于二零一九年一月十六日（二零一九年）100210结核分枝杆菌蛋白激酶a药物的分子对接、分子动力学和MM/PBSA研究;药物再利用Shobana SundarRuman，Lokesh Thangamani，Gowdham Manivel，PraveenKumar，Shanmughavel Piramanayagam印度泰米尔纳德邦哥印拜陀Bharathiar大学生物信息学系A R T I C L E I N F O保留字：结核分枝杆菌PknA分子对接与动力学药物的再利用自由能计算A B S T R A C T结核病（TB）是一种致命的疾病，需要新的治疗策略来对抗它。重新利用现有的食品和药物管理局（FDA）批准的抗结核分枝杆菌（Mtb）蛋白的药物可能有利于结核病的治疗。蛋白激酶A（PknA）是Mtb的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPK）之一，并且是必需的药物靶标，因为它磷酸化许多对结核杆菌存活重要的蛋白质。在本研究中，通过分子对接方法，我们筛选了3176种FDA批准的药物对PknA的结合效率。有趣的是，发现具有改善的对接评分的最高化合物是基于维生素B2的化合物（ZINC 3831425和ZINC 1769096），其可以潜在地结合和抑制PknA。进行分子动力学（MD）研究，以评估对接复合物的稳定性。通过使用MM/PBSA方法评估与PknA对接的化合物的结合自由能。营养补充剂已被证明对治疗结核病有益。因此，我们假设基于Ribo B2或维生素B2的化合物可以抑制Mtb的PknA，并且可以用作治疗TB的辅助剂。1. 介绍世界卫生组织（WHO）最新的结核病（TB）报告（2017年据估计，2016年有近1330万人死亡，约1040万人感染结核病。耐药性结核病是全世界的一个主要公共威胁。于二零一六年，近60万人对最有效的一线抗结核药物利福平产生耐药性。目前需要新的有效药物现有药物的再利用是最近的趋势，可用于治疗耐药结核病[1，2]。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）主要通过蛋白质的磷酸化、乙酰化和泛素化等翻译后修饰来响应氧化应激。细菌中的蛋白质磷酸化主要由双组分信号级联控制，蛋白激酶A（PknA）是一种跨膜蛋白，它具有一个胞浆内激酶结构域，该结构域通过一个juxtamembrane与胞浆外结构域相连。包含大约250个氨基酸的催化区在分枝杆菌STPK中是很保守的。PknA在分枝杆菌的细胞形状的机制和调节中具有重要作用。在分枝杆菌指数生长和感染期间上调[5]。PknA已自主活化，并且对于分枝杆菌的体外生长和存活是必需的[6]。PknA磷酸化许多参与分枝菌酸合成、细胞分裂和肽聚糖合成的蛋白质[7]。PknA晶体结构的可用性导致成功检测针对它的潜在抑制剂[8-10 ]。PknA的晶体结构具有两个瓣：N-瓣（由卷曲的β-片层组成，长α-螺旋X）和C-叶（仅α-螺旋）。PknA的作用机制激活 是通过磷酸化 的苏氨酸 残基细菌 蛋白 激酶。 MTB有approXiphone411丝氨酸/（Thr172、Thr174和Thr180）的激活环，苏氨酸蛋白激酶（STPK），它们被编码为PknA、PknB、PknD、PknE、PknF、PknG、PknH、PknI、PknJ、PknK和PknL [3]。PknD是第一个在M. 结核病[4]。通过保守的Asp-Phe-Gly（DFG）和Ala-Pro-Glu（APE）基序。这些苏氨酸残基的突变控制PknA的激酶活化[8]。尽管它具有治疗作用，但只有少数研究报告*通讯作者。电子邮件地址：sundar. gmail.com（S. Sundar）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2019.100210接收日期：2019年5月16日;接收日期：2019年7月10日;接受日期：2019年7月18日2019年7月2日的一份声明2352-9148/©2019由ElsevierLtd.这是一个不可避免的问题，因为CCBY-NC-NDLicense（http：//creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学杂志主页：www.elsevier.com/locate/imu于二零一九年一月十六日（二零一九年）100210S. Sundar等人2Mtb的PknA抑制剂[11，12]。在这项研究中，食品和药物管理局（FDA）批准的药物通过计算机方法筛选PknA，以找到更有效的抑制剂。2. 方法2.1. 蛋白质和配体结构从蛋白质数据库[ 13 ]中检索N-末端PknA（PDB ID：40 W8）的原子坐标，并用于进一步研究。它具有283个氨基酸，并且在PDB结构中缺失残基1-2和84-88。从ZINC数据库中检索了3176种FDA批准的mol2格式的化合物[14]，并对PknA进行了初步筛选。2.2. PknA的制备和受体网格生成使用CASTp 3.0服务器[15]和默认参数识别PknA的结合位点口袋利用Maestro9.3 Schro-dinger软件的蛋白质制备向导对蛋白质结构进行了预解析.在开始蛋白质制备过程之前，观察所有的水分子、杂原子和辅因子，并从蛋白质晶体结构中去除。蛋白质制备包括分配键级，为所有原子添加氢，为金属创建零键级，从杂基团中删除5个以上的水原子，氢键 优 化 和 使 用 OPLS_2005 力 场 的 能 量 最 小 化 。 通 过 使 用 来 自Schrodinger软件套件的Glide模块的受体网格生成面板在蛋白质的质心上生成网格框。在受体网格生成面板中，网格框大小设置为25 mm半径，用于对接的网格点之间的默认距离为2 mm。2.3. 配体制备通过使用具有默认参数的Ligprep模块制备检索的配体结构。在对接研究之前，使用OPLS_2005力场将生成的配体构象降至最低。通过使用的OPLS_2005力场分配蛋白质和配体结构部分电荷。2.4. 分子对接使用来自Schrodinger软件套件的Glide Module进行分子对接计算所有制备的配体结构都使用Glide模块中基于网格的配体对接以默认设置对接到PknA对每种化合物进行单次对接运行。使用具有最高负值的Glide对接评分（G评分）从对接结果中确定最佳对接结构。在Chimera[16]中可视化了最佳蛋白质-配体对接复合物，并使用Berrys DiscoveryStudio Visualizer [17]访问和可视化了其相互作用。2.5. 分子动力学模拟研究使用GROMACS软件包5.1 [ 18 ]进行对接复合物的分子动力学模拟，以了解对接复合物的结构行为。使用GROMOS 43a1力场进行模拟。使用单点电荷（SPC）水模型将系统溶剂化在立方盒中，盒到蛋白质表面的距离为2nm。进一步加入相应的离子以中和体系。使用最速下降算法进行对接复合物的能量最小化。对于每个模拟，使用50，000步用于能量最小化。使用LINCS算法[19]约束键长，并使用PME方法[20使用NVT和NPT每个100ps的合奏。使用V-重新标度恒温器进行平衡，参考温度为300K。最后，以2fs的时间步长进行50ns的生产MD运行，每10ps保存对接复合物的坐标并用于进一步分析。使用GROMACS内置工具计算蛋白质RMSD和RMSF。Xmgrace用于绘制图表。2.6. 结合自由能计算g_mmpbsa是一种GROMACS工具，它意味着MM/PBSA方法可以计算无配体结合能[21]。计算了前三个对接复合物的结合自由能。从MD模拟运行的最后10 ns（41 ns-50 ns）每10 ps保存的坐标用于计算与PknA复合的配体的结合自由能。蛋白质-配体复合物在水性溶剂中的结合自由能（ΔGbind）由以下等式给出。ΔG结合= G复合物- （G蛋白+ G配体）其中G复合物是蛋白质-配体复合物的能量，而G蛋白质和G配体分别是蛋白质和配体在水性溶剂中的能量上述每一种的自由能计算如下，Gx= E键+（Evdw+E）+G极性+γSASA+ b其中GX（可以是G复合物，G蛋白或G配体），Ebonded表示键合相互作用贡献的能量，并且总是等于零[22]，而Evdw是范德华能量，Evdw是静电能。G极性是静电溶剂化自由能，G非极性是非极性溶剂化自由能。SASA是溶剂可及表面积，而γ是表面张力系数，b是拟合参数。g_mmpbsa工具计算水溶剂中蛋白质和配体能量的各个参数;因此，它计算与蛋白质相关的配体结合的自由能这项工作所遵循的整个方法如图1所示。3. 结果和讨论3.1. 分子对接研究PknA被证明是分枝杆菌生存和感染所必需的。已证明PknA可磷酸化脂质生物合成途径中的许多蛋白质，证明其是开发针对PknA的强效抑制剂的关键药物靶标。Magnet et al.（2010）开发了四种分子（VI-16319、VI-16444、VI-16317和VI-15739），其可在100μM下显著抑制PknA，但未发现任何一种分子Fig. 1.这项工作所遵循的方法。于二零一九年一月十六日（二零一九年）100210S. Sundar等人3表1来自Magnet等人的四种化合物的Glide对接评分和微笑符号2010年和从本研究中选择的化合物化合物GScore（kcal/mol）SMILES Notation Magnet等人发现的化合物，2010图2. PknA的结合位点和化合物与PknA的相互作用。PknA以卡通表示示出，并且结合口袋以粉红色球体示出，活化环以绿色示出，而重要的苏氨酸残基：T172、T174和T180被标记为黑色。a在高达200 μM的浓度下抑制细菌生长。使用分子对接方法，我们已经确定了这四种分子的对接得分和潜在的结合位点残基，并在表1中给出。所有四种化合物都结合在激活环由以下残基组成：I19、A20、T21、G22、G23、M24、G25、V27、A40、K42、F48、A62、T65、I73、A74、S75、V76、L93、M95 、 G96 、 L97 、 V98 、 G100 、 P102 、 N104 、 R140 、 D141 、V142、K143、G145、N146、L148、I157、T158、D159、F160、I162、A163、K164，V166，D167，A168，A169，P170，V171，M176，V177，M178，G179，T180，Y183，I184，Q188，G191，VI-15739-8.29CN（C）c1c（cccc1NC（=O）CCN1CCCCC1）c1c（c（nc（c1）c1c（cccc1）O）N）C#NVI-16317-7.99N#Cc2c（N）nc（c1ccccc1O）cc2c4cccc（NC（=O）CCN3CCCCC3）c4N5CCCC5VI-16444-6.79Cc1nc（sc1c1nc（ncc1）Nc1cc（ccc1）N（N）O）NC（=O）CCNVI-16319-3.46N#Cc2c（N）nc（c1ccccc1O）cc2c4cccc（NC（=O）CCN3CCCCC3）c4本研究ZINC3831425-12.66Cc1cc2nc3c（=O）（nH）c（=O）nc-3n（C（C@ H）（O）（C @ H）（O）COP（=O）（O）O）c2cc1CZINC3871612-12.65Nc1ncnc2c1ncn2（C@H）1O（C@@H）（CO（P@@）（=O）（O）O（P@@）（=O）（O）OP（=O）（O）O）（C@@H）（O）（C@H）1OZINC1769096-11.78Cc1cc2nc3c（=O）（nH）c（=O）nc-3n（C（C@ H）（O）（C@H）（O）CO）c2cc1C于二零一九年一月十六日（二零一九年）100210S. Sundar等人4ZINC 3831425，ZINC 3871612）具有更好的PknA对接分数，其列于表1中，并且相互作用示于图1中。 2. 对接结果的完整列表见补充文件S1。图3. a）MD模拟过程中PknA的RMSD和b）PknA的RMSF图。粉色线描绘了PknA与ZINC 1769096的复合物，而红色和绿色线分别描绘了PknA：ZINC 3831425和PknA：ZINC 3871612复合物。图4. a）PknA和ZINC 1769096 b）PknA和ZINC 3831425 c）PknA和ZINC3871612之间的氢键。H192、D193、A194、S198、D199、S202（如图所示） 2）。从3176种FDA批准的抗PknA药物的初步筛选中，我们选择了前三种最好的化合物（ZINC 1769096，有趣的是，我们最好的命中之一，ZINC 3831425，是一种黄素单核苷酸，这是细胞和组织中发现的核糖体蛋白（维生素B2）的主要形式。ZINC 1769096是一种来苏沙文，最初从人心肌中分离出来，其替代核糖沙文的能力有限。维生素或矿物质等营养补充剂可以通过增强患者的免疫反应来帮助患者对抗结核病。单独使用维生素或与现有抗生素联合使用，增强了结核病治疗效果。Greenstein等人，在2012年[23]，显示维生素A和D对Mtb具有剂量依赖性抑制作用。此外，Chun等人，在2011年[24]中，阐明了维生素D通过增强抗微生物肽如Cathelicidin的产生而具有抗分枝杆菌特性，从而导致TB感染细胞的自噬。同样，Vilchèze等人，在2013年[25]表明，维生素C可以通过产生反应性氧物质杀死Mtb感染的细胞，这导致DNA损伤，脂质改变和redoX平衡。他们还表明，在体内模型中，添加维生素C与利福平和异烟肼的组合缩短了TB治疗期。Khameneh等人最近的一项综述研究，在2019年[26]已经阐明，单独使用天然产物、维生素、微量营养素和微量元素或与现有抗生素联合使用可以提高治疗效果并减少现有药物的不良反应我们的对接结果表明，Ribo B2avin或维生素B2化合物可能结合并抑制PknA。因此，它可以与其他抗生素联合使用，并可以有效地用作结核病治疗的替代然而，需要进一步的研究来阐明上述假设。3.2. 分子动力学模拟研究所 选 化 合 物 与 PknA （ PknA ： ZINC 1769096 ， PknA ： ZINC3831425，PknA：ZINC 3871612）的稳定性如下：使用分子动力学模拟研究。对每个系统进行了50 ns的MD模拟。使用C-α原子计算RMSD，RMSF图如图3a所示，B. PknA与ZINC 1769096复合物的RMSD在约30ns时达到0.35nm时达到平衡，并且在整个50ns模拟时间内保持不变。类似地，与ZINC 3831425和ZINC 3871612复合的蛋白质的RMSD在约30 ns处分别达到0.32 nm和0.33 nm，并且在整个模拟过程中保持稳定。RMSF值高于0.2 nm的残留物被认为是可移动的。在所研究的三个系统中，活化环（残基162-184）和富含Gly的P-环（残基22-26）是可移动的并且促进配体结合。蛋白质和化合物之间的氢键图见图4 a-c。在模拟过程中，蛋白质和ZINC 1769096之间的氢键数量在0和8之间变化，而对于PknA：ZINC 3831425和PknA：ZINC3871612，分别在0到5和0到6之间变化。因此，这些化合物或其衍生物可以成功地用于抑制PknA。3.3. 自由结合能计算MD模拟过程中获得的整个轨迹用于计算对接复合物中配体的自由结合能GROMACS的g_mmpbsa工具意味着使用MM/PBSA方法对于每种复合物，计算范德华能（Evdw）、静电能（E vdw）、极性溶剂化能（Gpolar）、非极性溶剂化能（Gnonpolar）和结合自由能（△Gbind），见表2。Evdw、Enr和G非极性对结合能有负贡献，而G极性于二零一九年一月十六日（二零一九年）100210S. Sundar等人5表2ZINC 1769096、ZINC 3831425和ZINC 3871612的结合能计算。Evdw（kJ/mol）E（kJ/mol）G极性（kJ/mol）G非极性（γSASA + b）（kJ/mol）△G结合（kJ/mol）ZINC3831425-242.531 ±14.166-27.081 ±11.089120.857± 17.347-18.616±0.920−167.370 ±15.509ZINC3871612−154.841±160.103-10.203 ±12.40264.594± 54.085−9.787±10.311-110.237±133.772ZINC1769096−167.613 ±47.301-29.347 ±10.78377.601± 26.813-14.056±4.099−133.415 ±35.109对它有积极的贡献 如表2所示，所有三种化合物的结合能均低于零，并显示出对PknA的良好亲和力。有趣的是，研究人员发现ZINC 3831425具有非常好的结合能，范围为−167 kJ/mol，并且与PknA有非常强的相互作用。在所研究的三种复合物中，范德华相互作用对结合能的贡献最大.4. 结论PknA是结核分枝杆菌的七种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一。它是一种必需蛋白，因为它磷酸化参与Mtb存活和毒力的重要蛋白。现有药物的重复使用有助于更容易和快速地治疗结核病的耐药性。利用分子对接研究，我们筛选了3176种FDA批准的抗PknA的药物，并分离出最好的化合物用于进一步研究。通过分子动力学和结合自由能的研究，对与PknA对接得分最高的3个化合物进行了进一步分析发现所选择的三种对接复合物从30 ns开始稳定，并且在整个模拟过程中保持相同 结合能的计算结果表明，范德华相互作用是很重要的。在所选的三种化合物中，发现两种化合物（ZINC 3831425和ZINC 1769096）是ribo-1769-avin分子的衍生物。通过自由结合能分析，我们发现ZINC 3831425与PknA有很强的相互作用.从我们的计算机模拟研究中，我们已经表明基于RiboB3 avin（维生素B2）的化合物抑制PknA并且可能具有抗分枝杆菌特性。然而，这需要进一步的研究来阐明这一假设。利益冲突所有作者均声明无利益冲突确认作者感谢新德里生物技术部（DBT）提供生物信息学基础设施（DBT-BIF）成功开展这项研究。我们还感谢印度泰米尔纳德邦哥印拜陀市Bharathiar大学生物信息学中心DBT为开展这项工作提供了所有计算设施。Shobana Sundar通过DBT授予的研究助理职位（奖励函编号：C3/ 20541/2018）确认财务支持附录A. 补充数据本文的补充数据可以在doi.org/10.1016/j.imu.2019.100210上找到。引用[1] 张文辉，张文辉. 完全耐药结核病：抗麻风药物有用吗？IntJ AntimicrobAgents2013;42：584-5.[2] Van Deun A，Maug AK，Salim MA，Das PK，Sarker MR，Daru P，et al. Short，highly effective，and economic standardized treatment of multidrugresistanttuberculosis. AmJ Respir Crit Care Med 2010;182：684-92.[3] [10] ChangS，Chang R，Chang J，Chang J，et al. 从完整的基因组序列中解读结核分枝杆菌的生物学。Nature1998;393：537.[4] PeirsP，De Wit L，Braibant M，Huygen K，Content J. 结核分枝杆菌的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。欧洲生物化学杂志1997;244：604-12。[5] BaerCE，Iavarone AT，Alber T，Sassetti CM. 结核分枝杆菌临时Ser/Thr蛋白激酶相互作用网络中的生化和空间一致性。J Biol Chem 2014;289：20422-33.[6] [10] Nagarajan S，Upadhyay S，Chawla Y，Khan S，Naz S，SubramanianJ，et al.结核分枝杆菌的蛋白激酶A（PknA）是独立激活的，对病原体在体外的生长和在宿主中的存活至关重要。J Biol Chem2015;15：9626-45.[7] ChaoJ，Wong D，Zheng X，Poirier V，Bach H，Hmama Z，Av-Gay Y. 结核分枝杆菌生理和致病中的蛋白激酶和磷酸酶信号。Biochim Biophys Acta ProteinProteonomics2010;1804：620-7.[8] RavalaSK，Singh S，Yadav GS，Kumar S，Karthikeyan S，Chakraborti PK.GT基序中苏氨酸磷酸化触发PknA激活的证据，PknA是一种来自结核分枝杆菌的真核丝氨酸/苏氨酸激酶。FEBS J2015;282：1419-31.[9] [10]李文辉，李文辉，李文辉，李文辉，李文辉. 对M. 结核病显示Src样自抑制构象。蛋白质：结构、功能生物信息。2015;83：982-8.[10] Wang T，Bemis G，Hanzelka B，Zuccola H，Wynn M，Moody CS，et al. MtbPKNA/PKNB dual inhibition provides selectivity advantages for inhibitor designtominimize host kinase interactions. ACS Med Chem Lett2017;8：1224-9.[11] MagnetS，Hartkoorn RC，Székely R，Pató J，Triccas JA，Schneider P，et al.从激酶抑制剂库筛选中获得抗结核化合物的线索。结核病2010;90：354-60。[12] SinghJ，Mansuri R，Kumar M，Sahoo GC.与药物库化合物的对接研究和结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A优良药物靶标的抑制剂鉴定。 Int J Commun Syst2016;4：10-6.[13] [10] BermanHM，Westbrook J，Feng Z，Gilliland G，Bhat TN，WeissigH，et al. 蛋白质数据库 核酸研究2000;28：235-42。[14] IrwinJJ，Shoichet BK.ZINC-一个免费的商业化合物数据库，用于虚拟筛选。J Chem Inf Model 2005;45：177-82.[15] 田伟，陈聪，雷X，赵军，梁军。 CASTp 3.0：蛋白质表面形貌的计算机图谱。核酸研究2018;46：W363-7。[16] PettersenEF，Goddard TD，Huang CC，Couch GS，Greenblatt DM，MengEC，FerrinTE. UCSFChimera-探索性研究和分析的可视化系统 计算化学杂志2004;25：1605-12.[17] BIOVIA Discovery Studio 2017 R2：生命科学领域的综合预测科学应用。SanDiego，CA. http://accelrys.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio.[18] Abraham MJ ， Murtola T ， Schulz R ， Páll S ， Smith JC ， Hess B ， Lindahl E.GROMACS：通过从笔记本电脑到超级计算机的多级并行进行高性能分子模拟。SoftwareX 2015Sep 1;1：19-25.[19] HessB，Bekker H，Berendsen HJ，Fraaije JG. LINCS：分子模拟的线性约束求解器。计算化学杂志1997;18：1463-72.[20] 1999年10月20日，J.S.M. 光滑粒子网格Ewald方法。化学物理杂志1995;103：8577-93.[21] Kumari R等人，g_mmpbsa-用于高通量MM-PBSA计算的GROMACS工具。J ChemInf Model 2014;54：1951-62.[22] Kollman PA，Massova I，Reyes C，Kuhn B，Huo S，Chong L，et al.计算复杂分子的结构和自由能：结合分子力学和连续模型。 Acc Chem Res 2000;33：889-97.PM ID ：11123888。[23] 王文，等.放射性培养中&分枝杆菌的生长抑制作用.中国农业科学院学报，2000，24（1）：117 - 119. PLoS One2012;7：e29631.[24] ChunRF，Adams JS，Hewison M. 维生素D的免疫调节作用：对结核病的影响EXpert Rev Clin Pharmacol 2011;4：583-91。[25] Vilchèze C，Hartman T，Weinrick B，Jacobs Jr. WR。结核分枝杆菌对维生素C诱导的芬顿反应的杀伤非常敏感。Nat. Commun. 2013;4：1881。[26] Khameneh B，Iranshahy M，Vahdati-Mashhadian N，Sahebkar A，Bazzaz BSF.非抗生素治疗：一种有希望的结核病治疗方法。药理学研究; 2019年。 104289。
我的内容管理
展开
