医学信息学解锁25（2021）100673OprF-OprI-PopB嵌合免疫原的功能构建及其与GM-CSF的交叉保护性研究铜绿假单胞菌：一项全面的免疫信息学评价Fattaneh Sabzehalia，Hamzeh Rahimi b，Hossein Goudarzia，**，MehdiGoudarzia， *，Mohammad Hossein Yoosefi Izada，Alireza Salimi Chirania，Seyed Amir Jalali c，易卜拉欣·法吉赫卢aa伊朗德黑兰Shahid Beheshti医科大学医学院微生物学系b生物技术研究中心分子医学部， 伊朗巴斯德研究所，伊朗c伊朗德黑兰Shahid Beheshti医科大学医学院免疫学系A R T I C L EI N FO保留字：铜绿假单胞OprF-OprI-PopB候选疫苗GM-CSF的免疫信息学ELISAA B S T R A C T铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）是烧伤、囊性纤维化、住院和免疫缺陷患者中的机会致病菌。通过计算机模拟算法，从铜绿假单胞菌的外膜蛋白（OprF和OprI）和3型分泌系统（PopB）设计了有效的疫苗，以克服实验室障碍和储存时间，降低成本，并实现更高的性能。本研究的目的是构建、表达和评价含有OprF、OprI和PopB（FIB）的重组蛋白。我们结合了计算机免疫信息学，同源建模，分子对接和分子动力学（MD）模拟。研究了172个候选亚基中的线性和构象B细胞表位和T细胞表位，其 中 最 好 的 16个 被 认 为 可 以 产 生 多 表 位 疫 苗 。 最 终 实 现 了 “NATAEGRAINRRVE“OprF 的 305-318 位 和“KAANRQADVQESRAD“PopB的730-744位的表位作为配体与HLA DRB 1 *04：01作为受体之间的稳定该疫苗构建了含有66个B细胞表位和106个T细胞表位的794 aa多表位疫苗IgG（G1、G2a和G2b）水平和采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测攻毒前后IgA抗体滴度及IL-17、IFN-γ和IL-4细胞因子水平。由于增强主动免疫应答，FIB抗原与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）配制成强效的佐剂。IgG 1、IgG 2a、IgG 2b抗体、细胞因子IL-17、IL-4和IFN-γ水平的比较表明，针对铜绿假单胞菌嵌合FIB抗原的Th 1和Th 2导向应答率较高。FIB抗原在佐剂存在下是一种有效的IgA诱导剂此外，抗FIB和FIB-GMCSF的免疫原性应答也是免疫原性的。揭示了GM-CSF在增强体液和细胞介导的免疫应答中的有用性质。我们的研究结果强调，FIB加GM-CSF免疫将是有用的免疫原性物质治疗铜绿假单胞菌感染。1. 介绍铜绿假单胞菌是一种常见的兼性需氧致病菌，具有多重耐药特征。这种病原体在免疫功能低下的人群中引起广泛的感染包括烧伤、插管和其他住院患者[1]。它在几乎33%的烧伤伤口和59%的严重烧伤伤口中定植[2，3]。 十多年来进行的几项研究42烧伤 患者 之间 他们， 铜绿假单胞菌是 初级引导* 通讯作者。Shahid Behesthi医科大学医学院，Koodak-yar街，Daneshjoo Blvd，Velenjak，Chamran HWY，德黑兰，伊朗.** 通讯作者。伊朗德黑兰Shahid Beheshti医科大学医学院微生物学系电 子 邮 件 地 址 ： sabzehali@sbmu.ac.ir （ F.Sabzehali ） ， gmail.com （ H.Rahimi ） ， novelty@sbmu.ac.ir （ H.Goudarzi ） ， gudarzim@yahoo.com（ M.Goudarzi ） ， civick@gmail.com （ M.H.Yoosefi Izad ） ， alireza. gmail.com （ A.Salimi Chirani ） ， Jalali5139@yahoo.com （ S.A.Jalali ） ， gmail.com（E.Faghihloo）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100673接收日期：2021年6月11日;接收日期：2021年7月14日;接受日期：2021年2021年7月21日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuF. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006732----烧伤感染[3]。即使随着抗微生物药物的改进，根除这种病原体也变得越来越困难[4]。针对铜绿假单胞菌的疫苗扩展将是预防感染的绝佳选择。尽管通过在临床前实验中使用该生物体的各个部分和单克隆抗体开发了不同的实验疫苗，但只有少数物质进入了治疗阶段。由于铜绿假单胞菌分离株的高度多样性，这些疫苗均未获得市场批准[5，6]。到目前为止，基于3型分泌系统（T3SS）、外膜蛋白、胞外蛋白、多糖、脂多糖、多糖缀合物、鞭毛、菌毛、Pcrv、Psl和其他颗粒检查了各种疫苗候选物[7]。目前，该微生物由于铜绿假单胞菌对各种抗生素的多重耐药分布是显著的;因此，有限的替代品，如POLYMYXin B和粘菌素，仍然有可能治愈[9]。因此，激发保护性抗体和细胞介导的免疫应答的适当方法已经确定了疫苗[10]。尽管用各种铜绿假单胞菌抗原进行的疫苗接种已经历了数年，但没有非常实用和有希望的疫苗结果[11]。扩张的更关键的障碍 铜绿假单胞菌的安全疫苗是多种毒力因子。由于缺乏合适的动物模型，制作真正的模型是严格的。设计安全疫苗的另一个困难通常是在特定患者群体中区分铜绿假单胞菌的定殖和感染 [12 ]第10段。几研究示 的的抗原铜绿假单胞菌，例如，藻酸盐、FliC、PilA、PilQ、OprL、Psl、PcrV、主要表面蛋白（OprF）、PopB、脂蛋白I（OprI）和各种细胞相关颗粒，其被研究以增强对该病原体的不同菌株的免疫力[13，14]。在这些抗原中，OprF、OprI（OprF/I）和PopB这三种抗原在保护性免疫应答中具有中心功能。OprF和外膜脂蛋白I（Opr I）的免疫原性防御的基本机制在铜绿假单胞菌的所有分离株中是分离株独立的并且极其保守的。动物模型研究表明，OprF/I融合蛋白疫苗可诱导各种免疫效应物，包括调理吞噬杀伤抗体[15，16]，其干扰免疫应答。 毒力机制[17]。此外，Opr I作为载体促进抗原递送至粘膜抗原呈递细胞[18]。PopB作为T3SS的结构舱，直接注入了在某些实施方案中，细胞因子可以将多种效应物引入宿主细胞以调节和破坏细胞功能[19]。Wu指出，PopB可以激发强大的辅助性T细胞17型（TH17），并直接诱导中性粒细胞募集[20]。PopB需要孔结构和效应分子穿过宿主细胞质膜的转运。Wu在2012年揭示了用纯化蛋白质与Th17佐剂可德兰组合鼻内免疫小鼠可以刺激高IL 17产生，这导致中性粒细胞向炎症部位的募集增加，并保护鼠模型免受铜绿假单胞菌的致死性肺炎[21]。由于OprF和OprI没有有效地激发免疫应答，我们认为添加PopB可以产生更好的应答。为了评估该疫苗的安全性，安全性和有效性，我们分析B、T细胞表位的序列多样性、抗原性、免疫原性。FIB的三维（3D）结构通过同源建模和从头算方法建模、细化和验证，以研究不连续表位的构象冲突和预测。此外，进行分子动力学（MD）模拟以识别FIB蛋白的结构特征和稳定性以及依赖于B细胞和T细胞活化的T细胞表位配合物在目前的研究中，计算机验证的结果表明FIB蛋白构建体是稳定的，并为针对P.铜绿。GM-CSF可以增强T细胞免疫应答的诱导、B细胞的发育、多种细胞因子的产生，包括IL- 12和免疫增强[22]，优选作为FIB候选疫苗的合适佐剂。本研究的目的是基于包含OprF/I和PopB的重组融合蛋白的免疫原性特征，在烧伤大鼠模型中产生广泛的、防腐的、三价疫苗，所述重组融合蛋白伴随有作为针对铜绿假单胞菌2. 材料和方法在本项目中，为了设计疫苗候选物，在第一步中研究了序列一致性和基因多样性。随后，预测了表位和免疫原性区域采用同源模建、从头算和分子动力学模拟进行结构分析。HLA-表位结合通过HLAPro软件进行并对嵌合FIB蛋白与GM-CSF的免疫原性和交叉保护性进行了评价。图中所示的工作流程。1.一、2.1. 蛋白质序列的检索与基因多样性OprF 、 OprI 和 PopB （ FIB ） 的 蛋 白 质 序 列 从 UniProt 数 据 库http://www.uniprot.org（P13794、P11221和Q9I324）检索，并使用自制脚本进行修剪。对所选序列进行针对参考蛋白（refseq蛋白）数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的blastp以鉴定保守区域。选择得到的序列并使用多重序列比对进行比对，包括ClustalW和MUSCLE（版本3.8.31），使用默认参数[23，24]，然后使用Jalview程序（版本2.11.0）[25，26]进行可视化。MEGA X软件用于系统发育树的分析和解释[24]。2.2. 理化和免疫原性预测为了开发融合蛋白，应用（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser）[（G4S3）]作为OprF/I和OprI-PopB区域之间的整合接头使用ProtParam工具 （ www.example.com ） 评 估 FIB 序 列 的 基 本 物 理 化 学 性 质http://web.expasy 。org/protparam/ ） 。 使用VaxiJen v2.0 服 务器（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen. [27] 。 然后，通过IEDB免疫原性工具预测FIB蛋白的免疫原性特征[28]。AllerTOP（http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/），其工作原理基于代表残基丰度、大小、亲和性、α-螺旋和β-折叠形成能力的自互协方差用于鉴定变应原性[29]。 SOLpro和Protein-Sol网络工具用于确定溶解度[30，31]。此外，FIB表面可及性通过免疫表位数据库表面可及性预测（http://tools.immuneepitope.org）在默认阈值下确定。最终，使用域图2.0创建疫苗构建体的示意图。2.3. 二次和三维结构建模FIB的二级结构由104秒-二级结构预测方法（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa），其将序列的排列限定为α-螺旋，β-片层和卷曲结构[32]。铜绿假单胞菌OprF（PDB ID：4RLC），具有100%序列同一性和0.78 z分数，（PDB ID：5WTL），具有36序列同一性%和z评分5.69和（PDB ID：5 U1 H），具有100%序列同一性和z-评分3.75，PopB（PDB ID：3WXX）为44序列同一性%和z评分5.13和（PDB ID：4JLO），具有z分数5.04已确定[33]。在10000个构建的模型中，我们选择了 十 顶部 模特， 基于 对 他们的 掺杂 得分， 为 新F. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006733=图1.一、 图示了本研究中用于识别新的P。铜绿假单胞菌疫苗候选者。解释。因此，我们使用同源建模（HM）方法通过Modeller v9.19软件使用模板的晶体结构（表2）预测结构，所述模板由使用HHpred的序列-结构比对产生。然后，使用服务器GalaxyRefine（http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi？类型REFINE）[34]。对于Opr I，PBD中不存在具有适当相似性的同源结构;因此，将从头算方法应用于ROSETTA（http://www.robetta.org）以预测其从Scratch开始[35]。使用PyMOL软件进行3D结构表示和构象分析。2.4. 三维结构验证ProSA 网 络 服 务 器 （ https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）和Ramachandran图（https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROWARK/）用于识别结构冲突，F. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006734表1通过Emini服务器预测FIB的表面可及序列。在“HSKETEA“和“INSDSQGRQQ”中显示的表面可及贴片的最高评分肽的长度为7和10个氨基酸。OprF、OprI和PopB的表面可及序列以绿色、黄色和红色表示号肽序列开始位置结束位置肽长度VaxiJen评分1公司简介111660.21342SVRNMKNA192680.40553YGEYHDVRGTYETGNKKV4764181.28714INSDSQGRQQ100109102.19655GLEKRDNGH13814690.91986DFDKSKVKENS221231110.60487FMKQYPST24124880.70388DAYNQKLSERRAN262274131.64539GESRPV29730261.803610HSKETEA33734372.318111AQARADEAYRKAD355367131.152012QKAQQTADEANERA374387141.351213PSAASQQR46246981.108414活动QQKKLK524533101.333215IEQARKQNLQKMEDNQQKIRESEEAEAQ537566300.944316KAANRQADVQESRAD730744151.508017RLKEEL75475960.6642表2OprF/I和PopB的结构模板选择和对齐参数使用生物信息学工具研究OprF、OprI和PopB的每个片段的生物体、PDB、链、序列长度、E值、z得分和同一性比率分辨率说明PDB中的X射线晶体学结果蛋白质序列分析的E值z分数表示天然折叠与标准系综偏差中错误折叠的平均值之间的能量分离。查询名称微生物PDB ID链序列长度（aa）分离度（CAXA）E值z评分鉴别（%）OprF铜绿假单胞4 RLC A 175 1.60 1.4e-110.78 100牙龈二氧化碳噬纤维菌5 WTL C 261 2.30 2.9e-12-5.69 36绿脓5 U1 H C 123 1.50 9.3e-9-3.75 100OprI绿脓杆菌PopB嗜水气单胞菌3 WXX B 219 2.70 1.6e-29-5.13 44铜绿假单胞CHA 4JLO C，D 9 2.22--5.04 -表3利用生物信息学工具对所选免疫优势表位的氨基酸序列及其免疫学特性进行了研究。所有表位均为非致突变的，并且最高分子量、pI、不稳定指数、半衰期、亲 水 性 和 抗 原 性 为 “ARAQARADEAYRKADE“ 、 “NATAE-GRAINRRVE” 、 “NINSDSQGRQ” 、 “VVRVQLDVKFDFDFDKSK“ 、 “VCSDNDGVCDNVD” 、“ARAQARADEAYRKADE”和“EGHTDSVGTDAYNQK”。的氨基酸OprF、OprI和PopB的选定免疫显性表位的序列显示为绿色、黄色和红色。表位毒素预测理化性质亲水性抗原性No.1LDAIYHFGTPGVGLRP2RGTYETGNKKVHGNLT3DVCSDSDNDGVCDNVD4SKVADLGGKFGSLAGQ5AKIGGKAAEMTASLAS6CSSHSKETEARLTA7ANRQADVQESRADLTT8ARAQARADEAYRKADE9VVRVQLDVKFDFDFDKSK10NINSDSQGRQ11NATAEGRAINRVE12VCSDSDNDGVCDNVD13CSDSDNDGVCD NVDK14KAANRQADVQESRAD15AQKAQQTADEANERA16EGHTDSVGTDAYNQKNon-to-XicNon-to-XicNon-to-XicNon-to-xicNon-to-xicNon-to-xicNon-to-xicNon-to-xICNON-TO-XICNON-TO-XicNon-to-XICNON-TO-xicNon-to-XicNon-to-XicNon-to-XicMol.Wt.pI不稳定指数半衰期a（小时）VaxiJen（0.4%时）AntigenPRO1713.217.0924.075.5-0.440.59300.2264411775.2 9.72-18.86 1 0.32 1.3332 0.6467641671.84 3.18 24.06 1.1 0.78 1.2865 0.1181031534.97 8.94 1.17 1.9 0.07 0.6207 0.1071881505.97 8.94 4.67 4.4 0.11 1.13001519.83 7.07 36.80 1.2 0.56 1.7238 0.7320711775.08 4.56 46.91 4.4 0.64 1.1947 0.5667711821.136.56-11.81 4.41.181.1398 0.2137341923.47 8.83 12.98100 0.54 1.0264 0.1127091118.27110.721.4 0.562.33600.6681381556.89 9.86 50.20 1.4 0.73 1.5759 0.0598741556.74 3.25 24.99100 0.63 1.2997 0.1378881585.59 3.66 19.33 1.2 0.93 1.2913 0.2876641658.94 6.47 49.37 1.3 1.03 1.50801630.89 4.68 16.51 4.4 0.86 1.3201 0.1055711621.85 4.54 0.80 1 0.47 1.93100.911505一 体外哺乳动物网织红细胞中的半衰期。错误配置[36]。为了指定蛋白质的粗模型和精制模型之间的匹配残基，使用PYMOL软件叠加两个结构模型。此外，为了检查蛋白质结构的立体化学质量，PROTEINS通过逐个分析残基来使用[37]。验证用于确定原子模型（3D）的3D，其氨基酸序列基于其位点和环境[38]。的VADAR服务器用于蛋白质折叠（ p ： //redpoll.pharmacy.ualberta.ca/vadar ） [39] 。 此 外 ， 通 过ProtScale软件（https://web.expasy.org/protscale/）预测FIB蛋白的3D亲水性和疏水性建模，并使用PYMOL程序进行可视化[40]。F. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006735+--+==2.5. 分子动力学模拟研究使用GROMACS版本5 [41]和Grace进行分子动力学（MD）模拟和分析，以研究蛋白质构象变化和稳定性。使用pdb2gmX.随后，FIB蛋白的溶剂化在10 μ l SPC/E水立方内进行。将溶剂分子与Cl-或Na离子置换成电中性分子。由粒子网格埃瓦尔德（PME）精确获得的长程静电相互作用。使用线性约束求解器（LINCS）约束包含氢原子的共价键。能量最小化使系统松弛。然后，系统在300 K下在NVT（恒定粒子数、体积和温度）中平衡500 ps，随后在NPT（恒定粒子数、体积和温度）中平衡500ps。 粒子、压力和温度）集合。最终，在生产运行中，平衡系统以2 fs时间步长模拟100 ns。MD模拟生成的轨迹用于进一步分析，包括RMSD，Rg，RMSF，SASA和不同的能量参数。2.6. B细胞表位（线性和不连续）鉴定IEDB B细胞表位预测工具的BepiPred线性表位预测[42]和抗原性预测[43]（http：//tools. immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input）来预测线性表位和抗原性。此外，为了预测B细胞表位，使用ABCpred（http://crdd.osdd.net/raghava//abcpred/）服务器研究氨基酸序列[44]。ABCpred通过使用人工神经网络预测抗原序列中的线性B细胞表位区域，在阈值为0.8.蛋白质的其他抗原性区域由使用BcePred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/bcepred/bcepred）鉴定的免疫球蛋白分子的结合位点识别（预测准确度在52.92%和57.53%之间）[45]。使用ToX inPred [46]、ProtParam、VaxiJen和Scratch程序研究了这些选定肽的毒性、理化和抗原性预测。 此外，通过激活T辅助细胞和其他免疫抑制剂，产生免疫细胞如巨噬细胞、IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10，其IFN-γ水平可以从IFN-γ表位服务器获得，所述IFN-γ表位服务器使用基于Motif和SVM的混合方法产生HTL表位 [47]其他的可以从IL4pred [48]、IL17eScan [49]和IL10pred [48]服务器获得。基于阈值为0.2、1.0和0.3的SVM方法进行IL4pred、IL17eScan和IL10pred操作。使用CBTOPE（ http://www.imtech.res.in/raghava/cbtope/ ） [50] 和 ElliPro （ 来 自Ellipsoid和剩余Proximal）[51]预测不连续B细胞表位，准确度为85%。2.7. CD4+ T细胞表位在这项研究中，所有类型的OprF、OprI和PopB的序列都是用15-mer HLA II类T细胞表位预测的，使用的是一种共识方法，该方法被阐明为NN-对齐、SMM-对齐和IEDB在线服务器中的组合库方法（百分位排序<50）。 选择9个HLA II类等位基因DRB 1（*01：01，*03：01，*04：01、*07：01、*11：01和 *15：01等位基因）、H2-IAb、H2-IAd和H2- IEd等位基因以覆盖超过97%的全球人群。2.8. 分子对接在MD模拟后使用WEBPro2.0服务器（http://nrc.bu.edu/cluster）进行FIB蛋白的T细胞依赖于活化B细胞和T细胞表位的蛋白-蛋白相互作用HLA的3D结构，包括DRB 1（*01：01，*03：01，*04：01，*07：01，*11：01，*15：01等位基因）、H2-IAb、H2-IAd和H2-IEd等位基因作为T细胞依赖性活化B细胞和T细胞的受体和主要表位，在本发明中，他们认为是配体的研究。基于最低的结合自由能和最可观的氨基酸簇大小，RISTOPro使用快速傅立叶变换（FFT）相关方法[52]。的使用LigPlot+ v.2.2选择并评估具有最显著簇成员和最低结合自由能的RISTOPro的输出程序[53]，它代表了分子间的相互作用和它们的强度，包括氢键，疏水相互作用和原子辅助作用。2.9. 细菌物种铜绿假单胞菌的菌株PAO 1 ATCC 7853获自爱尔兰巴斯德研究所（IPI）。在实验之前，通 常 在 Luria-Bertani （ LB ） 培 养 基 （ Merck Co ， Darmstadt ， andGermany）中于37℃振荡过夜生长。2.10. FIB蛋白嵌合整合抗原的示意图由OprF、OprI组成，PopB序列的C-末端区域表示在图1中。凌晨2优化的嵌合抗原编码序列合成，并由Biomatik公司（Ontario，Canada）克隆到pET-22 b（）克隆载体中NdeI和XhoI限制酶位点之间（图2B）。对于蛋白质检测和纯化，将His标签序列添加到抗原编码序列。在本研究中，大肠杆菌（E.coli）菌株BL21（DE3）pLysS（Novagen）用于重组蛋白表达。2.11. 表达和纯化研究将编码FIB蛋白的合成基因克隆到表达质粒中，在E. coli BL21（DE3）pLysS.转化后的E.大肠杆菌细胞在LB肉汤培养基（Merck 哥，达姆施塔特， 德国）含有氨苄青霉素（100μg/ml）。 将过夜培养物用于消化200 ml LB肉汤富含氨苄青霉素的培养基。通过在T0期间在600 nm处约0.5的光密度（OD）评价培养基。通过与异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG;Sigma，St. Louis，MO，USA）结合诱导表达的整合蛋白FIB，以达到最终浓度。1μ l/ml的稀释度。然后，使用振荡培养箱将FIB蛋白加IPTG的混合物在37° C下再孵育24小时蛋白质在37℃下，在不同的诱导后间隔，4、6和12小时，评估表达然后通过离心（4000 rpm，15 min，4℃）收集诱导的细胞在裂解缓冲液（20mM Tris HCl、0.5 M NaCl、1 mM PMSF、10 mM咪唑、0.3%TritonX，pH 8.0）中，将细胞沉淀悬浮，然后超声处理（20个循环，30s，4℃）（UP50 H，德国）。将混合物冷冻和解冻三次，然后在室温下离心。低速（4000 rpm）10 min以使细胞膜破裂。沉淀和上清液均通过12.5%十二烷基钠分析硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。随后凝胶用标准考马斯亮蓝G-250染色2小时，并用45%甲醇和10%冰醋酸溶液脱色。将悬浮液离心（12000 rpm，20 min，4℃），样品上样到Ni-NTA柱（Qiagen，Valencia，CA，USA）上，并根据 的 制造商的标准方案[54].然后，将纯化的嵌合蛋白在PBS和制剂缓冲液（1.9mM Na2HPO4.2H2O，8 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl），pH7.2，在4℃下过夜以除去咪唑。透析后，重组蛋白的定量使用Brad-ford蛋白质测定[55]，最后等分于0.5 mg/ml小瓶中。2.12. 免疫印迹分析在嵌合蛋白表达后，进行SDS-PAGE以基于分子量可视化蛋白[56]。随后，将蛋白质转移到Immobilon-PSQ PVDF膜（Merck，F. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006736=联系我们图二. （A）由OprF/I区和C-末端PopB区组成的铜绿假单胞菌PAO 1抗原性构建体的示意图已通过接头（G4 S3）整合。（B）融合蛋白及其载体的图谱。oprF-oprI-popB基因全长为2385 bp，与pET-22 b（+）载体相连的基因全长Germany）在含有20%甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液中。将印迹在室温（RT）下在含有5%脱脂乳的TBST（20 mM Tris-HCl，pH 7.6，100 mMNaCl和0.1%吐温20）中孵育2小时（BCR®，Sigma-Aldrich，德国）。然后将膜用TBST洗涤三次，并与6-His 标 签 抗 体 辣 根 过 氧 化 物 酶 偶 联 物 （ Roche ， Manheim ， andGermany）在室温下孵育2小时.之后，将膜再洗涤并与含1%H2O2的DAB（3，3-二氨基联苯胺）底物溶液孵育. 最后，用蒸馏水洗涤膜2.13. 动物选择雌性Wistar大鼠（6-到达后，将大鼠圈养在标准聚碳酸酯笼，随机分为4组。每组包括15只大鼠（G1：FIB蛋白组，G2：FIB-GM-CSF组，G3：PBS-GM-CSF组，G4：磷酸盐缓冲盐水（PBS）组），保持在无特定病原体（SPF）条件下。环境室温ture 和 相对 湿度 控制 在 20–26 C 和 30- 70%分别免疫前，用甲苯噻嗪100μ L（0.1 mL）和10%氯胺酮300μ L（0.3 mL）混合液注射麻醉大鼠所有的动物实验都得到了动物伦理委员会的批准和医学科学Shahid Beheshti大学EX实验委员会。它们的维护和处理严格按照机构道德准则和国际协议进行。2.14. 使用重组嵌合蛋白的免疫通过不同疫苗剂量（5、10、20、30、40和50μ g/mL）进行初次免疫接种计划。结果表明，50μ g/mL为最佳免疫剂量。将50μ g FIB抗原与GM-CSF（50μ l）一起配制为功能性佐剂。GM-CSF在接种疫苗的临床试验中作为一种有吸引力的佐剂，从TH 17细胞分泌并将保护性单核细胞/巨噬细胞募集到炎症组织微环境中以产生针对细菌感染的保护[57]。将化合物在4 ℃下轻轻旋转过夜为了更多的吸收。对于疫苗接种，第一组接受50μ g通过单次皮下注射来注射融合蛋白。 以下组取50μ g嵌合FIB蛋白与相同量的GM-CSF佐剂（Sigma，St. Louis，MO，USA）。第三对照组仅获得等体积的灭菌PBS。免疫小鼠加强两次，2周间隔，25μ g FIB嵌合蛋白。在第14、28、42（攻击前）和44（攻击后）天从各组中所有大鼠的眶窦采集血液样品，并通过ELISA法收集血清。离心以进一步分析。2.15. 抗体应答在96孔聚苯乙烯微量滴定板（Greiner Microtiter Plates，Germany）中进行ELISA以表征特异性抗体动物激发前大鼠血清中的抗体（IgG 1、IgG 2a、IgG 2b总之，在4℃下，用100μ L OprF-Opr I-PopB蛋白的1μ g/100μL溶液（溶于0.5 mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.6）覆盖平板过夜。 用洗涤缓冲液（0.05在室温下，用300μ L封闭液（含1%酪蛋白的1.5mol/L PBS）封闭2h。洗涤步骤后，HRP缀合的羊抗小鼠抗体（1：5000稀释）（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA）加入到每孔中（100μ L/孔），并将这些板在室温下孵育2小时。这种抗体对γ链的反应特别强烈，只识别IgG抗体.将平板在37°C下孵育1小时，随后洗涤8次。100μ L TMB Plus（3，3′，5， 使用ELISA读数器（BioTek，Germany），并测量所有标本的终点滴度。2.16. 细胞因子测定对于细胞因子评价，在最后一次免疫后两周（攻击前）和攻击后24小时从处死的大鼠中取出脾脏。通过温和均质化制备单细胞悬液。 然后， 为 机械 研磨， 的 脾 细胞区室在磨砂玻璃载玻片的两侧之间粉碎和研磨。根据制造商的建议，使用夹心ELISA测定试剂盒（RD，Quantikine®ELISA，USA）分析样品的IFN-γ、IL-17和IL-4&。数值表示为pg细胞因子ml-1（平均值SEM，n8）。 用0.1 M ammo-1孵育红细胞，氯化物裂解缓冲液。将来自大鼠的脾细胞用无菌PBS洗涤3次并悬浮于含有10%热灭活胎牛血清的RPMI培养基（Gibco，Darmstadt，Germany）中. Try-pan蓝排除法用于区分活细胞、死细胞并确定该悬浮液中存在的活细胞数量。 在24孔板（Nunc，F. Sabzehali等人医学信息学解锁25（2021）1006737±----Denmark），并以1× 106个细胞/孔一式三份进行培养。这些培养物用10μ g/ml FIB蛋白激发，并在37℃、5%CO2气氛和95%相对湿度下孵育。经过72小时的孵化，感染后，收集上清液，ELISA定量细胞因子的水平。2.17. 毒性试验和动物将几种剂量的抗原皮下处理到大鼠中，以评价该纯化蛋白在大鼠中的潜在毒性。每组由15只大鼠组成。第42天，大鼠麻醉后，经加热的铁合金（1 × 1.5英寸）加0.5 mL 96%乙醇烧伤10 s用100μ L甲苯噻嗪、300μ L 10%氯胺酮（Sigma-Aldrich，德国）。1小时后，将菌株PAO 1 ATCC 7853的悬浮液铜绿假单胞菌（250 CFU/mL细菌）和PBS接种在烧伤区域[59]。在整个实验过程中，持续观察大鼠的体温和死亡情况[ 60 ]。2.18. 统计数据分析使用Graph Pad Prism软件包（版本8.4.3，San Diego，CA，USA）实现所有图表和统计解释。 根据ANOVA分析数据。所有数据显示为表示标准差。 P值0.05被认为是稳定的。<有意义的。3. 结果3.1. 序列分析在本项目中，计算机模拟方法用于设计铜绿假单胞菌的多表位疫苗（图1）。我们调查了基本的致病因素，观察到在大多数致病菌株使用Clus-talW和MUSCLE程序来选择候选蛋白作为疫苗设计的抗原（表1结果表明，除PA96、NCMG1179、C3719、PA21_ST175外，在除SCV20265、39016、2192外的所有菌株中测定PAO 579、Opr I，在除SCV20265、PADK2_CF 510、39016、VRFPA 02、2192外的所有菌株中观察到PAO 579和PopB。因此，结果显示这些蛋白质在整个蛋白质序列中大部分是保守的（图1-S1、-S2和-S3）。此外，针对除铜绿假单胞菌之外的其他细菌的序列比对结果确定，非铜绿假单胞菌原核生物的相似率（包括覆盖度> 35%、相似性> 30%和E值<2 e-20）是轻微的;因此，与其他细菌的交叉反应性将是最低的（图1B）。2-S1，-S2和-S3）。作为比较，OprF的交叉反应性未显示任何差异。人体内其他常见共定位病原体细菌的相似性和保守性 此外，Opr I和PopB蛋白在那些常见的共同定位的病原体中检测到。此外，虽然所有嵌合蛋白位置在鉴定疫苗保护性中是至关重要的--应用邻接（NJ）方法，通过使用MEGA X使用包括500个重复的bootstrap步骤（对于限定的组，bootstrap值高于75）来绘制遗传树。的Jukes和Cantor模型用于计算一个氨基酸到另一个氨基酸的取代概率。结果表明，候选蛋白是致病菌株的关键蛋白，而在进化过程中它们是保守的（图4-S1 A、然而，应该注意的是，它们在其他原核生物中也略微保守（图4-S1 B、进化树表明，它们之间没有任何的保护和进化关系之间共定位致病细菌 除了A. baumannii，H.流感和B.洋葱（Fig. 4 -S4）。3.2. 蛋白质性质评价的疫苗构建体的理化和免疫原性特征显示在图5-S中。构建体的特征确定为酸性（理论pI低于7）、稳定（不稳定指数低于33.61）、热稳定（脂肪族指数值为82.09）和亲水性（亲水性值的负总平均值）。此外，Protein-Sol和SolPro服务器均预测该构建体在E. coli，（APPROXIMAX1.0）。使用Emini服务器检测不同长度的表面可及斑块，伴随着全长的FIB蛋白，结果显示，最高分（图）3和6 D，表1）。另一方面，FIB融合物在哺乳动物网织红细胞（体外）和大肠杆菌（体内）中的半衰期分别评估为约0.8小时和10小时。根据计算建模，免疫原性评价另外解释了尽管FIB（图4）嵌合蛋白具有极强的抗原性（0.7756）和免疫原性（0.70099），但它是非过敏原性的（0）（图4）。 5-S）。3.3. 二级结构评估和3D模型细化FIB候选疫苗构建体的二级结构是使用APP4预测的。这些结果说明FIB 的 残 基 由 70 （ 8.82% ） 条 链 、 454 （ 57.18% ） 个 α- 螺 旋 和 270（34.01%）个卷曲组成（图5）。这一结果证明，天然蛋白质的结构是完整的未修饰的融合结构。根据表2，为了预测嵌合蛋白的3D结构，由于HHP red的结果而进行结构模板选择。虽然每个查询都存在一些同源物，包括OprF和PopB，但OprI没有同源物。因此，我们不得不发展从头计算的蛋白质结构预测方法的一些结构。用Modeller v9.19软件预测FIB融合物的3D结构（图
