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工程12(2022)90研究抗菌剂耐药性-供试品中国产碳青霉烯酶肠杆菌科菌血症分离株的基因组和表型多样性:多中心流行病学、微生物学和遗传学研究郑北文a,#,徐浩a,#,郭丽华a,萧雨a,季锦茹a,应超群a,陈云波a,沈平a,韩慧明b,黄晨a,c,张顺天a,吕涛a,肖永红a,张伟浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗协同创新中心传染病诊疗国家重点实验室,浙江杭州310003b北华大学医学院,吉林132013c宁波市医学中心李惠利医院感染科,宁波315040阿提奇莱因福奥文章历史记录:2020年4月30日收到2020年9月7日修订2020年10月9日接受2020年12月25日在线发布保留字:产碳青霉烯酶肠杆菌科质粒介导中国超广谱β-内酰胺酶A B S T R A C T产碳青霉烯酶肠杆菌科(CPE)分离株被认为是对公共卫生最严重的威胁之一。然而,血流感染(BSI)中CPE分离株的群体结构和遗传特征在很大程度上是未知的。为了解决这一知识缺口,在本研究中,我们纳入了从中国(2014-2015年)26家临床医院招募的由肠球菌属分离株引起的具有临床意义的BSI患者CPE分离株的微生物学和基因组学特征,包括其敏感性谱,分子分型,系统发育特征和碳青霉烯酶编码基因的遗传背景在入组的2569株BSI肠球菌分离株中,42株(1.6%)为碳青霉烯酶阳性。此外,在2242株被调查的分离株中,1111株 ( 49.6% ) 被 鉴 定 为 产 超 广 谱 β-内 酰 胺 酶 ( ESBL ) 的 大 肠 埃 希 菌 ( E. coli) 、 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌(Klebsiella pneu moniae,K.肺炎杆菌)、奇异变形杆菌(奇异变形杆菌)和产酸克雷伯氏菌。全基因组测序分析表明,K.肺炎克雷伯氏菌产碳青霉烯酶(KPC)-2。pneumoniae序列型(ST)11和产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)-5的E. coli ST 167的表达。质粒分析显示,碳青霉烯酶编码基因位于多个质粒上在克雷伯氏菌中观察到高流行率的编码生物膜的3型菌毛簇和耶氏菌素相关基因。 肺炎分离株。本研究表明ESBLs在中国的高流行率和CPE在BSI分离株中的广泛传播,这代表了真正的临床威胁。此外,我们的研究结果首先说明了一个更全面的基因组方案的CPE分离株之间的BSIs。KPC- 2产生菌K. pneumoniae ST 11和产NDM-5的E.大肠杆菌ST167需要密切监测。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。1. 介绍碳青霉烯耐药性的出现和传播,尤其是在产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)细菌中,具有特殊的临床意义[1,2]。近年来,耐碳青霉烯类肠杆菌科(CRE)被世界卫生组织列为最重要的一类病原菌[3],表明其已成为抗生素时代的全球性威胁*通讯作者。电子邮件地址:xiaoyonghong@zju.edu.cn(Y. Xiao)。#这些作者对这份手稿做出了同样的[4]的文件。在这些微生物中,产碳青霉烯酶肠杆菌科(CPE)被认为是最令人担忧的威胁,因为针对这些病原体的治疗选择有限,而且它们具有移动性[5,6]。根据文献,伴随使用抗菌药物和质子泵抑制剂延长了CPE胃肠道定植的持续时间[7]。我们最近的研究还表明,抗生素暴露、手术史和CPE阳性是相关的[8]。血流感染(BSI)是全球感染性疾病的主要原因,并已成为发达国家的主要死亡原因之一[9,10]。在美国,每年约有9300例医疗相关感染由CPE引起。https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.10.0152095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engB. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9091几乎一半因CPE而患有BSI的住院患者死于感染[11]。因此,了解耐药元件如何在菌株之间传播以及病例之间未被检测到的传播程度尤为重要[11]。然而,只有少数大规模的耐药性监测项目针对BSI分离株的检测[12]。在中国,在过去十年中观察到CPE介导的感染发生率增加[13]。迄今为止,只有少数研究报告了CPE分离株的国家监测[13最近报告了中国BSI中产ESBL肠杆菌科的高患病率;然而,该研究中未描述CPE的检测[16]。在我们之前的研究中,我们也报道了中国肠杆菌科细菌引起的BSI的初步数据[17]。这些研究中的绝大多数是基于流行病学数据或Sanger测序数据;因此,这些研究无法进行比较基因组学分析,以跟踪此类菌株或抗菌素耐药基因(ARG)的传播和传播。到目前为止,在BSI中CPE分离物的群体结构和遗传特征仍然很大程度上未知。为了解决这一知识缺口,我们招募了由中国肠杆菌科分离株引起的具有临床意义的BSI患者。此外,对引起BSI的肠杆菌科分离株进行了全面的表型表征。我们进一步采用全基因组测序(WGS)和质粒分析方法,试图获得CPE在医院之间和医院内流行病学的快照。我们的研究结果有助于理解耐药性在中国物种和地理区域内部和之间传播的影响。2. 材料和方法2.1. 研究设计、设置和细菌分离株血液细菌耐药性研究协作系统联盟(BRICS)是一个前瞻性、多中心和观察性联盟,自2014年以来一直在跟踪中国导致BSI的分离株的抗菌药物耐药性[17]。由哨点医院负责的临床微生物学家确定被判定为具有临床意义的BSI患者。作为该计划的一部分,本研究从2014年1月至2015年12月期间位于21个城市的26家哨点医院收集了所有非重复BSI分离株(图1)。排除门诊患者或数据不完整的患者。所有分离株均送至浙江大学附属第一医院中心实验室进行检测分析。使用集中查询从CPE感染患者的浙江大学附属第一医院伦理委员会批准。通过面对面或电话获得所有患者的个人同意。2.2. 鉴定、抗菌药物敏感性试验和分子生物学使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)(Bruker Daltonics,德国)鉴定细菌物种。根据临床和实验室标 准协会( CLSI)标 准,使用 琼脂稀 释法进 行抗菌活 性试验(AST)[18]。使用欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)所述的微量肉汤稀释法测定粘菌素和替加环素的AST。的yhttp://www.eucast.org/。Fig. 1.研究流程图。MLST:多位点序列分型。产 ESBL 的 大 肠 杆 菌 ( E.coli ) 、 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 ( Klebsiellapneumoniae,K. pneumoniae)、奇异变形杆菌(P. mirabilis)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(K.根据CLSI的建议,使用双纸片稀释法进行表型分析。对碳青霉烯类抗生素不敏感的分离株进行碳青霉烯酶编码基因亚胺培南酶(blaIMP)、维罗纳整合素编码的金属β-内酰胺酶(blaVIM)、克雷伯氏菌(K.c.)肺炎杆菌碳青霉烯酶(blaKPC)、苯唑西林酶(blaOXA-48)和新德里金属β-内酰胺酶(blaNDM),如前所述[19]。2.3. WGS和基因组学分析为了表征CPE菌株的遗传特征,对所有CPE分离株进行WGS使用Gentra Puregene Yeast/Bact 提 取 总 DNA 。 试 剂 盒 ( Qiagen ,Germany),然后使用Illumina Hiseq 2500平台(Novogene Co.,中国)。使用Velvet 1.1将配对读数组装到许多支架中[20]。用多位点序列分型法(MLST)对E. coli,K. pneumoniae、阴沟肠杆菌(Enterobactercloylum,E. cloxacin)和K.如前所述的催产素分离物[4]。使用Rescue2.1数据库确定ARG[21]。所有CPE分离株的基因组比对用Progress-B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9092≥≥siveMauve[22]基于使用多个全基因组比对算法对每对输入基因组之间的共享基因含量的估计。使用开放阅读框(ORF)finder程序手动检查碳青霉烯酶编码基因和rmpA/rmpA 2基因侧翼区的推定编码序列。2.4. 质粒分析进行核酸酶消化、脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)和Southern印迹以估计携带blaNDM/blaKPC/blaIMP/rmpA/rmpA 2的质粒的大小[23]。使用质粒SPAdes组装靶质粒的序列[24]。为了鉴定靶向质粒,通过基本局部比对搜索工具(BLAST)对每个scaf倍进行针对GenBank核苷酸(NT)数据库的相似性搜索基于MUMmer比对,当> 70%的支架长度与质粒序列匹配并且30%与可动元件或染色体序列匹配时,定义质粒序列[25]。使用质粒数据库(PLSDB)(一种完整的细菌质粒资源)手动检查每个支架的最佳BLAST命中[26]。每个质粒的估计长度计算为与特定参考质粒相关的所有支架的长度之和具有99%同一性且一个分离物的支架的总体覆盖率为70%的参考质粒使用质粒pET1.3鉴定质粒的不相容性类型[27]。使用BLAST将代表性质粒的序列与从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得的其他质粒序列进行比较,并使用BLAST环形图像生成器(BRIG)作图。2.5. 系统发育分析。雷伯菌分离株为了进一步研究K.产肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)-2的K.在肺炎链球菌分离株中,我们创建了基于核心单核苷酸多态性(SNP)的系统发生树,并通过将Illumina读数映射到参考基因组(K. pneumoniae菌株HS 11268,CP 003200)。核心基因的定义如前所述[28]。在去除重组位点后,使用广义时间可逆(GTR)进化模型,使用RAxML版本8.2.10进行基于最大似然的系统发育重建[29]。使用交互式生命树yy产生系统发生树可视化。2.6. 对克雷伯氏菌已知的毒力基因和荚膜基因进行了研究。雷伯菌分离株鉴定27株K. 肺炎克雷伯氏菌分离株,我们进一步筛选所有短读集的毒 力基 因和 wzi 基 因等 位基 因序 列的 已知 等位 基 因, 使用 K.pneumoniae细菌分离株基因组序列数据库(BIGSdb)。3. 结果3.1. BSI分离株中ESBLs的高流行率在为期两年的研究期间,21个城市的26家医院共报告了4801例独特的菌血症不重复yhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/。http://brig.sourceforge.net/.yyhttps://itol.embl.de/。http://bigsdb.web.pasteur.fr.前瞻性收集到肠球菌2569 株,占革兰阴性菌血症病例的53.5%(2569/4801)。在肠杆菌科分离株中,E. 大肠杆菌(n = 1617)为优势种,其次为克雷伯氏菌(K.肺炎570例。2242株临床分离菌中,1111 株 ( 49.6% ) 为 产 ESBL 菌 株 。 产 ESBL 的 E.coli , K.pneumoniae,克雷伯氏菌K. 产酸菌、产氧菌和奇异变形杆菌的阳性率分别为57.0%(922/1617)、30.0%(171/570)、33.3%(8/24)和 35.7% ( 10/28 )。 虽然大 多数菌株 对甲氧苄 啶 / 磺胺甲 恶唑(50.3%)、多粘菌素B(98.0%)、美罗培南(96.8%)和亚胺培南(95.9%)敏感,但对阿莫西林(88.6%)、头孢唑啉(60.6%)和头孢呋辛(53.7%)也观察到高度耐药。3.2. CPE分离株的鉴定和分布共鉴定出66株美罗培南非敏感分离株和73株亚胺培南非敏感分离株,包括42株经聚合酶链反应(PCR)和测序确认的碳青霉烯酶阳性分离株其中27株为克雷伯氏菌。pneumoniae,其次为E. 大肠杆菌(n = 5)、粘质沙雷氏菌(S. marces-cens)(n = 3),E. 克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis(K. michiganensis)(n = 1)、变孢克雷伯氏菌(Klebsiella varicola(K. variicola)(n = 1)、克螟(K.oxytoca(n = 1)和Raoultella planticola(R. planticola)(n = 1)。所有CPE分离株均对碳青霉烯类抗生素不敏感,并对多种抗菌药物耐药。在这些分离株中,观察到对头孢噻肟和哌拉西林-他唑巴坦的完全耐药因此,对CPE分离株最有效的抗菌药物是替加环素、多粘菌素B和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。 所有分离株对替加环素敏感,只有1株S.marcescens分离物对多粘菌素B耐药。Sanger测序进一步揭示blaKPC-2是最多在31株(91.3%)分离株中发现了流行变异,其次是bla-NDM-5(n=5)、blaNDM-1(n= 4)、blaIMP-4(n= 1)和blaIMP-8(n= 1)。有趣的是,碳青霉烯酶基因存在于27(4.7%)的570 K。pneumoniae分离株和1617株E.大肠杆菌菌株。此外,这些CPE分离物收集自12个城市的14家医院,CPE比例最高的是皖南医学院第一附属医院感染率为17.4%。3.3. CPE阳性患者所有CPE感染患者均住院治疗。42例患者的平均年龄为61.1岁,范围为1-90岁,66.7%(28/42)为男性。21例(50.0%)患者入住重 症 监 护 室 ( ICU ) ( 包 括 急 诊 ICU ( EICU ) 和 新 生 儿 ICU(NICU))。结果,42例患者中有15值得注意的是,6例患者中有5例(83.3%)感染了产rmpA/rmpA 2的K.肺炎分离株死亡,表明感染这种高致病性病原体的高风险。3.4. K. pneumoniaeST 11和 E. 大肠杆菌ST167分离株42个CPE分离株的所有基因组组装体均保存在GenBank中,并以BioProject登录号PRJNA 393804注册。WGS数据的结果总结在表1中。 通过每个物种和序列类型(ST)内的比较基因组分析,我们鉴定了8个CPE进化枝(图11)。 2)、符合物种鉴定。值得注意的是,产KPC-2的K.肺炎链球菌ST 11和产新德里金属β-内酰胺酶(NDM)的E.大肠杆菌ST167分离株分 别 在10家 和4家 哨点医院检出 。B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9093表1基于组装数据的CPE组装统计和基因组覆盖率的概述分离株ID重叠群N50(bp)组装碱基(bp)×覆盖范围登录号EN328756153 3554 797 988385NPGJ0000000EN3600139132 3345 391 491234NPGK0000000E98790138 0525 170 714300NPGF0000000E4219158113 3105 139 090292NPHP0000000E834138100 0085 095 123257NPHS0000000E2619182119 1825 158 320222NPHR0000000E2239146136 9715 024 459314NPHO0000000E4903107136 9724 982 100285NPHQ0000000K143984314 5746 135 809141NPHU0000000K3678103215 5136 273 403217NPHT0000000K3657105170 4015 663 831283NPHN0000000K2147115203 9395 659 063268NPHH0000000K60465340 6935 669 428242NPHL0000000K4803108164 6005 829 038228NPHG0000000K31599192 3135 643 629189NPHF0000000K501286160 0755 478 142288NPHE0000000K143390203 9395 505 326262NPHI0000000K389396185 9145 628 838274NPHA0000000K387198185 9145 632 206293NPHB0000000K501495157 7925 483 445274NPHD0000000K3862104203 9385 553 192362NPHC0000000K8595176 1665 810 616217NPHM0000000K66696144 2775 451 010262NPHK 0000000K66996160 0725 447 971189NPHJ0000000K390298171 0145 618 419362NPGZ0000000K2646100192 3135 545 597271NPGX0000000K95079203 6955 675 827307NPGM0000000K1177107192 3135 733 347359NPGU0000000公司简介104203 8965 585 536139NPGS0000000K319494192 3135 636 447184NPGW0000000K428099192 3135 726 611270NPGV0000000K270189203 8965 581 788219NPGR0000000K506563291 8435 822 605273NPGT0000000K4311115222 9255 529 081263NPGP0000000K430783203 9395 525 783246NPGQ0000000K432493203 9395 530 708192NPGN0000000K431484203 9395 524 464242NPGO0000000K2631208241 2386 293 921187NPGY0000000R346763357 9796 138 099229NPGL0000000SE76855227 8235 499 067334NPGI0000000SE360557288 8635 412 855298NPGH0000000SE414573202 4605 427 821242NPGG0000000bp:碱基对。这些数据表明,KPC-2产生的K。 pneumoniae ST 11和产NDM-5的E. coli ST 167中的表达。3.5. ARG的特性使用WGS数据,我们鉴定了与广泛的抗微生物剂相关的广泛的ARG:氨基糖苷类、b-内酰胺类、磷霉素、碳青霉烯类、喹诺酮类、磺胺类、甲氧苄啶类和苯尼考(图1)。 2)的情况。此外,42株携带碳青霉烯酶的分离株中有33株(78.6%)头孢噻肟水解β-内酰胺酶(CTX-M)-65为最常见的ESBLs(47.6%,20/42),其次为CTX-M-14(23.8%,10/42)。7个分离株产生2个blaCTX-M等位基因。正如预期的那样,在30株克雷伯菌分离株中发现了至少一种巯基试剂可变(SHV)酶变体。在这些分离株中,22株携带blaSHV-11,11株携带blaSHV-178。3.6. 碳青霉烯酶编码基因S1-PFGE、Southern杂交和复制子分型分析显示,所有碳青霉烯酶编码基因均为质粒介导的(表2和图2)。附录A中的S1)。携带blaKPC-2的质粒(n= 31)在遗传上是不同的,可分为以下几类:大小约为79至约260 kb的内切酶(kb)、约55 kb的IncR质粒和约38 kb的IncP-6质粒(图S1)。虽然blaKPC主要与具有三种主要结构的Tn 3转座子相关,但发现它们具有相似的保守结构,IS Kpn 27-blaKPC-2-ISKpn 6-korC-hp- klcA,这意味着该移动元件在bla KPC-2基因在中国的传播中起关键作用(图13)。 3(a))。此外,blaIMP-4和blaIMP-8分别位于~55 kb IncN和~73 kb不可分型质粒上(表2和图S1(e))。计算机模拟分析表明,blaIMP-4由pEN987-亚胺培南酶(IMP)上blaIMP-4 -ltrA-qacED 1-sul 1盒阵列中的I类整合子携带,其显示与来自K. pneumoniae(MF344565)(图3(b))。相比之下,blaIMP-8被I类整合子窝藏,的pEN 3600-IMP 上 的 blaIMP-8-aac(60)-Ib-blaOXA-1-catB3-β-3-qacEdelta1-sul1盒阵列。有趣的是,该结构与blaKPC-2质粒p112298-KPC的序列具有高度相似性,尽管该质粒中不存在bla IMP-8(图11)。 3(c))。含有blaNDM的质粒来源于E. coli(n = 5)和E. 克雷伯氏菌(n =1)均属于IncX 3,大小约为46 kb;然而,两个克雷伯氏菌分离株携带由大小约为55 kb的IncFI质粒编码的bla NDM基因和大小约为220kb的不可分型质粒(表2和图3)。 S1(d))。虽然在所有携带blaNDM的细胞中观察到由dsbC-trpF-bleMBL-blaNDM组成的片段,B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9094图二、通过WGS鉴定的42个CPE分离株和ARG的基因组序列比对该图是使用progressiveMauve基于使用多个全基因组比对算法对每对输入基因组之间的共享基因含量的估计而生成的ARG显示在右侧(蓝色形状表示表2从BSI中鉴定的42种碳青霉烯酶编码质粒的特征复制子类型质粒数量近似大小(kb)物种碳青霉烯酶基因携带质粒的STaIncN155E. 阴沟blaIMP-4St97非分型173E. 阴沟blaIMP-8ST25IncPII1260K. 肺炎blaKPC-2ST11IncPII6170K. 肺炎blaKPC-2ST11IncPII1170K.变栖blaKPC-2NDIncPII8146K. 肺炎blaKPC-2ST11IncPII1125K. 肺炎blaKPC-2ST11IncPII5106K. 肺炎blaKPC-2ST11/ST268IncPII1106R. 解鸟苷的blaKPC-2NDIncPII2106S. 粘质blaKPC-2NDIncPII295K. 肺炎blaKPC-2ST11/ST23IncPII279K. 肺炎blaKPC-2ST11/ST15IncR155S. 粘质blaKPC-2NDIncP-6138K. 肺炎blaKPC-2ST11IncX3146E. 阴沟blaNDM-1ST600IncFI155K. michiganensisblaNDM-1ND非分型1220K. oxytocablaNDM-1NDIncFI155K. 肺炎blaNDM-1St23IncX3546E. 杆菌blaNDM-5ST 167/新STND:未测定; kb:内切酶。a确定K的ST。 pneumoniae、E. coli和E. Clobacillus complex isolates.质粒中,8个质粒表现出三种不同类型的blaNDM-1基因背景(图1A和1B)。3(d)和(e))。在三种质粒(pK 950-NDM、pK 3287-NDM和E4219-NDM)和pK 3287-NDM中鉴定出不存在插入序列Aba125(ISAba 125除blaNDM区外,与其它质粒的相似性较低。3.7. K. 肺炎链球菌ST11分离株系统发育分析。pneumoniae分离株进一步研究,肺炎是42株碳青霉烯酶阳性分离株中鉴定的最常见微生物。在27个克氏原住民群体中共发现21711 个核心基因组SNP 位点。B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9095图三. 42株CPE分离株中碳青霉烯酶编码基因的遗传环境。(a)31个blaKCP-2携带质粒的共线性基因组比对。(b)分离株EN 987中blaIMP-4基因的遗传环境(c)分离株EN 3600中blaIMP-8基因的遗传环境(d)携带blaNDM-1的质粒的基因组图谱(e)五种携带blaNDM-5的质粒的比较基因组学。Easyfig程序应用于比较基因组学。彩色箭头表示ORF,阴影区域反映序列相似性。箭头表示基因的转录方向,不同的基因用不同的颜色表示ARG以红色表示碳青霉烯酶编码基因核心区大小不同的分离株用竖线和数字表示IS:插入序列。B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9096pneumoniae基因组(图4(a))。然后,这些基因组被划分为四个不同的系统发育分支的基础上,使用RAxML的核心基因的最大似然树分析。此外,SNP分析确定了两名患者共享的三对密切相关的分离株(K4314 K4324、K666 K559和K3871 K3902),这表明这些分离株可能在医院传播。肛门-荚膜多糖(cps)位点的分析表明,27 K. pneumoniae分离物含有六个不同的wzi等位基因(图4(b))。根据Klebsiella PasteurMLST数据库,这些wzi等位基因对应于不同的K类型:KL47(n = 16)、KL64(n = 6)、K1(n = 2)、K20(n = 1)、K19(n = 1)和KL13(n = 1)。有趣的是,在ST 11分离株(n= 23)中检测到5种K型,图四、 27株产KPC-2的K. 肺炎分离株。(a)将27个BSI分离株的21 711个核心基因组SNP与K. pneumoniae菌株HS 11268(CP 003200)。将分离株以最大1000个SNP的阈值分组到最近的组成员,并显示了四个所得组含有不同ST的分离株的来源以饼图表示,不同来源以不同颜色显示(b)27株产KPC-2的K.肺炎分离株。含有不同荚膜类型的分离物的来源用圆圈表示,不同的来源用不同的颜色表示B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9097分析了K. pneumoniae ST 11克隆的SNP距离也表明中值成对SNP距离为15(范围:0 -42)(图4(b))。这些数据表明ST 11谱系之间的遗传多样性3.8. 毒力因子在K.雷伯菌分离株共检测到76个已知毒力因子。肺炎克雷伯氏菌分离株(Fig.5)。在这些分离株中观察到高流行率的生物膜编码mrk基因簇和ybt基因 全部27K。肺炎克雷伯氏菌26株携带mrk基因,26株携带ybt基因。此外,产气杆菌素、尿囊素、大肠杆菌素、铁摄取操纵子、微菌素、KP1_1364和KP1_1371以及salmochelin相关基因分别在7个、2个、3个、2个、2个和2个分离株中检测到。令人惊讶的是,分离株K950具有最多的毒力基因,编码74个毒力因子,除了ybbW和mceJ基因。3.9. 携带rmpA/ rmpA 2的质粒的质粒分析我们还分别在3株和6株分离株中鉴定了图五、毒 力相关基因在K. pneumoniae菌株通过将每个分离株的基因组草图序列与BIGSdb-Kp数据库比对来生成热图特定基因组中存在毒力基因的情况用蓝色框表示,不存在毒力基因的情况用奶油色框表示。毒力因子显示在左侧。iucABCD:需氧菌蛋白相关基因;iutA:铁需氧菌蛋白受体基因;allABCDRS/arcC/fdrA/gcl/ylbEF/ybbWY/hyi/glxKR:尿囊素酶相关基因;kfuABC:铁摄取操纵子相关基因;clbABCDEFGHILMNOPQR:大肠杆菌相关基因;mceABCDEGHIJ:微生物素相关基因;mrkABCDFHIJ:3型菌毛相关基因;rmpA/rmpA 2:cps转录激活因子基因;iroBCDN:螯铁蛋白相关基因;ybtAEPQSTUX/fyuA/irp 1/irp 2:耶尔森氏菌相关基因。B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9098≥(附 录A 图S2 )。 S1-PFGE和 Southern杂交 显示 rmpA由 ~200 kbIncHIB和~260 kb IncHIB质粒携带(图S2(a))。与rmpA相比,携带rmpA2的质粒在结构上更趋不同,因为rmpA2基因位于大小为约370,约260,~218、~200和~150 kb(图S2(b))。值得注意的是,rmpA和rmpA2共存于来自分离株K950、K3175和K4803的质粒上(图1)。S2和表3)。比较序列分析表明,K950和K3175共享rmpA基因的保守遗传背景,与K4803不同(图S2(c))。进一步的分析在K950和K3175中鉴定了染色体编码的salmochelin相关基因iroBCDN,但在K4803中不存在(图11)。 5)。计算机模拟分析也发现了rmpA2基因的类似核心结构(图11)。 S2(d))。这些数据表明,携带rmpA2的质粒在遗传上是不同的,尽管这些质粒在rmpA2周围具有相似的结构,表明这种结构在rmpA2基因的传递中起着关键作用4. 讨论在过去的十年中,中国见证了CRE在一些地区的出现和快速增长[13,15]。鉴于CRE感染的负担日益加重,迫切需要更新我们对中国CRE分离株基因组特征的了解,这对于监测碳青霉烯类耐药性以及制定控制和管理CRE感染的相关政策至关重要。此外,CRE引起的菌血症通常与治疗失败率增加、死亡率高和住院费用高相关,并逐渐成为一个真正的临床挑战[30,31]。之前在中国对CPE引起的BSI的研究主要基于回顾性研究[14]和使用小样本量的病例系列[32,33]的病理学结果。到目前为止,从菌血症个体分离的CPE的基因组特征在很大程度上是未知的。在此,我们首次对中国多中心BSI监测中的CPE分离株进行了高分辨率基因组分析。本报告记录了CPE在中国的BSI中广泛存在本研究结果与以往研究结果相结合表明,碳青霉烯酶产生菌已在中国各地传播。正如我们收集的样本中所观察到的,BSI分离株中CPE的传播引起了对革兰氏阴性脓毒症患者治疗的担忧,并表明需要降低选择性压力并控制耐药微生物的传播[34]。在这项工作中,发现blaKPC-2和blaNDM-5是负责介导CPE中碳青霉烯类耐药表型的主要碳青霉烯酶基因。在中国,大部分CRE感染是由K.pneumoniae ST 11携带blaKPC-2汽车-青霉烯酶,其与国际流行性克隆ST258 密 切 相 关 [35] 。 以 前 的 全 国 CRE 调 查 确 定 了 KPC-2 生 产 K 。pneumoniae菌株是主要的CRE分离株[13],这与我们在CPE分离株中鉴定的80%- KPC-2产生率一致。blaKPC-2的快速传播主要是由于K.pneumoniaeST11菌株。先前的研究已经描述了ST 11-KL 47和ST 11-KL 64在中国的高患病率和死亡率[36,37]。结果表明,ST 11分为5个分支,其中ST 11-KL 47为优势亚克隆。我们还注意到rmpA和rmpA 2在ST 11-KL 64分离株上共存,这与最近的观察结果一致[8,37]。相反,以前的一项全国性调查显示,由于E.携带碳青霉烯酶的大肠杆菌与全球分布的ST 131谱系相关,占该研究分离株的33.0%,因此在中国最占优势[13]。然而,近年来,越来越多的报道检测到产NDM-5的E。大肠杆菌ST167谱系在中国临床感染中的应用[13,38,39]。ST 167是E.大肠杆菌在我们的收藏是符合这一趋势。除了E. coli ST 167的报道,欧洲国家的一些报道暗示了一种携带E. coliST167 [40-43],具有流行潜力。采取适当措施,有效控制KPC-2产生菌的蔓延。 肺炎链球菌ST 11和NDM-5产生菌E. 大肠杆菌ST167,以防止在中国进一步蔓延,严重的公共卫生后果。在肠杆菌科中检测到的大多数blaKPC-2/blaNDM/blaIMP基因位于可传播质粒上[13]。与这些数据一致,本研究中回收的含碳青霉烯酶质粒的表征表明,临床CPE菌株中的所有碳青霉烯酶编码基因均为质粒介导的。本文在4种细菌和33种不同的ST中发现了KPC基因,它们由11种质粒复制子携带,表明质粒的传播和质粒间的迁移在KPC酶在中国的传播中起重要作用。即使在ST 11中,我们也发现了至少8种不同的KPC质粒复制子类型,表明该克隆作为KPC质粒的宿主是成功的。与blaKPC相反,blaNDM基因(blaNDM-1和blaNDM-5)经常被报道为在多种肠细菌物种中位于IncX3质粒上,这意味着IncX3质粒可以为来自人类的细菌菌株和物种间的blaNDM传播提供有效的载体[13,44]。我们的观察进一步说明了IncX质粒在碳青霉烯耐药传播中的临床意义。特别是,大多数K。 肺炎分离株被发现是显着的,嗜铁耶尔森氏杆菌是最常见的克雷伯氏菌。pneumoniae高毒力决定簇,并与引起侵袭性人类感染的肠杆菌科菌株的毒力密切相关[45,46]。此外,有充分证据表明,与非侵入性或携带分离株相比,rmpA和rmpA2基因与侵入性人类感染显著相关[28]。因此,这些基因在K. BSIs中的肺炎链球菌ST11 KPC生产者是令人担忧的,因为它们同时具有多药耐药性、高度传播性和高毒力[47]。此外,在本工作中,在同一分离物中检测到毒力因子基因的组合,如需氧菌素、尿囊素、考伊巴菌素、铁摄取操纵子、微菌素、沙门氏菌螯铁蛋白、rmpA2和耶尔森氏杆菌素。这一发现可以解释与K.在这项研究中,肺炎感染,并表明,这些菌株,表3rmpA/rmpA2编码质粒的概述质粒地位公司类型rmpA/rmpA 2基因型质粒大小(kb)pK85-rmpA2重叠群IncHI1BrmpA2~218pK604-rmpA2重叠群IncHI1BrmpA2约370pK950-rmpA重叠群IncHI1BrmpA/rmpA2约260pK3175-rmpA重叠群IncHI1BrmpA/rmpA2约200人pK4803-rmpA重叠群IncHI1BrmpA/rmpA2约200人pK5065-rmpA2重叠群IncHI1BrmpA2约150B. 郑惠南许湖,加-地Guo等人工程12(2022)9099可能在BSI中具有潜在的高毒性,但需要进一步的实验研究进行确认。这项研究有几个局限性。首先,尽管本研究纳入了中国广泛地理分布的医院,但仅获得和研究了有限数量的CPE菌株。因此,这些数据可能不能真正代表整个中国CPE的患病率和特征。其次,我们对携带碳青霉烯酶的质粒的发现应谨慎解释;因此,需要进一步研究以增加对这项工作发现的信心,因为收集中仅包括引起BSI的分离株5. 结论总之,我们的研究报告了广泛传播的ESBL和CPE分离菌血症在中国的个人重要的是,这项工作表明,K。pneumoniae ST11和E. 大肠杆菌ST 167的感染已成为严重的临床问题。该研究还揭示了中国侵袭性CPE感染的基因组图谱,这突出了国家一级监测BSIs的重要性。质粒分析表明,质粒在碳青霉烯酶基因传播过程中起重要作用。在中国,应持续密切监测BSI中CPE的患病率此外,对流行性克隆K.还特别需要具有潜在高毒力的肺炎链球菌ST 11来了解blaKPC-2基因和毒力基因的传播,以便可以开发用于CPE感染的国家控制的有效策略。致谢我们衷心感谢国家重点研发计划(2017 YFC 1200203和2016 YFD0501105)、国家重大科学研究计划(2018 ZX 10733402 -004和2018ZX 10712001 -005 ) 、 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 8174109
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