侧流式免疫测定中心的自动清洁装置：Alexa Fluor-647和铕纳米颗粒在心肌肌钙蛋白I检测中的应用

科学讲座5（2023）100151在用于检测肌钙蛋白ISatheesh Natarajana，Jayaraj Josephba印度技术学院医疗保健技术创新中心，Chennai 600113，印度b印度马德拉斯理工学院电气工程系，印度钦奈600036自动清洁装置保留字：Alexa Asiuor-647侧流式免疫测定EuNPs心肌肌钙蛋白I定量A B标准侧向荧光免疫分析（LFIA）的检测限主要取决于试剂盒开发中使用的报告标记的性质在这项拟议的工作中，我们比较了两种报告材料（1）Alexa Fluor-647和（2）化学组成不同的铕纳米颗粒。使用一种目标分析物-心肌肌钙蛋白I（cTnI）（急性心肌梗死（AMI）的敏感早期标志物）对该检测进行 报告材料通过Alexa荧光素-647的物理吸附和铕纳米颗粒的共价键合用cTnI抗体标记。在最佳条件下，血清样本中Alexa荧光素标记mAb（FLFIA）的LOD为0.01 ng ML −1，铕纳米颗粒标记mAb（ELFIA）的LOD为0.001 ng ML −1。患者样本的血清加标蛋白cTnI，FLFIA和ELFIA的回收率分别为4.5（试验内）和4.7（试验间） 结果表明，基于铕的检测方法比基于标准有机物的检测方法更灵敏，所有检测均在15min内完成。V i deo n andP re se nt t 或g/10.1016/j。我的天啊。2023. 1001511. 介绍在COVID-19大流行期间，迫切需要一种快速、成本全面、精确的疾病检测诊断设备。尽管侧向流动试验证明是最佳的低灵敏度、假阴性、假阳性结果和非特异性，但试验结果使侧向流动装置不太适合检测疾病，必须使用RT-PCR进行确认。为了考虑侧向电泳测定的高度可靠性，已经进行了许多努力来提高灵敏度并避免结果的交叉反应性在所采取的几项措施中，其中一些措施是增强所利用的有机染料、荧光纳米颗粒、定量读取器、测定时间优化，金纳米颗粒（AuNPs）是最广泛使用的报告染料;主要原因是其功能性，尺寸可调性及其光学性质和高化学稳定性。虽然彩色乳胶珠具有相同的特性且具有成本效益，但生物相容性明显较低且易于获得[2]。有机染料显示由于量子点的灵敏度大大增强，量子点耐光漂白，并且两者都具有关于尺寸的独特可调光学性质[1，2]。虽然上述记者表现出更好的效果，但每个人都有自己的挫折。金纳米颗粒和彩色乳胶珠的灵敏度较低，只能用于比色检测方法[3，4]。荧光团和量子点显示出比金纳米颗粒和有色乳胶珠更好的灵敏度[5，6]。荧光团不是光稳定的[1，7]，并且量子点不是成本有效的并且显示间歇的开/关行为[8]。此外，量子点与水性介质不相容[1，9];此外，这些荧光报告物需要连续激发，这导致来自散射激发和自发荧光的背景增加，这通常使光学读取器进行读取变得复杂[10]。 为了减少背景噪声，引入了使用镧系纳米颗粒的读取器[11]。这些镧系元素纳米颗粒显示出比传统的有机报告染料更长的发射因此，在激发和发射之间进行小的中断以衰减背景信号。尽管这些报告子具有更好的灵敏度质量，但它们具有光稳定性问题，因此需要更好地处理时间延迟[10]。通讯作者。电子邮件地址：satheesh@htic.iitm.ac.in（S.Natarajan），jayaraj@ee.iitm.aic.in（J. Joseph）。h tt p：//dx. 多岛或g/10。1016/j。我的天啊。20 23。1 0 0 15 1接收日期：2022年10月14日;接收日期：2022年12月30日;接受日期：2023年2月3日27 7 2 - 56 93/©2023TheA ut h o rs. 由E lsevierL td提供。 这是CCBY许可证下的一项操作（http：//creaitivecommons.com/）。或g/li ce ns s/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表科学讲座杂志首页：www.elsevier.es/sctalkS. Natarajan，J.约瑟夫科学讲座5（2023）10015122. 材料和方法2.1. 试剂和设备铕 纳 米 颗 粒 （ EuNP ） 购 自 Thermo Scienti fic，Waltham，MA，USA ， 并 且 Alexa Fluor-647 购 自 Sigma-Aldrich 。 牛 血 清 白 蛋 白（BSA）、蔗糖和Tween-20购自Sigma-Aldrich （ St. Louis ， MO ，USA）。所有溶液均用超纯milli-Q水制备。为了构建侧向流动测定（LFA）条，硝化纤维素膜（FF 120H）和吸收垫（CF 6）购自Cytiva，Chicago，IL，USA。纤维素样品垫（CFSP203000 ） 和 玻 璃 纤 维 结 合 垫 （ GFCP 083000 ） 购 自 Millipore ，Burlington，MA，USA。在试验线中使用1 mg/ml抗cTnI（Hytest，芬兰）。 使用0.4mg/ml的生物素化BSA（SRL chemicals，India）作为对照 线 。 为 了 制 备 铕 缀 合 物 ， 使 用 探 针 超 声 仪 （Sonics Materials，Newtown，CT，USA Ref. VCX130PB220）。2.2. 铕结合cTnI活化缓冲液−25mm MES（pH 6.1），磷酸盐缓冲液（pH 7），封闭缓冲液1×PBS，2% BSA。稀释缓冲液−25mmTBST缓冲液-（1×TBS缓冲液，0.05%吐温-20）。向磷酸盐缓冲液中加入10μl铕，然后加入1.2 Omm磺基-NHS，并在室温下在振荡器中以IlOOrpm孵育15分钟。为了除去过量的EDC和磺基-NHS，以15，000 rpm离心15 min，弃去上清液，用MES缓冲液洗涤沉淀，并加入0.05 mg活化铕的检测抗体在室温下孵育2小时孵育后，加入2% BSA，孵育1 h，并以15，000 rpm离心15 min。弃去上清液，加入1 ml 20 mm Tris缓冲液，溶解沉淀，并再次以15，000rpm离心15 min。最后弃去上清液，悬浮于10 μlTris缓冲液中，4 ℃保存备用。2.3. Alexa Ammuor-647与cTnI的偶联将检测抗体（cTnI的克隆19C7）与偶联荧光有机染料Alexa Fluor647偶联。简单地说，cTnI@1mg/ml的检测抗体与有机染料（过量20 M）在室温下结合1h。结合后，通过Sephadex柱上的尺寸排阻色谱纯化缀合物混合物。将纯化的缀合物储存在4 °C下直至使用。2.4. 基于荧光（FLFIA）和铕（ELFIA）作为信号发生系统的侧向荧光测定如图所示。 1，FLFA和ELFA的侧向逆流测定条，由不同的组件组成;（1）用于加载样品的纤维素基样品垫;（2）用于在测定期间保持和释放缀合物混合物的缀合垫;（3）硝酸纤维素试验，由抗cTnI抗体（1 mg/ml的试验线（T线）和0.5 mg/ml的对照线（山羊抗小鼠IgG抗体）组成;（4）最后，末端的吸收垫用作发动机，防止逆流。该侧向电泳测定的操作方法是由有机染料和目标分析物心肌肌钙蛋白组成的缀合物混合物在测试膜上的分子结合整个过程大约需要15分钟。 在此期间，样品垫上的样品在结合中润湿干燥的结合混合物并结合第一个复合物（样品中的分析物和结合混合物），两者中的分析物迁移到测试条的下一部分，即测试膜。固定在膜的特定区域的捕获抗体通过捕获线捕获样品分析物和缀合物结合物MIX的EX cess移动并结合控制线，并最终被捕获在吸收弯曲垫中。测试线中颜色强度的强度等于样品分析物的量，其成正比。《青春》用iQuant-TRF和iQuant-TRF分别读取LFIA和ELFIA的条带。读取器显示了阳性和阴性结果。3. 结果和讨论在侧向荧光测定中使用的有机染料Alexa Euphuor-647和稀土盐-铕标记LFIA通过毛细管回流法进行LFIA性能的操作方式是抗体-抗原结合，如抗原-抗体，主要使用的材料是报告材料类型、尺寸及其光学性质、膜孔隙率和标记抗体在每个膜中的流动速率，其可以促进抗体-抗原复合物在测试区上的形成。在LFIA中获得的定量依赖性与显性抗原结合因子可能不同。这里实施的测定是夹心形式，其中样品分析物在与检测抗体缀合的报告染料和固定在测试区中的捕获抗体之间复合，这是用于大尺寸多价抗原的非常常见的方法，以获得更好的灵敏度。此外，LFIA夹心形式的结果直接取决于样品中分析物的量以及报告染料与分析物和抗体的有效结合。在这篇文章中，我们比较了报告材料，一种是有机染料，另一种是夹心形式测定中的荧光纳米颗粒，以观察信号的更好增强对于不同的报告分子材料，基于报告分子的大小选择工作膜 用两种不同孔 径 的 膜 [2] ： FF180-HP （ 135-175s/40mm）和FF120-HP（90-150s/40mm）。我们将测试条硝酸纤维素层与测试线和对照线以及吸收膜组装在一起。为了获得更好的效果，增加了接合垫包括样品垫膜。3.1. Alexa Ammuor-647侧向荧光测定（FLFIA）由于心肌肌钙蛋白I是64 kDa的高分子量分子，在本研究中，我们首选夹心LFIA形式测定。在此，样本（血清）中存在的心肌肌钙蛋白I（cTnI）被夹在cTnI结合物和固定在试验膜上的特异性抗cTnI抗体之间。用两种不同报告染料（Alexa荧光素-647和铕）标记的抗cTnI抗体的结合首先被目标分析物cTnI占据。 然后复合物随着毛细管力矩进一步移动并与捕获抗体结合，形成的信号通过不同的检测技术检测。由于这是夹心形式，在试纸测试线上形成的信号强度与样本中cTnI分析物的浓度成正比 对于用于检测本测定中用于侧向流的单克隆抗cTnI抗体的免疫特性的初步表征，先前通过基于ELISA的检测证实了其高亲和力，并允许在本工作中开发LFIAs。有机染料为基础的LFIA的方案是在图。凌晨1 对于LFIA，应用cTnI结合物和抗小鼠IgG分别形成供试品和对照品线。将标记有机染料的特异性检测抗体固定在玻璃纤维结合垫上。优化了侧向流动测定条件，以达到最低检测限。 结果表明，有机染料为0.5ng/ml，ELFIAs为0.2ng/ml，抗小鼠IgG为0.5mg/ml。使用以下分析物范围（0 - 250 ng/ml）绘制了两种报告基因的测定标准图。在最佳实验条件下，基于有机染料的LFIA在0-250 ng/ml范围内呈线性关系，检测限为0.1 ng/ml（图1）。 Ib）测定的持续时间为15分钟。S. Natarajan，J.约瑟夫科学讲座5（2023）1001513VR3.2. 基于EU-TRF的LFIA（ELFIA）ELFIA的方案如图所示。凌晨2 对于铕基LFIA，以降低背景噪声为目标选择检测膜，优化参数为检测抗体浓度、捕获抗体浓度和校准曲线，分析物浓度范围为0 ~ 250 ng/ml。 对于该测定，使用孔径和流速不同的测试膜HF120和HF 180（Millipore）。使用具有更大孔径的HF 120微孔膜（数据未显示）有助于实现更高的信号强度（观察到HF 180 膜中的强度降低20%），因此HF-180显示非特异性结合，并且还确保了样品的均匀移动试验优化的下一步是选择减少非特异性结合并提供更高信号强度的化学品BSA（1%）作为非特异性形式的辅助化学品，实现了更高的信号强度此外，必须添加更有效的洗涤剂追逐缓冲液[12]。加入吐温-20（0.05%）至追踪缓冲液中可消除检测区中EU标记抗体的非特异性吸附，并使信号强度增加15%。 与BSA和蔗糖一起加入缓冲液以降低流速。[13 ]第10段。对于测定中铕的量，我们使用0.1至0.4 ng/ml范围内的铕，其中0.4ng/ml缀合物浓度显示出最佳的荧光强度。图2b显示了LFIA中基于铕的cTnI 检测的校准曲线。 检出限为0.001 ng/ml，线性范围为0 ~ 250ng/ml。15 min内获得的结果。信号强度与样本中cTnI浓度成正比。然而，EU时间分辨技术由于其极低的浓度检测水平而更具吸引力[14，15]设计了一个新的TRF读者与AF-647相比，铕LFIA是当今可用的更快，更便宜的实验室技术，可以在智能手机或手持阅读器的帮助下进行定量[16，17]。为了评价基于AF-647和ELFIA的测定的精密度和重现性，使用50ng/ml、100 ng/ml和250 ng/ml标准cTnI样本进行了试验内和试验间分析。AF-647和ELFIA的试验内CV和试验间CV分别为4.8%和4.7%（表1），证明ELFIA方法具有较高的重现性和良好的精密度。关于条带的稳定性，AF-647和ELFIA试剂盒均保持其荧光强度稳定6个月，并保留其生物活性（数据未显示）。4. 结论在当前的研究中，LFIA方法被用来检测cTnI的AMI的AF 647和铕纳米粒子的帮助下该测定使用夹心形式。 以有机染料（AF 647）为基础的LFIA的特征在于检测限为0.1 ng/ml。用铕纳米颗粒代替AF-647标记物导致灵敏度增加（检测限为0.001 ng/ml）。基于ELFIA的cTnI LFIA是针对LFIA生物传感器缺乏灵敏度和定量分析限制的挑战而开发的 建议EU-TRF-LFIA，它具有高灵敏度。这意味着用于定量LFIA的便携式铕基读取器可以促进敏感的床旁检测。图和表3.02.52.01.51.00.50.0FLFIAy = 3E-07x2 + 0.0092x + 0.0981R² = 0.99810 50 100 150 200 250cTnI（ng/ml）图1.一、a. 使用有机染料AF 647的cTnI夹心LFIA的说明性图片B. AF 647定量测定的侧流试验灵敏度(A)基于AF-647的侧向荧光检测条用于cTnI检测的线性响应;缓冲液中的浓度范围为0 ng/mL至250 ng/mLS. Natarajan，J.约瑟夫科学讲座5（2023）100151432.521.510.50ELFIAy = 1E-05x2 +0.0145x +0.027R² = 0.99730 50 100 150 200 250cTnI（ng/ml）图二、a. 使用铕纳米颗粒的cTnI夹心LFIA的示意图B. 侧流式细胞术定量EU-TRF的灵敏度（A）用于cTnI检测的基于EU-TRF的侧向流动测试条的线性响应;缓冲液中的浓度范围为0 ng/ml至250 ng/ml表1基于有机染料的FLFIA的批间和批内结果cTnI浓度（ng/ml）试验间AF-647EU-TRF是说SDCV是说SDCV5010.86.04.511.55.54.215035.91.74.941.21.54.5250131.80.55.1139.50.54.9表2基于铕纳米颗粒的ELFIA的试验间和试验内结果cTnI浓度（ng/ml）试验内AF-647EU-TRF是说SDCV是说SDCV5012.75.24.713.25.33.715037.53.25.242.82.83.2250137.20.74.5141.50.73.5VRS. Natarajan，J.约瑟夫科学讲座5（2023）1001515CRediT作者贡献声明Satheesh Natarajan：概念化，方法论。Jayaraj Joseph：数据策展，写作数据可用性数据将根据要求提供确认资金来源：这项研究没有从公共，商业或非营利部门的资助机构获得任何特别资助。申报利益作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作。引用[1] M. Sajid等人，Designs，formats and applications of lateralblood flow assay：aliteraturereview，J. Saudi Chem.Soc.19（6）（2015）689-70 5.[2] M.A. Mansfield，用于侧流免疫测定的硝化纤维素膜：技术鉴定。侧流免疫测定，Springer，20091-19。[3] W. Yang等人， 一种基于胶体金探针的银增强免疫显色法，快速检测相思豆毒素a的拓扑分析法，Biosens.生物电子。26（8）（2011）3710-3713。[4] C. Zhang等人，《使用金颗粒和辣根过氧化物酶作为示踪剂快速测定农产品中西维因和硫丹的多分析物穿透和侧向穿透测定法的开发》，《农业食品化学杂志》，54（7）（2006年），第2502-2507页。[5] A. Foubert等人，胶体金和量子点作为生物标记物的比较研究多重筛选试验用于多种真菌的检测，分析。Chim. Acta 955（2017）48-57。[6] L.G. Lee等人，A low-cost，high-performance system for fluorescencelateral fluorescenceassays，Biosensors（Basel）3（4）（2013）360-37 3.[7] Q. Zheng等人，活性氧物种对光漂白的 贡献有机荧光团，光化学。光生物学 90（2）（2014）448-45 4.[8] B. Mahler等人，朝着不闪烁的胶体量子点，自然。Mater. 7（8）（2008）659-664。[9] M.A. Walling等人，量子点活细胞和体内成像，国际。J. 摩尔Sci. 10（2）（2009）441-491。[10] A.S. Paterson等人，持续发光铝酸锶纳米颗粒作为横向荧光测定中的报告者，Anal. 86（19）（2014）9481-9488。[11] Z. Ye等人，新型铕螯合物掺杂的二氧化硅纳米粒子：分离、表征和时间分辨荧光测量应用，J. Mater. 14（5）（2004）851-85 6.[12] Y. Xu等人，基于荧光探针的侧向荧光测定法用于多重核酸检测，分析。86（12）（2014）5611-5614。[13] I. Andreeva等人，血清中总前列腺特异性抗原的定量侧向荧光免疫测定，分析。Lett. 49（4）（2016）579-58 8.[14] J. Tang等人，碳纳米点具有有效的FRET，用于实时监测药物输送和双光子成像，Adv.Mater。25（45）（2013）6569-6574。[15] 高Zhao等人，复杂基质中磷酸盐的高选择性检测用铕调节的碳量子点的开关荧光探针，Chem.Commun. 47（9）（2011）2604-2606。[16] H. Li等人，水溶性碳量子点与光触媒设计。Chem.Int.Ed.49（26）（2010）4430-4434。[17] Y. Liu等人，等离子体增强的碳点-二氧化硅混合介孔球的光致发光，J。Mater.Chem. C3（12）（2015）2881-2885.Satheesh Natarajan博士拥有农业科学背景，并于2006年获得斯洛伐克共和国夸美纽斯大学从那时起，他在生物化学、传染病和分子免疫学方面积累了丰富的经验。Satheesh在ICGEB工作，研究B细胞在利什曼病中的作用。他曾在40多个国际同行评审期刊上发表文章，并在30多个国际期刊上发表论文目前，IIT Madras的医疗保健技术创新中心正在开发基于抗体和适体的低成本即时诊断设备他在电化学传感器方面知识渊博，并且在CRISPR/CAS诊断系统方面知识渊博 最近获得SERB-DST资助，用于癌症治疗的抗体开发和免疫诊断。开发并评价心肌肌钙蛋白I、创伤性脑损伤标志物和慢性肾脏疾病标志物的定量侧向电泳测定。时间分辨荧光免疫分析仪的开发和评价，以提高侧向荧光检测的灵敏度。EX擅长通过重组DNA技术和无细胞表达系统开发抗体擅长使用BIOCORE系统开发抗体的配体结合。在使用SELEX方法选择适体和开发基于适体的慢性肾脏疾病标志物定量侧向Jayaraj Joseph博士在医疗器械设计和开发方面拥有超过10年&的经验，在加入IIT Madras之前，他曾担任医疗技术创新中心（该国领先的医疗技术研发中心）的系统架构师和首席技术专家。他曾与GE、BD、Stryker等行业领导者以及医疗器械领域的多家中小企业和初创企业合作，进行研究和产品开发，参与各种项目，包括移动眼科手术台、新生儿救护车、新生儿培养箱、使用超声波的血管筛查设备、生命监测系统和免疫分析仪。他有150多篇出版物，5项已获专利，20多项正在申请中。他执行了超过Rs。在免疫分析仪设计开发领域拥有价值20亿的行业项目&-在过去的十年里博士 Joseph在HTIC，IITMadras领导了印度第一台自主研发的便携式定量免疫分析仪-iQuant®分析仪的设计&开发&，该分析仪随后由印度领先的诊断行业公司JMitraCoPvt商业化。公司iQuant®产品的三种变体已经开发、验证，迄今为止已现场部署了近100台仪器。iQuant ®分析仪已根据国际标准（NGSP）获得认证（NGSP），可使用JMitra开发的Quanti®系列LFIA试剂盒对HbA 1C和其他标志物（如维生素D、TSH、T3、T4和CRP）进行定量。 第一个iQuant变体使用了一个基于共焦光学的传感模块，该传感模块使用激光源、二向色和薄膜过滤器以及基于精确丝杠的计算机化机电系统，以使用荧光法扫描&定量横向流动测定试剂盒。 随后的版本使用LED照明来提高稳健性，最终版本（iQuant Xi）采用了一种简化的非接触式成像系统，消除了对机电扫描的需求&-从而提高了可靠性并降低了制造成本，同时还允许实时跟踪免疫化学反应进程和测试的流程特征，从而允许现场质量控制以消除测试准备错误-这是现场部署即时检测（POCT）设备期间的一个主要问题。此外，该设备还集成了触摸屏显示器，定制设计的UX，数据审查和分析后端，以及对数据备份&的云支持。博士 Joseph还开发了基于毫微流体的横向流动试剂盒，该试剂盒集成了关键的样品制备试剂，以减少分析前的错误，以及基于化学计量学的仪器，用于中小型实验室的中等通量自动化测试要求。一个基于智能手机的定量免疫分析仪原型也被开发出来，并在Dr。约瑟夫的指导。博士 Joseph还设计了基于时间分辨荧光的免疫分析仪读数器，可以减少LFIA试剂盒中看到的背景信号的影响，以提高检测的分析灵敏度和动态范围。TRF分析仪用于开发用于创伤性脑损伤标志物（GFAP）的LFIA试剂盒，其需要亚ng/mL灵敏度。博士 Joseph还为一家IIT初创公司开发了一种基于比色法的便携式分析仪，用于使用基于表面界面现象的穿透式测定试剂盒快速检测脓毒症，该试剂盒可检测革兰氏+ve和革兰氏-ve细菌。该器械已在临床样本中得到在IIT马德拉斯，博士。Joseph还致力于开发具有成本效益的LFIA试剂盒和定量免疫测定阅读器，用于多种临床上有影响力的标志物，如胱抑素（肾功能标志物），肌钙蛋白-I（心脏标志物），GFAP（创伤性脑损伤标志物），ADAM 12（乳腺癌标志物）与多个研究和临床合作伙伴合作。博士约瑟夫也是一个多机构的卓越中心的一部分，专注于肿瘤治疗诊断应用的抗体开发