CRISPR-Cas13d指导RNA资源优化用于模式生物和RNA病毒全转录组的靶向设计

资源用于模式生物和病毒RNA病原体的全转录组Cas13指导RNA设计图形摘要亮点d用于mRNA和非编码RNA敲低的优化的CRISPR-Cas 13 d指导RNAd用于6种模式生物和4种RNA病毒家族的d得分最高的指导RNA改善了人类和小鼠非编码RNAd基于Web的界面支持定制RNA靶标作者郭欣怡，Jahan A. Rahman，Hans-Hermann Wessels，放大图片作者：Alejandro Me' nan-Mancilla，Daniel Haro，Xinru Chen，Neville E. Sanjana对应neville@sanjanalab.org简言之为了加速基于CRISPR的RNA靶向，Guo等人提出了一种优化的RfxCas13d指导RNA（gRNA）资源，以靶向六种常见模式生物和四种RNA病毒家族中的信使RNA和非编码RNA。附带的开放获取基于网络的平台和设计工具可以为任何RNA靶标实现最佳gRNA设计。Guo等人，2021，细胞基因组学1，1000012021年10月13日？2021作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.100001会会开放获取资源用于模式生物和病毒RNA病原体的全转录组Cas13指导RNA设计郭欣怡，1，2贾汉A.Rahman，1，2Hans-Hermann Wessels，1，2Alejandro Me' nounc-Mancilla，1，2DanielHaro，1，2Xinru Chen，1，2和Neville E.Sanjana1，2，3，*1New York Genome Center，New York，NY 10013，USA2纽约大学生物系，纽约，NY 10003，USA3引线触点* 通讯地址：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.100001neville@sanjanalab.org总结RNA靶向CRISPR核酸酶的最新表征已经实现了多种转录组工程和筛选应用，这些应用关键地依赖于优化的CRISPR向导RNA（gRNA）的预测和选择。之前，我们开发了一个计算模型来预测所有人类蛋白质编码基因的RfxCas13d gRNA活性。在这里，我们将这一框架扩展到六种模式生物（人类，小鼠，斑马鱼，苍蝇，线虫和开花植物）的蛋白质编码基因和非编码RNA（ncRNA），也包括四种RNA病毒家族（严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型[SARS-CoV-2]，HIV-1，H1N1流感和中东呼吸综合征[MERS]）。 我们包括实验验证的预测，通过测试敲除多个ncRNA（MALAT1，HOTAIRM1，Gas5，和Pvt1）在人类和小鼠细胞。我们开发了一个免费提供的基于网络的平台（cas13design），该平台具有预评分的gRNA，用于在几种生物体中进行转录组范围的靶向，以及一个交互式设计工具，用于预测用户输入的定制RNA靶标的最佳gRNA。该资源将促进CRISPR-Cas 13 RNA在模型生物中的靶向，这是对人类健康的新病毒威胁介绍CRISPR-Cas 13通过直接RNA靶向在人类细胞中介导稳健的转录物敲低1-4与DNA靶向CRISPR酶如Cas9相比，Cas 13的RNA靶向是转录物和链特异性的;它可以区分并特异性敲低加工的转录物、选择性剪接的同种型和重叠基因，所有这些基因通常具有不同的功能。最近针对不同生物体中不同类型转录物的几项研究已经证明了CRISPR-Cas 13 RNA敲低的广泛适用性。在哺乳动物系统中，CRISPR-Cas 13靶向已用于选择神经退行性变细胞模型中的特定同种型，5以鉴定调节癌症表型（如化疗耐药性6和肿瘤增殖）的非编码转录物，7并通过靶向切割病毒RNA来阻断RNA病毒感染。8，9Cas13转录组修饰也已在体内应用于多种生物体，包括果蝇、10，11斑马鱼胚胎、12小鼠胚胎、12和植物。[13]尽管人们对靶向生物体中不同类型的转录物越来越感兴趣，但生物医学界缺乏资源来促进非编码RNA（ncRNA）、 6 、 7病毒RNA、8、9和其他常用生物体中蛋白质编码转录物的优化Cas13d指导RNA（gRNA）的简单设计5、10-13之前，我们使用大规模平行筛选方法来确定RfxCas13d gRNA的一组最佳设计规则，并开发了一个计算模型来预测所有人类蛋白质编码基因的gRNA功效。[14]在这里，我们扩展了这个框架，以预测六种模式生物（人类、小鼠、斑马鱼、苍蝇、线虫和开花植物）和四种丰富的RNA病毒家族（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型[SARS-CoV-2]、HIV-1、H1N1流感和中东呼吸综合征[MERS]）中信使RNA和ncRNA的优化Cas 13 gRNA。对于四种ncRNA，我们通过比较人和小鼠细胞系中预测的高功效和低功效gRNA的Cas13敲低来实验性地验证这些预测。为了允许更灵活的gRNA设计，我们还开发了一个开放访问的基于Web的应用程序，以便能够预测用户输入的任何RNA靶标的最佳Cas13dgRNA结果为了选择从人、小鼠、斑马鱼、苍蝇、线虫和开花植物的参考基因组产生的转录物的最佳gRNA，我们创建了cas 13 design在线平台（https://cas13design.nygenome.org/;图1A）。我们之前发现，最佳的Cas13 gRNA依赖于特定的序列和结构特征，包括基于位置的核苷酸序列。CellGenomics 1，100001，October 13，2021 <$2021作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取资源2Cell Genomics1，100001，2021一B C预测四分位数Q1 Q2Q3mRNAQ4ncRNA1.5预测四分位数Q1Q41.000.7599.599.899.8九十九点九98.4九十九点二99.699.993.683.725.3八十三点七10.500.50.250.00物种0MALAT1 HOTAIRM1气体5 Pvt1人（HAP 1）小鼠（3T3）靶转录物图1.针对六种常见模式生物的(A) cas13design webtool的输出示例（1）模式生物的选择（2）通过gRNA设计的基因符号或转录本ID进行检索，并可选择下载生成的图和数据表。(3)沿着靶转录物的gRNA的交互式显示，通过分成四个四分位数的预测靶向功效评分进行颜色编码。Q4 gRNA对应于具有最高预测功效的那些，Q1 gRNA对应于具有最低预测功效的那些。(4)通过错配数量（转录组中具有0、1或2个错配的序列数量）显示具有中靶分数预测和潜在脱靶的gRNA选项。（图例接下页）cas13design：一个设计Cas13d指导RNA的灵活工具设计定制gRNA人转录本表达人类模式生物RNA病毒额外资源选择模型生物M.musulusGENCODE M24（mm10）显示10条目基因符号基因ID1成绩单ID成绩单类型长度5'UTRCDs3'UTR2MALAT1所所所所所所所84096MALAT1ENSMUSG00000092341.3ENSMUST00000173314.1lncRNA556显示1至2的4条目（从85，804总条目筛选）输入Ensembl成绩单ID：iCas13引导RNA沿着靶转录物的预测根据用于预测指导效率的平铺筛选分配Cas13指导RNA评分和四分位数。下载绘图3Cas13指导RNA预测请使用搜索字段搜索或按列排列指导RNA预测。4下载表显示10条目ID搜寻：指导序列匹配位置注释外显秩原始评分指南评分四分偏离目标-0mm：1 mm：2所所所所所所所所所所1crRNA5441：6011-60336033111.63718140：2crRNA5441：4207-4299AGCACAAGTACATTGGAGCACAT4229121.60745140：显示1至2个结果，共6，311项84095 Malat 1 ENSMUSG00000092341.3 ENSMUST00000172812.2lncRNA 6983ENSMUST000001728- -* ** *gRNA分数倍数变化Cell Genomics1，100001，2021年10月13日3资源会开放获取gRNA中的偏好和组合的同向重复序列加gRNA的预测折叠能（次级结构）。14使用该算法，在可能的情况下，我们预先计算了六种模型生物体的具有不同转录物长度的所有mRNA和ncRNA的gRNA功效（图1B）。对于每种生物体的评分gRNA，我们发现大约20%的gRNA在mRNA和ncRNA中均排在前四分位数（Q4gRNA）。值得注意的是，尽管核苷酸组成在来自不同物种的RNA之间可能不同，但我们在所有六个接下来，我们检查了在不同的转录物中平均存在多少预测的高效gRNA。为了做到这一点，我们确定了每个生物体中转录物的哪一部分包括n个得分最高（Q4）的gRNA，n值在1和25之间（图S1）。我们发现，在所有生物体中，每个转录物的编码序列含有更多数量的最高评分gRNA，而靶向非编码转录组和UTR（30个UTR和50个 UTR）更具挑战性（图S2）。这种得分最高的gRNA数量的减少在C中最为明显。这可能是因为它的非编码转录组含有许多短的ncRNA。平均而言，我们能够在mRNA中超过99%的编码外显子中找到至少25个Q4 gRNA，但仅在80%的ncRNA中找到。之前，我们证明了Q4 gRNA比Q1 gRNA更好地敲除蛋白质编码基因。为了验证ncRNA敲低的gRNA预测，我们靶向人和小鼠转 录 组 中 的 四 种 长 ncRNA （ lncRNA ） （ 人 ， MALAT 1 和HOTAIRM 1;小鼠，Gas 5和Pvt 1）。使用RNA测序，我们首先证实所选lncRNA在HAP 1（人）或NIH 3T3（小鼠）细胞中表达。对于每种lncRNA，我们克隆并慢病毒转导至少三种预测为Q4 gRNA的gRNA和至少三种预测为Q1 gRNA的gRNA。总共，每种lncRNA被6-8种不同的gRNA靶向。3天后，我们提取RNA并通过qPCR测量lncRNA敲低。我们发现，对于所有靶向的lncRNA，Q4 gRNA导致比Q1 gRNA更大的转录物敲低（图1C;图S3）。当靶向lncRNAHOTAIRM1时，我们的数据集中个体Q4gRNA实现的最高敲低为99%。对于4种靶向lncRNA中的3种，我们观察到Q1 gRNA没有统计学显著的敲低，进一步加强了gRNA预测对于有效转录物敲低的重要性。最近，几个小组提出使用CRISPR-Cas 13核酸酶直接靶向病毒RNA8、18用于病毒诊断和治疗，由于最近的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行，这已经成为快速技术发展的领域。然而，这些方法不使用优化的Cas13 gRNA。之前，我们表明靶向EGFP转基因的最佳gRNA可以导致与其他药物相比，敲除效力提高约10倍gRNA。因此，为了促进病毒遗传元件的功能研究，我们将我们的设计算法应用于使用Cas 13 d靶向SARS-CoV-2和其他致病性RNA病毒。为了确保从受影响个体中获得不同分离株的覆盖率，我们收集了来自58个国家/地区的7，630个已测序的SARS-CoV-2基因组，提交给全球共享所有流感数据倡议（GISAID）数据库（图2A）。20使用来自纽约市的第一个测序的SARS-CoV-2分离株（USA/NY 1-PV 08001/2020）作为参考，21我们评估了每个参考gRNA可以靶向多少个SARS-CoV-2基因组（图2B）。靶向蛋白质编码区的gRNA在所有基因组中大多是很保守的，在更可变的区域中具有较低的保守性，例如非结构蛋白 14（NSP14）和刺突（S）蛋白。我们发现，靶向50和30UTR中的gRNA倾向于保守性差，这可能是由于这些区域缺乏编码功能而预期的（图S4）。在对26个SARS-CoV-2基因中的每一个进行检查后，我们发现所有基因转录本都可以被转录。用Q4 gRNA得到。同样，我们设计并评分了MERS冠状病毒和其他两种RNA病毒的所有gRNA：HIV-1，它驱动获得性免疫缺陷综合征（AIDS）和H1N1大流行性流感。与SARS-CoV-2不同，其中单个高效（Q4）gRNA可以靶向所有分析的基因组，我们发现需要至少两种gRNA来靶向几乎所有可用的基因组。对于高度致突变的病毒HIV-1，22我们发现需要9种gRNA来靶向所有可用的基因组（图2C）。考虑到目前对使用Cas13酶靶向病毒RNA的巨大兴趣，这种优化的gRNA数据集将可用作广泛靶向来自受影响个体的不同分离株的病毒群体的平台所有为模式生物和病毒转录物设计的gRNA都可以在设计工具网站上交互式浏览或批量下载。最后，为了靶向来自非模型生物体的转录物、合成RNA和携带在参考基因组中未发现的遗传变体的转录物，我们开发了基于网络的交互式设计模式，其中用户可以输入定制RNA序列以用于gRNA的选择和评分。讨论RNA靶向CRISPR-Cas 13在转录组干扰和抗病毒治疗方面具有巨大潜力。在这项研究中，我们设计了Cas 13 d gRNA，并对六种常见模式生物中的mRNA和ncRNA进行了评分，并鉴定了优化的gRNA，以靶向SARS-CoV-2，HIV-1，H1N1流感和MERS的几乎所有测序病毒RNA。我们扩展了我们的基于网络的平台，使Cas13 gRNA设计易于用于模型生物，并创建了一个新的应用程序，使gRNA预测定制的靶RNA序列。这种独特的资源提供了优于现有的Cas13引导设计工具23、24的先进性，作为第一个使用靶上效率的工具(B) 预测指导6种模型生物体中mRNA和ncRNA的有效性四分位数满足靶RNA的最小长度要求（80 nt）的评分转录物的百分比在每个柱上方指示。(C) Q4和Q1 gRNA的平均lncRNA敲低（*p <0.05，**p <0.01，双尾Student参见图S3。4Cell Genomics1，100001，2021会开放获取资源AB01 - 101 3 5 79 1113 15S E M N3a6 7 b 10C10010 - 50五十到一百100 - 200200 - 400400 - 800100755025Q4-指南%：2 4 68 1012 14 165 10 15 2025在SARS-CoV-2基因组中的位置（kb）7a 8959085800 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Q4 gRNA500040003000200010000NSP蛋白SARS-CoV-2蛋白图2. 靶向常见人类致病性RNA病毒(A) 分析的SARS-CoV-2分离株的世界地图（数据来自GISAID，2020年4月17日）。图例中的数字表示分离株计数。(B) 每个SARS-CoV-2基因的gRNA设计上图：SARS-CoV-2基因注释。中心：每种NY 1参考gRNA靶向的SARS-CoV-2基因组百分比底部：每个基因Q4中gRNA的分数（pie）和靶向至少99%的总基因组的每个基因Q4 gRNA的总数（bar）。(C) 预测靶向所有分析的SARS-CoV-2、MERS-CoV、H1N1和HIV-1基因组的Q4 gRNA的最小数量（分别为n = 7，630、522、4，237和5，557个病毒基因组）。在gRNA预测中并关注Cas13直系同源物（例如，Cas13a）具有显著的非特异性切割（表S1）。为了促进用于功能性转录组学筛选的CRISPR-Cas 13文库的潜在高通量设计和开发，我们还使所有预评分的gRNA可用于批量下载。我们预计，这一资源将极大地促进CRISPR-Cas 13 RNA在模式生物中的靶向，这是对人类健康的新病毒威胁。STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统B人类和小鼠细胞培养d方法样本用于模式生物的BB gRNA脱靶预测B用Cas13d敲低lncRNABRNA病毒基因组收集靶向SARS-CoV-2的B gRNA设计B预测靶向RNA病毒的gRNA的最小数量d量化和统计分析d额外资源补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2021.100001。致谢我们感谢整个Sanjana实验室的支持和建议。感谢M。Zaran和S.Brock，以获得Web工具服务器的帮助N.E.S. 由纽约大学和纽约基因组中心启动基金、国家卫生研究院（NIH）/国家人类基因组研究所（DP 2 HG 010099）、NIH/国家 癌 症 研 究 所 （ R 01 CA 218668 ） 、 国 防 高 级 研 究 计 划 局 （ D18 AP00053）、癌症研究所和脑与行为基金会支持。作者贡献N.E.S. 和H。-H.W. 构思了这个项目。N.E.S. H.- H.W.，XG 上午-M.设计了这项研究。上午- M.和D. H。为所有模式生物体设计Cas13d gRNA。H.- H.W.对模式生物进行了分析。X.G.公司设计了Cas13d gRNA并进行了病毒分析。H.-H.W.还有J.A.R.构建网络工具并计算每个指南的脱靶计数，X.G.，上午-M.，和X.C.公司设计并测试了在人类和小鼠模型中的引导效率。XG H.- H.W.， 和D.H。 生产数字。N.E.S.监督工作。X.G.公司和N.E.S.在所有作者的投入下撰写了手稿。申报利益纽约基因组中心和纽约大学已经申请了与本文相关的专利。N.E.S. 是顶点和凯根的顾问SARS-CoV-2（n= 7，630）MERS（n=522）H1N1（n= 4 237）艾滋病毒（n= 5 557）匹配（%）靶向基因组（%）完美匹配的gRNACell Genomics1，100001，2021年10月13日5资源会开放获取投稿时间：2020 - 07修订日期：2021受理时间：2021发布时间：2021引用1. Abudayyeh，O.O.，Gootenberg，J.S.，Essletzbichler，P.，汉，S.，J.，J.，贝兰托，J.J. ，Verdine，V.，考克斯D.B.T. Kellner，M.J. ，Regev ， A. ， 等 （ 2017 ） 。 使 用 CRISPR-Cas 13 进 行 RNA 靶 向 。Nature550，280-284. https://doi.org/10.1038/nature24049网站。2. Smargon，A. A.，考克斯D.B.T. Pyzocha，N.K.，Zheng，K.，中国科学院 ， Slaymaker 即 时 通 讯 Gootenberg ， J.S. ， Abudayyeh ， O.A. ，Essletzbichler，P.，Shmakov，S.，Ma- karova，K.S.，等（2017）。Cas 13 b是一种VI-B型CRISPR相关的RNA引导的RNA酶，由辅助蛋白Csx 27 和 Csx 28 差 异 调 节 。 摩 尔 单 元 65 ， 618-630.e7 。https://doi.org/10.1016/j的网站。molcel.2016.12.023网站。3. 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