympus 光 学 显 微 镜（Olympus Corporation，Tokyo，Japan）上的数码相机拍摄图像用NIH Image软件提取并分析Masson三色染色的胶原区域。纤维化程度表示为纤维化面积相对于总组织面积的百分比2.10.NF-κB的免疫组化检测对于免疫组织化学，将小鼠NF-κB/65兔多克隆抗体（ThermoFisherScientific，CA，USA）应用于脱蜡和再水化的切片.通过用PBS冲洗除去未结合的一抗后，将载玻片与二抗孵育用二氨基联苯胺（DAB）试剂盒进行抗体结合分析，并使用苏木精作为复染剂。然后通过光学显微镜观察载玻片。NF-κB的表达在肝组织和炎症和纤维化区域的炎性细胞的细胞质中检测到比较不同组中的表达的分布和强度（与作为内部对照的内皮相比）以及阳性区域的分布。2.11.统计分析所有结果均表示为平均值±标准误差（SE）。采用单因素方差分析结合Bonferroni检验进行统计学分析68埃及生物多样性公约和议定书科学杂志2（2015）65e74表1e硫代乙酰胺（TAA）（200 mg/kg，每周两次，持续8周）、阿替米星（GL）（25 mg/kg）、ω-3脂肪酸（ω-3）（150mg/kg）单独或组合对血清总胆红素、白蛋白和总蛋白水平的影响价值观：(Mean±SE）。控制TAAGLU-3GL-3动物数量总胆红素（mg/dl）白蛋白（g/dL）总蛋白（g/dl）8只0.158 ±0.0293.267 ±0.0707.101 ±0.0878只0.964 ±0.0742.593 ±0.0505.648 ±0.1578只0.184 ±0.010##3.045 ±0.044##6.541 ±0.172#8只0.228 ±0.025##3.027 ±0.050##6.616 ±0.154#10只0.208 ±0.046##3.258 ±0.112##7.200 ±0.273##与对照组相比，*P 0.05，**P<<#P <0.05，##P <0.005 vs. TAA集团。群体之间的差异。小于0.05的P值被认为是显著的。使用社会科学统计软件包（SPSS）第18版进行分析。使用GraphPad Prism V 5.02（Graph-Pad SoftwareInc.，San Diego，CA，USA）。3.结果3.1.GL和u-3对肝功能的影响硫代乙酰胺可引起肝纤维化，其特征为血清ALT和AST活性图2e硫代乙酰胺（TAA）（200 mg/kg，每周两次，持续8周）、胡萝卜素（GL）（每日25mg/kg）和ω-3脂肪酸（U-3）（每日150 mg/kg）单独或组合对（A）肝脏MDA水平和（B）肝脏NF-κB水平的影响。数值：（平均值±SE）。**P0.005 vs.<对照组##P 0.005 vs. TAA组。<与对照组相比（P0.005），GL或u-3处理组ALT活性无明显变化，但AST活性明显低于TAA组（P0.05）。<<与TAA组相比，GL和u-3联合治疗分别显著降低血清ALT和AST活性（P 0.05，P 0.005），与GL或u-3组相比，血清ALT 和 AST 活 性 显 著 降 低 （ P 0.05 ） ， 如 图 所 示 <<<（图）①的人。图3e硫代乙酰胺（TAA）（200 mg/kg，每周两次，持续8周）、胡萝卜素（GL）（每日25mg/kg）和ω-3脂肪酸（ω-3）（每日150 mg/kg）单独或组合对（A）肝脏坏死炎症评分和（B）纤维化面积与总组织面积之间的%比率的影响。数值：（平均值±SE）。**P 0.005 vs.<对照组#P 0.05，<##P 0.005 vs. TAA组。<69例如，《生物多样性和生物多样性科学杂志》2（2015） 65e74图4e左侧垂直图显示TAA组中显著的坏死性炎症，其在与（GLβu-3）联合治疗后比单次治疗后减轻（桥接坏死周围的中图显示TAA组胶原沉积增加，联合治疗后胶原沉积减少（GL≥ 3）多于单次治疗（纤维桥周围的右图显示，在TAA组中，增加的NF-κB表达共定位于坏死性炎症和桥接纤维化的相同区域，而与单一治疗相比，联合治疗（GL-3）的表达显著降低硫代乙酰胺（TAA）、甘草甜素（GL）、ω-3脂肪酸（u-3）和（GL ω-3）组（放大倍数£100）。硫代乙酰胺组血清总胆红素水平较对照组显著升高（P0.005），而GL和u-3单用或联合用药组血清总胆红素水平较TAA组显著降低（<（P 0.005），GL，u-3和GLu-3组与对照组之间无显著差异，如表1所示。<硫代乙酰胺显著影响肝功能，因为它降低了肝脏合成白蛋白和其他蛋白的能力，TAA组的血清白蛋白和总蛋白水平与对照组相比显著降低（P 0.005）。<而GL和u-3单独或联合给药对肝脏有保护作用，血清白 蛋 白 和 总 蛋 白 水 平 分 别 较 TAA 组 显 著 升 高（P0.005，P0.05），而与TAA组相比，GL和u-3联合给药对肝脏无明显保护作用（P> 0.05）。<<70埃及生物多样性公约和议定书科学杂志2（2015）65e74表2e所研究参数的相关性分析AST活性总胆红素水平白蛋白水平总蛋白水平肝脏NF-κB水平AST活性（r）总胆红素水平（r）白蛋白水平（r）总蛋白水平（r）肝脏NF-κB水平（r）10.581a一-0.731 一-0.5910.626a0.581a1一-0.701一-0.6690.875a一-0.731 一-0.70110.594a一-0.685一-0.591一-0.6690.594a1一-0.5190.626a0.875a一-0.685 一-0.5191a相关性在P 0.001水平具有显著性<。GL，u-3和GL，u-3组与对照组之间存在显著差异，如表1所示。3.2.GL和u-3对肝脏脂质过氧化作用与对照组相比，硫代乙酰胺导致肝脏MDA含量显著增加（P<0.005），而与TAA组相比，GL和u-3单独或联合给药显著降低了升高的MDA水平（P <0.005），如图所示。 2 A）。3.3.GL和u-3对肝脏NF-κB含量硫代乙酰胺组肝组织NF-κB含量明显高于对照组与

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