小鼠肝脏中的基因组规模的CRISPR筛选揭示了生物体中的高通量功能基因组学

文章在单个小鼠肝脏图形摘要亮点d基因组规模的sgRNA文库向小鼠肝脏的d肝细胞适应性筛选揭示了单个小鼠d筛选揭示了活生物体d方法可访问并适用于不同的表型和CRISPR应用作者希瑟河钥匙，克里斯汀A。克努斯对应knouse@mit.edu简言之提高对生理学和疾病的理解需要在生物体中进行高通量遗传解剖的方法。在这里，Keys和Knouse在小鼠肝脏中建立了基因组规模的筛选这种方法为生物体中的高通量功能基因组学提供了一个可访问和可适应的平台。Keys Knouse，2022，细胞基因组学2，1002172022年12月14日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100217基因组规模的sgRNA文库感应端点Eif2s3xDDX3XNdst1Hs2st1排序基因女性ES肝细胞小鼠细胞在单个小鼠性别特异性命中有机体背景特异性命中倍数变化男性倍数变化会会开放获取文章在单个小鼠肝脏中进行基因组规模的CRISPR筛选希瑟河钥匙1，3和克里斯汀A。Knouse2，3，4，*1怀特黑德研究所为生物医学研究，剑桥，马02142,USA2 Koch Institute forIntegrative Cancer Research，Department of Biology，Massachusetts Institute of Technology，Cambridge，MA 02139，USA3这些作者贡献相等4引线触点* 通讯地址：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100217knouse@mit.edu总结对哺乳动物生理学和疾病的遗传决定因素的完整理解受到活生物体中高通量遗传解剖能力的限制。全基因组CRISPR筛选是揭示细胞过程遗传调控的有力方法，但需要将单个指导RNA稳定递送到数百万细胞，这在很大程度上限制了其在离体系统中的实施。因此，仍然需要可获得的高通量体内功能基因组学。在这里，我们在一只小鼠的肝脏中建立了全基因组筛选，并使用这种方法来揭示肝细胞适应性的调节。我们发现了细胞培养筛选中未发现的途径，强调了生物体中遗传解剖的力量。我们开发的方法是可访问的，可扩展的，并适应不同的表型和应用。我们由此建立了在活的哺乳动物中进行高通量功能基因组学的基础，使得能够进行生理学和疾病的全面研究。介绍我们理解和调节哺乳动物生理和疾病的能力需要确定所有基因如何促成任何给定表型的能力。在细胞培养系统中，全基因组筛选方法提供了在单个实验中鉴定正或负调节细胞过程的所有基因的能力。然而，这些离体系统不能再现体内发生的所有细胞过程，并且即使当它们能够再现时，它们也不能再现影响这些体内现象的全部细胞外因子。虽然这些限制保证了直接在生物体中研究细胞过程，但在生物体中探测复杂的表型历来需要牺牲实验的易处理性。 当涉及到因果关系的推断时，人们在很大程度上局限于使用敲除小鼠一次分析单个基因。实验的易处理性和生理学的相关性之间的这种不一致性长期以来限制了我们理解哺乳动物生理学和疾病的能力。因此，迫切需要将高通量功能基因组学引入生物体。在细胞培养中的高通量功能基因组学方法中，使用CRISPR-Cas9的全基因组筛选已成为一种强大的方法。这需要将单一指导RNA（sgRNA）文库与Cas9一起递送至细胞，用于蛋白质消耗和表型选择的干预期，以及最终深度测序以检测细胞中的变化。SgRNA丰度，因此在筛选中命中。筛选成功的关键是以稳定且具有高覆盖度的方式递送sgRNA，其中任何给定的sgRNA被递送至至少几百个细胞，使得可以在筛选结束时评估sgRNA丰度的变化，具有鉴定显著富集和耗尽的sgRNA的能力。慢病毒是用于将sgRNA递送到细胞中的优选方法，因为它允许sgRNA在细胞内的稳定的单拷贝整合。虽然慢病毒在将全基因组sgRNA文库递送至培养物中的数千万个细胞方面是有效的，但其在将sgRNA递送至体内细胞方面效率较低。尽管研究小组已经成功地使用慢病毒在体内转染角质形成细胞和神经元，但每只小鼠导入的细胞数量有限，并且先前的方法需要将超过50只小鼠合并用于单个基因组规模的筛选。因此，全基因组CRISPR筛选在很大程度上限于细胞培养系统或细胞移植模型。第五、六条将基因组规模的筛选引入生物体需要克服稳定、高覆盖率的sgRNA递送到组织中的障碍在这方面，小鼠肝脏是一个有吸引力的靶器官。由数千万个肝细胞组成，单个小鼠肝脏提供与基因组规模筛选相容的细胞数量。此外，鉴于肝脏不幸的是，将慢病毒递送到肝脏的努力受到转导效率差和免疫介导的缺陷的CellGenomics 2，100217，December 14，2022 <$2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2细胞基因组学2，100217，2022sgAAVS1U6一B0 TU 2 x 106 TU1 x 107 TU 5 x 107 TUmCherrymTurq2肌动蛋白sgRNA的大多数肝细胞，但因为AAV载体通常保持游离型，sgRNA将不会在增殖细胞中持续存在。因此，分析基于AAV的屏幕需要单独扩增和测序sgRNA靶向的基因，极大地限制了在任何给定实验中可以筛选的基因数量。9编码转座子的质粒的流体动力学尾静脉注射也可以将sgRNA引入肝细胞并提供整合到宿主基因组中的益处。然而，流体动力学尾静脉注射仅以不均匀的方式除去10%-10-在这里，我们在小鼠肝脏中建立了可访问的基因组规模的富集和耗尽筛选。我们开发了一种稳定、高覆盖率的方法，将基因组规模的sgRNA文库导入诱导型Cas9小鼠的肝脏中，允许在动物一生中的任何时间点进行Cas9诱导和表型选择。为了验证这种方法，我们在新生儿肝脏中进行了肝细胞适应性筛选。我们的筛选能够发现个体小鼠中肝细胞适应性的阳性和阴性调节因子，在小鼠间具有高重现性。我们发现了对肝细胞适应性具有性别特异性影响的基因，以及在哺乳动物中肝细胞适应性所独特需要的基因。C1008060402002 x 106 1 x 107 5 x 107剂量（TU）mTurq2mCherry两者活的有机体。这种方法是可获得和可适应的本发明涉及多种表型和CRISPR方法，从而为活生物体中的高通量遗传解剖提供了基础。结果考虑到慢病毒介导的sgRNA递送优于其他sgRNA递送方法的优点，我们试图建立有效的慢病毒sgRNA递送至肝脏。我们假设，向新生小鼠体内注射高浓度的慢病毒可以避免其他人观察到的低转导效率和免疫清除。14为了测试这一点，我们产生了编码非靶向sgRNA（sgAAVS1）以及mCherry或mTurquoise2（mTurq2）报告基因的慢病毒，并注射了不同剂量的病毒。图1. 单个小鼠肝脏(A) 用于U6驱动的sgRNA表达和荧光报告基因（mCherry或mTurq2）的肝细胞特异性表达的慢病毒载体。(B) 在用sgAAVS 1-mCherry和sgAAVS 1-mTurq 2慢病毒的等量混合物注射后4天，来自小鼠的肝脏中的内源性mCherry和mTurq 2荧光的图像。肝脏用鬼笔环肽（绿色）复染以标记肌动蛋白。比例尺，100mm。(C) 在用sgAAVS 1- mCherry和sgAAVS 1-mTurq 2慢病毒的等量混合物注射后4天，来自小鼠的肝脏中mCherry阳性、mTurq 2阳性和双阳性肝细胞的百分比。误差条表示标准偏差。n = 3只小鼠/剂量和200个肝细胞/小鼠。参见图S1。转导肝细胞的清除。7，8虽然研究小组已经利用其他递送方法在肝脏中进行遗传筛查，但这些方法都有限制，无法进行基因组规模的富集和耗竭筛查。例如，腺相关病毒（AAV）可用于递送将相等剂量的这两种慢病毒的混合物注射到出生后第1天（PD）小鼠中（图1A）。我们观察到转导的肝细胞百分比呈剂量依赖性增加，53 107转导单位（TU）的剂量转导超过75%的肝细胞（图1B和1C）。重要的是，这些转导的肝细胞均匀地分布在整个肝小叶中并持续到成年期（图1B、S1A和S1B）。基于肝细胞和肝脏体积的测量以及两种荧光报告子的转导频率，我们估计5×10 ×7 TU的剂量转导每个PD 1肝脏约1000万个肝细胞，每个细胞平均仅两次整合事件（图1C和S1C）。这种转导效率将在单个小鼠中提供100，000-特征sgRNA文库的>200倍覆盖。因此，我们的慢病毒方法建立了一种与小鼠肝脏中的基因组规模筛选完全兼容的sgRNA递送方法。sgAAVS1U6肝细胞特异性启动子mCherry肝细胞特异性启动子mTurq2阳性肝细胞（%）细胞基因组学2，100217，2022年12月14日3~文章会开放获取一LSL-Cas9小鼠B出生后第1注射sgRNA-mCherry出生后第5注射PBS或AAV-Cre用于靶蛋白的收获肝染色剂图2.小鼠肝脏中时间控制的蛋白质耗竭(A) 用于在LSL-Cas9小鼠中诱导蛋白质消耗的方案。(B) 来自注射sgMaob-mCherry，随后注射PBS或AAV-Cre 的 LSL-Cas9 小 鼠 的 肝 脏 的 图 像 ， 对mCherry（品红色）、MAO-B（绿色）和肌动蛋白（蓝色）进行免疫染色。比例尺，45mm。(C)来 自 注 射 sgMaob-mCherry 随 后 注 射 PBS 或AAV-Cre 的 LSL-Cas9 小 鼠 的 mCherry 阳 性 和mCherry阴性肝细胞中的细胞质MAO-B强度/ml。实心圆和空心圆分别代表雄性和雌性小鼠的值每种条件n = 1只雄性和1只雌性小鼠，每只小鼠25个细胞。参见图S2。mCherryCMAO-B肌动蛋白合并Lmnb2）。 16 ， 17在将sgMaob-mCherry或sgLmnb 2-mCherry慢病毒递送至PD 1小鼠后，我们在PD 5时注射PBS或AAV-Cre，并在不同时间点收获肝脏以评估个体肝细胞中的蛋白质水平（图2A）. 到Cas9诱导后两周，MAO-B和核纤层蛋白B2仅在注射AAV-Cre的小鼠中的mCherry阳性肝细胞中耗尽（图2B、2C、S2C和S2 D）。重要的是，慢病毒介导的sgRNA递送和AAV-Cre介导的Cas9诱导以及所得基因靶向的这种组合不诱导可检测的肝细胞损伤或肝脏炎症（图S2肝细胞更新也不受影响（图S2H和S2 I）。因此，该方法为肝细胞特异性蛋白的表达提供了一个有效的平台。在动物一生中的任何时间点进行消耗和遗传筛选，而没有细胞或组织的可检测的混杂扰动。我们接下来询问我们是否可以使用这种sgRNA递送方法作为肝细胞中时间控制的蛋白质消耗的基础。我们使用可商购获得的loxP-stop-loxP-Cas9（LSL-Cas9）小鼠，其中我们可以通过注射表达来自肝细胞特异性Tbg启动子15的Cre重组酶的AAV（AAV-Cre;图S2 A和S2 B）在几乎所有肝细胞中诱导Cas9。为了评估蛋白质消耗的动力学和效率，我们选择了两种长寿命的非必需蛋白质：线粒体酶MAO-B（由Maob编码）和核纤层蛋白Lamin B2（由Maob肝脏中的基因组规模筛选为了能够对不同的肝细胞表型进行基因组规模的筛选，我们试图制备靶向在发育、静止和再生小鼠肝脏中表达的所有基因的sgRNA文库。我们在小鼠发育期间和肝损伤后的不同时间点对肝脏进行RNA测序，并确定在一个或多个时间点表达了13，266个蛋白质编码基因（FPKM >0.3）（图3A、S3A和S3 B;表S1）。我们产生了靶向这些基因中的13，189个的sgRNA文库（每个基因平均5个sgRNA）以及先前公开的6，500个对照sgRNA（约2，000个非靶向sgRNA和4，500个靶向对照基因的外显子和内含子区域的sgRNA）18，总共71，878个独特的sgRNA（图S3C;表S2）。PBSAAV-Cre4细胞基因组学2，100217，2022会开放获取文章利用这种方法，我们进行了肝细胞适应性的全基因组筛选（图3B）。为了筛选肝细胞的持续和增殖能力，我们选择在新生儿发育的三周内进行筛选，此时肝细胞经历大约三次群体分化以增加肝脏质量。我们在PD 1时将5× 10 ×7 TU的我们的在PD5时，我们从两只雄性和两只雌性收获肝脏以评价初始文库代表性。这四个肝脏中的sgRNA表示与质粒文库非常好地相关（Pearson r= 0.97），并且我们检测到所有sgRNA，表明我们可以从新生小鼠肝脏有效地递送和回收基因组规模的sgRNA文库（图3C;表S3）。在剩余的小鼠中，我们在PD 5诱导Cas9并在PD 26收获它们的肝脏以评估最终的肝脏表现。我们使用全基因组CRISPR-Cas9敲除（MAGeCK）算法19的基于模型的分析来基于它们在PD 26相对于PD 5的 sgRNA丰度变化的统计学差异来鉴定富集和耗尽的基因（表S3）。使用0.05的错误发现率截止值，我们确定了6、0、0和2364、40、386和297显著富集，在雄性1、雌性1、雄性2和雌性2中分别检测到富集和耗尽的基因，表明我们的方法可以检测单个小鼠中富集和耗尽的基因。我们还通过计算靶向给定基因的所有sgRNA丰度的中位数log2倍数变化来生成基因水平评分。我们在四只小鼠中观察到基因评分的强相关性（Pearson r = 0.46至0.75;图 3D和S3D;表S3）。事实上，我们在小鼠中观察到的重现性与在进行重复的情况下在细胞培养筛选中观察到的重现性相似（Pearson r = 0.59至0.65）。我们注意到，虽然雌性1与其余小鼠的相关性较差，但雌性1与其他小鼠之间的相关性仍然显著（p 2.23 10- 16），我们没有技术原因使雌性1因此，我们认为所有四只小鼠都是生物学重复，而没有将小鼠之间的基因评分标准化用于后续分析。为了提高我们鉴定显著富集和耗尽的基因的能力，我们组合了来自所有四只小鼠的数据，并计算了代表小鼠中每个基因的中位数log2倍数变化的统一基因评分（表S3）。使用0.05的错误发现率截止值，我们在所有小鼠中鉴定了30个显著富集的基因和661个显著耗尽的基因（图3E;表S3）。重要的是，这些基因评分与基因表达或蛋白质半衰期不呈正相关，16再次证实了长寿命蛋白质被有效耗尽（图S3E和S3 F）。总的来说，这些初步筛选结果确立了在小鼠肝脏中进行基因组规模筛选的技术可行性。重要的是，虽然平行筛选多只小鼠增加了发现显著命中的能力，但单个小鼠足以鉴定显著富集和耗尽的基因。接下来，我们询问我们的筛选是否可靠地发现了细胞适应性的调节因子我们首先评估了在细胞培养物22中确定为必需的基因是否在耗尽的基因中显著富集这组核心必需基因确实在所有四只小鼠中显著耗尽，并且在每个个体中都是如此。小鼠（图3E和3F）。为了评估我们的筛选是否可以可靠地揭示生物体中肝细胞适应性的特异性调控，我们评估了已知影响生物体中肝细胞适应性的两组基因(1) 在肝细胞癌中作为肿瘤抑制因子的一组13个基因23（预期富集），和（2）肝细胞活力所需的一组7个基因24在肿瘤抑制基因中，13个基因中的8个显著富集（假发现率[FDR] 0.25;图3G）。在 肝 细 胞 活 力 所 需 的 基 因 中 ， 所 有 七 种 基 因 均 显 著 耗 尽（FDR0.25;图3G）。这两个基因组也如预期在每只单独的小鼠内显著富集和耗尽（图3F）。这些结果支持我们的屏幕作为一个可靠的平台，揭示遗传调控的表型问题。生物体中的基因组规模筛选提供了独特的见解在生物体中进行基因组规模的筛选，由于保留了所研究的细胞和表型的天然状态和背景，使得在细胞培养中不可能实现几种生物学见解。一个这样的优点是筛选不携带预先存在的突变的野生型细胞大多数细胞系天然具有或不可避免地获得突变，这些突变提高了它们在培养中的生存力和增殖，29损害了在筛选中查询这些突变基因的功能的能力。因此，细胞培养中的适应性筛选具有受损的发现肿瘤抑制基因的能力。30在我们的筛选中，超过一半的25个最富集的基因被确定为在至少一种情况下充当肿瘤抑制基因36，37（表S3）。事实上，一组前50个计算预测的泛癌肿瘤抑制基因36在我们的筛选中显著富集，但在小鼠胚胎干细胞系30、31或人肝细胞癌细胞系32我们筛选直接在生物体中筛选的第二个优点是有机会研究生物性别如何影响基因型和表型之间的关系。为了确定生物性别是否影响我们筛选中的命中率，我们比较了男性与女性所有基因的基因得分。我们确定了三个X连锁基因和九个常染色体基因对适应性具有性别特异性影响（图4B）。两性之间差异最大的基因是X连锁基因Ddx 3x和Eif 2s3x是女性特有的基因。Ddx3x和Eif2s3x均促进蛋白质合成。这两个基因都逃脱了X染色体失活，并在Y染色体上有旁系同源物Ddx3y和Eif2s3y，具有相似的功能。因此，Ddx3x和Eif 2s3x的破坏可能导致雌性肝细胞的适应性缺陷，而雄性肝细胞在功能上由Y染色体旁系同源物补充。在这种情况下，这些基因的性别特异性作用起源于性染色体水平。细胞基因组学2，100217，2022年12月14日5文章会开放获取A BC15018,35913,2669,512蛋白质编码基因在肝脏广泛表达出生后第1注射sgRNA文库4小鼠4小鼠出生后第5注射AAV-Cre收获肝脏（诱导）产后第26天收获肝脏（终点）1005000 50 100 150质粒文库中的sgRNA表示（RPM）D中位倍数变化（log2）EG0200040006000800010000 12000 14000排序基因核心必需基因（Hart et al. （2017年）小鼠间的中位倍数变化（log2）F男1Tsc 1PtenTrp53Tsc2Arid1b女1男21女2KMT2DBAP1HNF1AArid1aRb1Kmt2cIDH1FahBcl2l1NbasRint 1MCL1Npc1拉尔斯预期贫化0200040006000800010000 12000 14000核心必需基因0200040006000800010000 12000 14000核心必需基因0200040006000800010000 12000 14000核心必需基因0200040006000800010000 12000 14000核心必需基因图3.新生小鼠肝细胞适合度的基因组筛选(A) 在不同时间点通过肝脏RNA测序确定的肝脏中表达的蛋白质编码基因的数量(B) 在新生小鼠中进行肝细胞适应性的基因组规模筛选的方案。(C) 注射慢病毒文库后4天肝脏中sgRNA的表示相对于质粒文库中sgRNA的表示，表示为每百万读段n = 2只雄性和2只雌性小鼠合并到单个测序文库中。Pearson相关系数r = 0.97。(D) 筛选终点时每只小鼠每种基因的中位数倍数变化（log2）的成对比较(E) 通过小鼠中的中值倍数变化（log2）对基因进行排序，其中显著耗尽的基因由红点表示，显著富集的基因由蓝点表示（FDR0.05，通过双尾Wilcoxon检验）。核心必需基因（红色条）基于基因排序位于下方，以证明其在小鼠中的显著消耗。单侧Kolmogorov-Smirnov检验，p 2.23 10-16(F) 在四只小鼠中的每一只中，通过中值倍数变化（log2）对基因进行排序突出显示的是由肝细胞癌中的肿瘤抑制基因（预期富集，蓝色）和肝细胞活力所需的基因（预期消耗，红色）组成的对照基因集核心必需基因（红色条）基于基因等级位于通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，雄性1、雌性1、雄性2和雌性2的预期基因缺失p = 13 10- 5、1.63 10- 4、1.43 10- 4和13 10- 5，通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，雄性1、雌性1、雄性2和雌性2的通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，每只小鼠的核心必需基因缺失p 2.23 10- 16(G) Benjamini-Hochberg校正的Wilcoxon p值（-log 10）与筛选中每个基因的小鼠中位倍数变化（log 2）。突出显示的是由肝细胞癌中的肿瘤抑制基因（预期富集，蓝色）和肝细胞活力所需的基因（预期消耗，红色）组成的对照基因集。通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，预期贫化p = 3.53 10 - 6，通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，预期富集p = 4.7 3 10 - 4。参见图S3。Trp53Arid1bKmt2cRB1KMT2DMcl 1Idh 1ARID1AHnf1aBap1TSC2IDH2FahNPC1Bcl2l1NbasRint 1预期贫化TSC1LarsArid1bTrp53Rb1PtenTsc 1BapTsc 2恩巴斯Idh 2Hnf1aIdh 1ARID1AKMT2DFahBcl2l1Npc1Mcl1拉尔斯·林预期贫化Trp53Tsc 1Tsc 2PTENRB1Kmt2cIDH1Idh 2Arid1aArid1bHNF1ABAP1Mcl1Bcl2l1Fah恩巴斯Rint 1LarsKMT2DNPC1预期贫化Rint 1NPC1法拉斯BCL2L1Rb1Tsc1Tsc2 PtenTrp53恩巴Arid1bMCL1Kmt2cIDH1预期耗尽的Kmt2d预期富集Bap1Arid1aIdh 2Hnf1a中位倍数变化（log2）中位倍数变化（log2）中位倍数变化（log2）小鼠间的中位倍数变化（log2）中位倍数变化（log2）肝脏中的sgRNA表达（RPM）v中位倍数变化（log2）6细胞基因组学2，100217，2022会开放获取文章0.8其他基因肿瘤抑制基因其他基因肿瘤抑制基因ES细胞我们的屏幕0.60.0A BEif2s3xGpr146Trp53Lztr1DDX3XMcl1踝关节2BrapPdlim7Ankrd46Lpar2Cxorf380中位f雌性中位倍数变化（log2）图4.生物体中基因组规模的筛选增强了肿瘤抑制基因的发现，并发现了具有性别特异性效应的基因(A) 肿瘤抑制基因（青色，蓝色）和其他基因（黑色，灰色）的累积分数，基于小鼠胚胎干细胞（ESC）和我们的筛选中基因评分的分位数标准化中位数倍数变化（log2）通过单侧Kolmogorov-Smirnov检验，ESCs p> 0.05，并且我们的筛选p = 0.05。6.53 10-3单侧Kolmogorov-Smirnov检验。(B) 每个基因的雄性中位倍数变化（log2）与雌性中位倍数变化（log2）突出显示的是在雌性中唯一富集的基因（蓝色）、在雄性中唯一富集的基因（青色）、在雌性中唯一耗尽的基因（红色）和在雄性中唯一耗尽的基因（粉红色）。点大小与雌性和雄性之间中位log2倍数变化的绝对差异成比例参见图S4。然而，这种方法同样能够识别由两性之间的激素或其他差异引起的性别特异性影响。尽管揭示肝细胞适应性的性别特异性调节不是本研究的主要目的，但这些初步发现强调了通过在生物体中筛选来揭示这种调节主要组织相容性复合物（MHC）I类和硫酸乙酰肝素生物合成是肝细胞生长所特有的。健身在的也许生物体中基因组规模筛选的最有价值的特征是在其天然环境中研究表型的能力。这捕获了细胞与细胞外环境相互作用的所有方式，其中许多不能在细胞培养中重现。为了理解肝细胞适应性在活生物体中是如何调节的，我们首先通过对四只小鼠的统一基因评分进行基因集富集分析来寻找富集和耗尽基因中的模式我们没有鉴定出任何基因组在我们的筛选中显著富集。然而，我们鉴定了在我们的筛选中显著耗尽的几个基因集（图5A;表S4）。这些基因组包括那些以前建立的细胞培养中的适应性所必需的基因，包括核糖体、蛋白酶体、剪接体和RNA聚合酶。1，2，17，22，32，33然而，我们还鉴定了几个其他基因组，这些基因组未被证明是培养细胞所必需的，包括N-聚糖生物合成、抗原加工/呈递和糖胺聚糖生物合成/硫酸乙酰肝素。值得注意的是，这些途径都在细胞表面蛋白质的呈递或分泌中起主要作用，40，41指出可能调节来自细胞外环境的适应性，这只能通过在生物体环境中筛选来鉴定。为了确定是否有任何基因和途径确实是生物体背景下细胞适应性所必需的，我们将我们的筛选与培养物中的小鼠胚胎干细胞（ESC）和培养物中的人肝细胞癌（HCC）细胞系的32-我们鉴定了在我们的筛选中相对于在ESC或HCC细胞系中的筛选显著耗尽的几个基因集（图5B;表S4）。我们将我们的焦点转向相对于ESC筛选和HCC细胞系筛选在我们的筛选中显著耗尽的四个基因集：蛋白质输出、囊泡转运中的SNARE相互作用、抗原加工/呈递和糖胺聚糖生物合成/硫酸乙酰肝素。对于蛋白质输出和SNARE相互作用基因组，每个组中消耗最多的基因在所有筛选中被消耗，但在我们的筛选中消耗程度更大（图S5A和S5 B;表S4）。然而，对于抗原加工/呈递和糖胺聚糖生物合成/硫酸乙酰肝素基因组，一些基因在我们的筛选中仅被耗尽，表明这些途径在生物体中肝细胞适应性方面的独特要求（图5C和5D;表S4）。在抗原加工/呈递基因组内，Tapl和B2 m在我们的筛选中被独特地和显著地耗尽，分别排名为第40和第319最耗尽的基因（图5C）。这两个基因都参与并需要通过MHC I类途径在细胞表面呈递抗原。41实际上，在抗原加工/呈递基因组内，归因于MHC I类途径的32个基因中的8个在我们的筛选中被耗尽，而归因于MHCII类途径的13个基因中没有一个表现出耗尽（FDR 0.25;图S5C）。MHC I类分子通路累积分数雄性中位倍数变化（log2）会开放获取文章细胞基因组学2，100217，2022年12月14日7A BCDE F（图例见下页）会开放获取文章8细胞基因组学2，100217，2022细胞表面的细胞内抗原在细胞表面，MHC I类可以与细胞毒性CD8 T细胞和自然杀伤（NK）细胞相互作用。后一种相互作用可以通过防止NK细胞的细胞毒性来提供促存活作用。然而，单独的I类MHC的损失不足以诱导NK细胞的细胞毒性。传统上，NK细胞活化既需要瞬时信号的损失（通过MHC I类的损失），又需要活化信号的存在（在转化或感染细胞的表面上表达）。42虽然我们的筛选方法涉及肝细胞的病毒感染，但已显示由慢病毒和AAV载体引起的任何炎症在72小时内消退，43，44并且我们确实在我们的系统中没有观察到任何肝脏炎症（图S2这一结果表明，MHC I类甚至在生物体中未转化和未发炎的细胞中也可能发挥重要的存活作用在糖胺聚糖生物合成/硫酸乙酰肝素基因组中，Hs 2st 1和Ndst1在我们的筛选中被独特地耗尽（图5D）。这两种基因编码参与硫酸乙酰肝素生物合成的酶，硫酸乙酰肝素是一种与质膜或细胞外基质蛋白缀合以形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）的糖胺聚糖45种HSPG根据其位置可分为三组：细胞膜（合成蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖）、细胞外基质（聚集蛋白、串珠蛋白聚糖、XVIII型胶原）和分泌囊泡（丝甘氨酸）。为了确定对硫酸乙酰肝素的需求是否反映了对特定HSPG的需求，我们分析了筛选中单个HSPG的性能没有一个HSPG是必需的，这表明对硫酸乙酰肝素的需求是由多个HSPG执行的冗余功能引起的（图S5D）。确实有证据表明syndecans可以冗余地发挥作用。46这些跨膜HSPG发挥多种作用，包括促进细胞与细胞外基质的附着，保护细胞因子和生长因子免受蛋白水解，以及作为其他跨膜受体的共受体因此，这些HSPG与细胞外基质和细胞表面的数百种其他蛋白质相互作用为了深入了解这些相互作用是否对肝细胞适应性至关重要，我们分析了在我们的筛选中建立的与HSPG相互作用的蛋白质如何进行。47、我们看到了一个小小的幸福，敲除这些基因导致肝细胞中显著的适应性缺陷（图5E）。这包括B2m以及生长因子受体Insr、Met和Lgr 4。这三种生长因子受体在已知的肝细胞有丝分裂原下游发出48，49因此，肝细胞中硫酸乙酰肝素生物合成的需要可能是通过HSPG增强细胞表面的促存活或增殖信号。为了检查通过替代方法破坏硫酸乙酰肝素生物合成的后果，我们使用了正交AAV载体系统，其中我们可以递送靶向NDST 1的短发夹RNA（shRNA），从而敲低整个肝脏或单个肝细胞中的NDST 1蛋白（图S5E）。为了确定NDST 1的丧失是否损害肝细胞增殖，我们用编码靶向NDST 1的shRNA的AAV与GFP报告基因 （ AAV-shNDST 1 ） 和 编 码 scramble shRNA 的 AAV 与mCherry报告基因（AAV-shScramble）的低剂量混合物注射新生小鼠我们通过对增殖标志物Ki67以及荧光报告基因进行免疫染色，比较了表达靶向NDST 1的shRNA的细胞与表达scrambleshRNA的细胞在同一肝脏内的增殖。与对照敲低肝细胞相比，我们观察到NDST 1敲低肝细胞的增殖显著降低，与我们的筛选结果一致（图5F）。因此，我们发现硫酸乙酰肝素生物合成途径中的酶是肝细胞以细胞自主方式增殖所必需的这一发现，加上上述观察，即许多生长因子受体对肝细胞适应性至关重要，建立与硫酸乙酰肝素相互作用，表明硫酸乙酰肝素可能通过增强生长因子信号传导促进肝细胞适应性。进一步的实验对于建立硫酸乙酰肝素促进肝细胞适应性的具体机制将是重要的。讨论在此，我们成功地开发了一种直接在单个小鼠内进行基因组规模CRISPR筛选我们的方法图5.I类MHC和硫酸乙酰肝素生物合成是生物体中肝细胞适应性的独特要求(A) KEGG基因集在筛选终点显示显著耗竭（FDR q <0.05），按FDR q值（-log 10）排序。延伸到图的末端的条表示FDR q值为0。(B) KEGG基因组在我们的筛选中相对于小鼠ESC（深灰色条）或人肝细胞癌（HCC）细胞系（浅灰色条）中的筛选表现出显著的缺失（FDR q 0.05），通过我们的筛选相对于小鼠ESC的FDR q值（-log 10）进行排名延伸到图的末端的条表示FDR q值为0。(C) 在分位数标准化ESC筛选、HCC细胞系筛选和我们的筛选中，KEGG基因组中用于抗原加工和呈递的基因的中值倍数变化（log2）在我们的屏幕中唯一缺失的基因以红色突出显示框的边界表示第一和第三四分位数，须线延伸到最远的数据点，该数据点在四分位数间距的1.5倍内。(D) 在分位数标准化ESC筛选、HCC细胞系筛选和我们的筛选中，用于糖胺聚糖生物合成和硫酸乙酰肝素的KEGG基因组中的基因的中值倍数变化（log2）在我们的屏幕中唯一缺失的基因以红色突出显示框的边界表示第一和第三四分位数，须线延伸到最远的数据点，该数据点在四分位数间距的1.5倍内。(E) 在我们的筛选中，硫酸乙酰肝素相互作用组中基因的中值倍数变化（log2）。框的边界表示第一和第三四分位数，须线延伸到最远的数据点，该数据点在四分位数间距的1.5倍内。(F) 用于确定NDST 1敲低对肝细胞增殖的影响的方案（上图）。来自出生后第15天的注射了出生后第5天的AAV-shNDST 1和AAV-shScramble的基因组拷贝（GC），对Ki 67（白色）、GFP（绿色）和mCherry（品红色）进行免疫染色，并对Hoechst（蓝色）进 行复染（左图）。比例尺，25mm。通过相对于shScramble肝细胞的shNDST 1肝细胞中Ki67阳性推断的增殖定量（右图）。条和须分别表示小鼠间的平均值和标准差，实心圆和空心圆分别表示雄性和雌性小鼠的n = 2只雄性和2只雌性小鼠，每只小鼠每个shRNA 200个细胞**p = 0.0023，双尾Fisher参见图S5。会开放获取文章细胞基因组学2，100217，2022年12月14日9该方法涉及将基因组规模的sgRNA文库慢病毒递送至新生可诱导的Cas9小鼠，随后在动物一生中的任何时间点进行Cas9诱导和表型选择我们应用这种方法来揭示新生儿肝脏中我们的筛选在单个小鼠中可靠地鉴定毫不奇怪，我们发现新生儿肝脏中的肝细胞与培养中的细胞有许多共同的适应性要求。然而，我们还发现了对肝细胞适应性具有性别特异性影响的基因，以及生物体中肝细胞适应性所需的独特基因。具体地说，我们发现肝细胞在肝脏中，而不是在文化中的细胞，是依赖于MHC I类和硫酸乙酰肝素的我们表明，敲低硫酸乙酰肝素生物合成酶NDST 1以细胞自主方式损害肝细胞增殖。硫酸乙酰肝素促进细胞增殖的具体机制，如果这在其他组织中也成立，将是未来的重要方向。值得注意的是，这一发现提供了一个重要的考虑因素，越来越多的兴趣，在抗病毒治疗，干扰HSPG作为一种手段，防止进入不同的病毒。50最后，通过筛选培养物中的单个细胞系，我们无法发现肝细胞适应性的性别特异性要求或生物体特异性要求。我们的筛选我们的方法提供了一个适应性强，可访问的方法，在一个活的小鼠不同表型的公正和全面的遗传解剖。sgRNA文库在肝脏中的稳定性和Cas9的诱导性质允许在动物一生中的任何时间点进行表型选择如在我们的筛选中，可以通过评估大量肝细胞群体随时间的变化来进行这种选择。或者，可以通过从肝脏分离肝细胞并富集单细胞表型来进行选择。Cas9诱导和表型选择的这种组合灵活性使得该方法成为用于筛选跨越普遍细胞现象、发育和老化、肝细胞特异性功能和肝病的无数过程的有力工具。此外，考虑到生物性别对生理学和疾病的影响程度，研究生物性别和基因功能之间相互作用的能力为这项技术提供了更大的价值。重要的是，这些不同的应用都是触手可及的，因为这种多功能的方法可以很容易地扩大规模，但最低限度地需要一只小鼠和比细胞培养筛选更少的试剂仅在肝脏中进行基因组规模的CRISPR-Cas9筛选就有能力为哺乳动物生理学和疾病的各个方面提供新的见解将该技术引入其他组织将类似地基于在这些组织中实现稳定的、高覆盖率的sgRNA递送的能力。这将需要开发有效的慢病毒递送到肝脏以外器官的一旦在任何机构建立，我们的总体方法可以容易适应于结合其他基于CRISPR的技术，包括CRISPR干扰和激活。因此，我们的系统建立了可行性和基础基因组规模的筛选在一个活的有机体。这个平台的建立和扩展将把曾经局限于细胞培养的实验易操作性带到活的生物体中，使人们能够前所未有地深入了解哺乳动物的生理和疾病。该研究在我们的方法中，我们通过在慢病毒基因组中编码肝细胞特异性启动子驱动荧光报告基因的表达来评估慢病毒感染肝细胞的能力仅凭这一点，我们无法确定我们的慢病毒是否靶向肝脏中的其他细胞类型。 然而，因为我们用编码来自肝细胞特异性启动子的Cre的AAV载体诱导Cas9，所以基因编辑和sgRNA丰度的变化应该对肝细胞特异。我们还注意到，虽然我们可以在单个小鼠中鉴定出显著富集和耗尽的基因，但我们通过筛选多个小鼠并组合所有小鼠的数据来因此，对于寻求最大化显著命中数或比较雄性和雌性之间命中数的实验，建议筛选并合并来自两个以上雄性和两个以上雌性的数据。最后，我们注意到，我们的筛选进行了三周的时间，这相当于大约三个肝细胞群体倍增。在更长的时间段内扩展该筛选，包括更大数量的群体倍增酶，可能会发现在整个生物体的背景下特异性调节肝细胞适应性的其他基因和途径。STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统B动物B细胞系d方法样本B载体构建B慢病毒制备和浓缩B免疫染色B图像分析B苏木精-伊红染色B免疫印迹BRNA测序BsgRNA文库制备B基因组DNA分离B测序文库制备和测序B筛选分析会开放获取文章10细胞基因组学2，100217，2022d量化和统计分析B统计分析B软件补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2022.100217。致谢我 们 感 谢 Whitehead 研 究 所 功 能 基 因 组 学 平 台 的 Mehreen Khan 和 KeyaViswanathan提供的技术援助; Whitehead研究所基因组技术核心的AmandaChilaka和Sumeet Gupta提供的高通量测序; Whitehead研究所生物信息学和研究计算核心的Inma Barrasa提供的R