小麦赤霉病抗性突变体的筛选及SSR标记检测DNA多态性

可在www.sciencedirect.com上在线获取ScienceDirectIERI Procedia 8（2014）66 - 762014年农业与生物系统工程小麦赤霉病抗性突变体的筛选及SSR标记检测DNA多态性Saule Kenzhebayevaa，Svetlana Turashevaa，Gulina Doktyrbaya，HermannBuerstmayrb，Saule Atabayevaa，Ravilya Alybaevaa*aAl-Farabi Kazakh National University，Al-Farabi av.，地址：71，Almaty，哈萨克斯坦b维也纳自然资源和生命科学大学，农业生物技术系，IFA Tulln，植物生产生物技术研究所，Konrad Lorenzstrasse 20，A-3430Tulln，奥地利 *摘要小麦赤霉病是小麦的主要病害之一，主要由禾谷镰刀菌引起。培育持久抗病品种，很大程度上依赖于不断将新的抗病基因，特别是不同防御机制的抗病基因导入适应品种。本研究的主要目的是评估在哈萨克斯坦种植的三个春小麦品种和春小麦突变系（M3代）在其遗传背景上通过辐射处理（100和200 μ m射线）的抗赤霉病性，并使用基于PCR的DNA标记，如SSR标记来调查小麦种质的遗传多样性。小麦品种和突变体对赤霉病的抗性表型存在显著差异。与亲本M3突变系。 在遗传背景下获得了3个M3突变株系. 利用21个SSR标记分析了M3代春小麦品系和非诱变植株的遗传多样性。** 通讯作者。联系电话：+7-727-377-3329;传真：+7-727-377-3380电子邮件地址：kenzhebaeva. kaznu.kz2212-6678 © 2014由Elsevier B. V.发布 这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。信息工程研究所负责的选择和同行评审Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）6667© 2014 Saule Kenzhebayeva，Svetlana Turasheva，Gulina Doktyrbay，Hermann Buerstmayr，SauleAtabayeva，Ravilya Alybaeva.由爱思唯尔公司出版信息工程研究院负责评选和同行评议© 2014由Elsevier B.V.发布 这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：小麦突变体;抗赤霉病; SSR标记1. 介绍小麦是全球第二大作物，2011 - 2012年期间世界总产量估计约为6.63亿吨（http：//faostat.fao.org/;http：//www.igc.int/）。目前，全世界种植的小麦中约95%是六倍体面包小麦，其余5%中的大多数是四倍体硬粒小麦。中亚地区是世界上最重要的小麦种植区之一。哈萨克斯坦是中亚最大的小麦生产国之一。在哈萨克斯坦，小麦是第一粮食作物。小麦（Triticum aestivumL.）占总面积的91%，硬粒小麦仅占总面积的9%。春小麦占哈萨克斯坦小麦总面积的95%.为了满足2020年全球粮食需求，小麦产量应增加约40%。自公元前8,000年左右起源以来，六倍体面包小麦（Triticum aestivumL.）一直在进行密集的选择，旨在开发适应不同环境条件和农业实践的改良高产品种。许多农艺性状的育种改良需要遗传变异，这些变异成分必须与非遗传效应分离。为了有用，抗性的进步必须在不对其他重要性状（如产量）产生负面影响的情况下实现。因此，培育具有不同遗传基础的小麦基因型是实现自给自足和可持续发展的一个因素外界普遍认为包括面包小麦在内的主要作物的遗传多样性随着时间的推移而总体减少，主要是由于驯化过程的结果，以及最近由于经常使用适应种质和采用不利于广泛遗传重组的育种方案[1，2，3]。1.1 使用诱变剂诱导遗传变异遗传变异对于许多作物物种的改良至关重要，包括小麦，几乎所有的作物改良计划都依赖于可用种质的遗传多样性[3]。诱变是作物改良的重要工具，不受转基因生物的监管限制[4，5]。利用天然或诱导的遗传多样性是改良所有主要粮食作物的一种行之有效的策略，使用诱变来产生新的变异在遗传变异有限的作物中特别有价值[5]。使用物理诱变剂，如X射线、伽马射线和化学诱变剂来诱导变异，是公认的。在过去的70年中，根据IAEA/FAO突变品种数据库，已经发布了2500多个来自诱变程序的品种，包括534个水稻品系、205个小麦品系和71个玉米品系（http：//www-info.iaea.org/MVD/）。这些诱导的突变有助于开发许多重要的农艺性状，例如更短的生长期，适合轮作，增加对主要作物如小麦，水稻，大麦，棉花，花生和豆类中使用的非生物和生物胁迫的耐受性或抗性[6，7]。1.2 赤霉病由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的镰刀菌头枯病（Fusarium head blight，FHB）是主要影响小麦、玉米和大麦，包括其它作物的真菌病害。它于1884年首次在英国被发现，由于受感染的谷粒呈白垩状，无生命的外观，它被称为小麦赤霉病，后来被称为小麦赤霉病。68Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）66墓碑病[8]。FHB可导致由于小花不育和减少的谷粒重量而导致的显著产量损失以及由于产生真菌毒素而导致的品质降低。小麦（和其他谷物）中出现此类天然污染物令人非常担忧，因为它们在饲料和食品中的存在通常与牲畜的慢性或急性真菌中毒有关，并可能威胁人类健康[9]。使用管理策略（如轮作、耕作和应用杀真菌剂）控制FHB仅产生有限的结果[10]。控制小麦赤霉病最有效的策略是培育抗病品种。对赤霉病的抗性表现出数量变异，其遗传涉及不同染色体上的几个位点[11]。基因型X环境相互作用使FHB抗性的表型评价复杂化，并且使得FHB抗性的筛选费力、耗时且昂贵[12]。1.3 DNA多态性检测、基因型鉴定和遗传多样性的分子标记基于聚合酶链反应（PCR）方法的分子标记，如简单重复序列（SSR）或微卫星，提供了一个强大的方法来分析许多作物品种之间的遗传关系。分子标记是对栽培品种的形态和生理表征的有用补充，因为它们是丰富的，独立于植物组织或环境影响，并且允许在植物发育的非常早期鉴定栽培品种[13，3]。栽培品种的分子表征也可用于评估潜在的遗传侵蚀，即，在繁殖过程中遗传多样性的减少。基于DNA的标记在小麦和其他具有明显狭窄遗传背景的作物中特别有用。微卫星是由2-6 bp的短DNA序列组成的串联重复序列，在动植物中具有高度的多态性。基于聚合酶链反应（PCR）的微卫星分析比RFLP分析更容易进行，并且非常适合自动化。在大多数情况下，微卫星以共显性方式遗传，并且是染色体特异性的。微卫星已成功用于构建遗传图谱[14，15]，鉴定外源染色质[16]和定位农艺学重要基因[17，18，19]。本 工 作 的 目 的 是 验 证 在 哈 萨 克 斯 坦 种 植 的 三 个 春 小 麦 品 种 cv“Zhenis” 、 cv“Almaken” 和cv“Erithrospermum-35”以及通过辐射处理（100 μ m和200 μ m射线）在其遗传背景上开发的高级突变系对赤霉病（FHB）的感病/耐受表型。利用21个SSR引物对春小麦基因型的分子特征和遗传多样性进行了研究。我们描述了筛选结果开发更高生产力突变体M3春小麦相比，非诱变植株的耐赤霉病表型和小麦微卫星标记的分子基因分型。本研究的目的是：（1）选育春小麦生产力构成因素的M3突变系，（2）评价M3突变系与春小麦品种间赤霉病抗性表型的遗传变异，（3）评价M3突变系与非诱变品种间的遗传关系。2. 材料和方法2.1 植物材料田间试验于2011年进行。本研究所用的植物材料由138个春小麦M3突变系组成，这些突变系是在“Zhenis”、“Almaken”和“Erithrospermum-35”三个品种的遗传基础上，用100和200 Gy的辐射处理和非诱变植株培育而成的为了筛选对赤霉病的抗性，在温室中进行了盆栽试验Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）6669在辐射敏感性研究的基础上，选择100和200 Gy剂量对春小麦Zhenis品种进行辐照。获得M3突变株系。最初，在哈萨克核中心的电离装置（PXM -120，60Co伽马射线）中进行1000个种子的辐照。这些植物在田间试验地块中生长。在田间条件下进行了高产潜力突变系的筛选。从M3开始每代进行单株选择，考虑以下产量参数：与亲本品种相比，单株籽粒产量、每主穗籽粒数更大、每主穗籽粒重量更大。根据产量构成因素选择最佳基因型。2.2 镰刀菌抗性测试从禾谷镰刀菌分离的孢子用于接种。大分生孢子的F.如Snijders和Van Eeuwijk（1991）和Buerstmayr等人（2000，2002）[20，21，22]所述制备禾谷镰刀菌。将小麦和燕麦仁（3：1）的混合物在水中浸泡过夜，然后高压灭菌并接种。然后将混合物在25°C下孵育2周，随后在5°C下在黑暗中孵育3周，导致产生大分生孢子。用去离子水将大分生孢子从定殖的谷粒上洗掉。在显微镜下用Bürker-türk计数器计算分生孢子的浓度。分生孢子的浓度为50.000分生孢子/ml，并在-80 °C下储存用于接种程序[22]。用真菌悬浮液人工接种植株。突变株系和非诱变植物的穗的第一次接种在开花期在受控温室中于20°C于2012年6月12日进行。在大约50%的穗开花时接种它们。当花药从耳朵中间出现时，就可以看到这一点。使用马达驱动的背负式喷雾器，将5ml接种物喷雾在头部上。接种后，用塑料袋覆盖头部24小时，以确保高湿度。在晚上进行接种。三天后，同样的程序重复了两次。对于评分，我们假设每穗24-28小穗的平均头部大小作为估计FHB严重性的基础;例如，每穗一个感染小穗的平均值被评定为5% FHB严重性。在接种后10、14、17、21和24天记录疾病症状。在每个小区中，根据线性标度0至100%感染的小穗在整个小区的基础上估计视觉感染的小穗的百分比。镰刀菌严重度水平计算为每穗镰刀菌2.3 DNA提取和SSR引物来源使用Saghai-Maroof等人（1984）描述的CTAB提取方法从幼叶中分离基因组DNA。通过使用BioSpecNanoDNA分光光度计测定DNA浓度。利用21对微卫星引物对小麦突变系和未诱变植株进行了DNA多态性检测。用引物Barc 263、Gwm 11、Gwm 337、Barc 13、Barc 12、Barc 42、Gwm 359、Gwm 533、Barc 56、Gwm 681对1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、3D、4A、5A、6A、6B、6D、7A、7D染色体进行DNA水平上的变异分析。使用M13加尾微卫星进行PCR扩增。一个微卫星引物在5'端由M13序列延伸。将40-150 ng基因组用R-、F-引物、0.2 mM dNTP混合物（MBI Fermentas）、0.05单位/μl Taq-聚合酶及其相应的反应缓冲液消化。F-Primer在5 '端具有M13-30序列。M13-30序列为：5' CCCAGTCACGACGTTG 3'。它在5 '端用荧光染料标记。对于该方法，将具有M-13加尾荧光引物的正向引物添加到PCR反应中M13加尾SSR的反应混合物含有0.02 μ l正向引物70Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）66(10 M13-尾在5'端：CCCAGTCACGACGTTG），0.18 μ l M13引物（在5'端具有荧光染料IRD 700或IRD 800）0.2 μ l反向引物（10 μ M）、1 μ l 10 X PCR缓冲液（包括15 mM MgCl 2）、1 μ l dNTP-混合物（每种dNTP 2 mM）、0.1 μ l Taq聚合酶（5单位/μ l）和2 μ l模板DNA进行10 μ l反应。M13加尾引物的PCR程序为94°C 2分钟，然后30个循环：94°C 1分钟，0.5°C s-1至51°C，51°C 30秒，0.5°C s-1至72 °C和72°C 1分钟，然后72°C 5分钟。在384孔Eppendorf Mastercycler上进行PCR。扩增的循环概况如下：在初始变性步骤（95°C/2 min）之后，95°C/50 s、63°C/1 min 30 s的6个循环和72°C/1 min 30 s的延伸25个循环。PCR产物用ddH2 O（1：5或1：10）稀释，加入5 μl甲酰胺上样缓冲液（95%甲酰胺去离子水，0.5mMEDTA，0.1mg/ml新品红），在95 ℃变性10分钟并上样到凝胶上。使用Typhoon（GE Healthcare）荧光扫描仪上的荧光检测进行微卫星。3 结果和讨论3.1 镰刀菌抗性测试在开花期间用黄色镰刀菌人工接种每个生长的株系。这些品系都对接种物有反应，并表现出不同的症状。表1-3显示了不同小麦品种的M3系和非诱变植株的每穗感病小穗%的结果。以“珍尼斯”为遗传背景获得的M3表1.用100倍γ射线辐照处理后接种15天的珍尼斯及其遗传背景上的M3突变系，获得了赤霉病抗性的视觉评分平均值小麦基因型每穗感染小穗的%主穗粒重，g每主穗单株籽粒产量，gcv9.27%1.30±0.3236.2±6.782.34±0.8215岁（1）8.65%1.53454.7915岁（1）6.96%1.31343.7216岁（16）6.98%1.53392.0612岁以下12.82%1.63491.81第122章（1）5.15%1.29521.26第二章（2）9.48%1.18433.2112岁以下儿童11.60%1.53412.76对以“Zhenis”为遗传基础的M3代突变系的筛选结果表明，100倍γ射线处理对小麦赤霉病的抗性有正、负两方面的诱变效应。对禾谷镰刀菌的抗性目测评分结果表明，Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）6671小穗感染率为9.27%。3个M3突变体株系，即15、16和22（1），在接种后15天的侵染率明显低于Zhenis。与浙尼斯品种相比，M3系对禾谷镰刀菌的抗性平均值最高，对病原真菌代谢产物的抗性稳定。 M3系S106（12）和S1022（12）对亲本“Zhenis”FH B的感病率较高（表1）。表14.2以“Almaken”为遗传背景，经100-γ射线辐照筛选获得的抗赤霉病的M3突变系，与“Zhenis”一样，“Almaken”也具有抗病性，平均小穗病率为9.27%。接种后15天，M3系穗颈89（4）的侵染率明显低于亲本“Almaken”。筛选结果表明，M3株系中的1089（4）可被鉴定为FH抗B细胞株.生产力系数ts、主穗粒重t和单株籽粒产量表明，该M3系的这些元素的平均值均高于未诱变的“表2.用100 μ m射线辐照小麦品种“Almaken”和在其遗传背景上获得的M3突变系，接种后15天的赤霉病抗性目测评分平均值小麦感染小穗的基因型每粒重穗粒数单株籽粒产量，尖峰主尖峰，g主穗Gcv9.27%0.95±0.3527±9.501.69±0.17七十九（三）16.6%1.02372.0第182章（二）11.1%1.61471.021988年1月（2）18.95%1.03390.72中国（4）6.96%1.62362.031984年4月（6）8.95%1.41382.41如所示的筛选结果，与其他供试品种相比，品种“Erithrospermum-35“的FHB抗性，观察到每穗感染小穗的百分比较高或抗病性水平较低，平均为32.32%（表1-3）。在“Erithro s per um-35”的遗传背景上获得了3个M3抗病性最强的是豫150（5）其它M3系，除系E138（1）外，均表现为每穗感病小穗数%较低3.2 微卫星标记利用SSR标记对3个春小麦品种“Zhenis”、“Almaken”和“Erithrospermum-35”进行了DNA多态性检测，共检测到21个SSR位点。利用SSR引物Barc 263、Gwm 11、Gwm 337、Barc 13、Barc 12、Barc42、Gwm 359、Gwm 533、Barc 56、Gwm 681对小麦突变体基因组的1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、3D、4A、5A、6A、6B、6D、7A、7D染色体进行了筛选。图1显示了使用SSR标记Gwm359、Barc12、Gwm533、Barc56的扩增模式（D）。72Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）66分别位于小麦2AS、3A、3BS和5A染色体上。对筛选出的M3系进行分子标记筛选，结果表明，“Zhenis”的M3系F148（3）这些株系在SSR标记Gwm359、Barc12、Gwm533、Barc56处显示出额外的等位基因（图1）。①的人。表3.用100和200倍的γ射线处理，在其遗传背景上获得的品种“赤实35”和高级M3突变系，接种后15天的抗镰刀菌性目测评分平均值小麦基因型和剂量照射，X射线的每穗感染小穗的%，%主穗粒重，g主穗单株籽粒产量，g品种32.32%0.80±0.2829.38±5.551.41±0.441990年10月9日（1），10026.51%1.59462.54109（5），10021.57%1.84444.74110（1），10018.65%1.7411.61999年12月9日（3），10014.27%0.87391.861991年3月3日（3），10024.12%1.97452.871935（3），10026.11%2.06531.751991年13月8日（1），10032.32%2.41482.78150（5），20016.77%1.01390.92据报道，SSR标记GWM 533与Sr2基因紧密连锁[19]。发现Sr2基因的基于简单重复序列（SSR）的GWM 533和基于CAPS的CsSr 2标记有希望用于基因 的分子确认，并已在澳大利亚、美国 和CIMMYT、墨西哥用于秆锈病育种计划[23，24]。Fig. 1.利用Gwm359（a）、Barc12（b）、Gwm533（c）、Barc56（d）对1 -品种“Zhenis”（非诱变植株），2 -M3系“Z48（3），3 -M3系”Z49（6）。Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）6673“Zhenis“及其M3系的分子筛为S105（1），100 nm），Zh e n为S102 5（9，10 0 μ m），Z henis 51（8），2 0 0 μ m，Zh e nis 51（4），10 0 μ m），Z h e nis 25（1 2），1 00 μ m），Z h e nis 43（4），20 0 μ m），Z h e nis 16（9），图2中未示出由B a rc1 2（3A）、B a rc4 2（3DL）、G w m 53 3（3BS）和G w m 6 8 1（7A）构成的Ze nis 16（1，10 0π）这些染色体上的等位基因数目发生了变化。图2.以“Zhenis”的Barc 12（a）、Barc 42（b）、Gwm533（c）、Gwm681（d）和M3突变体为材料，经100和200 bp的引物扩增，获得了4个SSR引物。 2-M3系1995（1）、3 - 19925（9）、4 - 19951（8）、5 - 1995（4）、6 - 19925（12）、7 - 19943（4）、8 - 19916（9）、9 - 19916（1）。图3显示了在其遗传背景上开发的cv“Almaken”和高级M3系的Barc42（3DL）、Gwm533（3BS）、Gwm681（7A）、Barc273 DNA标记的扩增谱。在3D L、3BS上的类似差异具有线108 2（6）、101 01（8）、108 9（3）、1010 1 - 3、10101（5、109 4（2）。M3品系138（2）用“Erithr orbumum- 35“进行标记，并通过辐照处理，获得了100个4.结论和未来展望培育和利用抗病小麦品种是控制赤霉病最经济实用的途径。对赤霉病抗性的研究以及育种工作主要集中在中国来源的渐渗抗性上。来自中国抗病品系苏麦3号及其衍生物的3BS QTL为了避免完全依赖于有限的耐药来源，找到新的和不同的耐药来源是一个关键目标。74Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）66本研究以“Zhenis”、“Almaken”和“Erithrospermum-35”3个春小麦品种的遗传基础上，经100和200 μm射线辐照，选育出的138个春小麦M3代新突变系为材料，对小麦赤霉病抗性进行了研究。在哈萨克斯坦种植的3个春小麦品种中，抗赤霉病的遗传变异显著。其中，在Zhenis的遗传背景下，用100 μ l的辐射诱变选育出3个M3突变系，即106（15）、106（16）和1022（1）。在诱变群体中还研究了农艺性状与赤霉病抗性的相关性。M3系、汕89（4）系是在V.一次光照射和100次射线照射可被鉴定为对疾病感染的耐受。生产力构成因素、主穗粒重、克重和单株籽粒产量的测定结果表明，该M3代的产量构成因素的平均值均高于未诱变的品种。图三.利用100Gy的辐照处理获得的变异株系和M3为材料，对Barc 42（a）、Gwm533（b）、Gwm681（c）、Barc 273（d）标记进行了SSR扩增。1-cv“Almaken”（非诱变植株）、2-cv 82（6）、3 -cv 101（8）、4 -cv 89（3）、5 -cv 101（3）、6 -cv 101（5）、7 -cv 94（2）、8 - cv“Erithromum-35”（非诱变植株）、9 -M3株系“Erithromum-35”（非诱变植株）经100 μ m的辐射处理，在“Erithromum- 35”（非诱变植株）的遗传背景上选育而成。在V上获得了3条M3突变线根据遗传背景，E110（1）、E1129（ 3）和E1150（5）的特征是与非诱变性疾病相比具有较高的疾病抗性。新育成的春小麦M3系可作为小麦抗赤霉病基因的新来源，加速哈萨克斯坦抗赤霉病育种进程。这些来源的不同基因可被整合到单个品系中，然后这些品系可作为亲本用于小麦赤霉病抗性改良。然而，育种计划的最终目标应该是培育出尽可能具有最大抗性的品种。利用SSR标记对哈萨克斯坦3个小麦品种的138个突变系进行了遗传多样性研究。共检测到21个SSR位点。对浙尼15（ 1）、浙尼25（ 9）、浙尼251（8）、浙尼25（4）、浙尼25（1 2）、浙尼43（4）、浙尼16（9）、浙尼16（1）的SSR标记3A、3DL、3BS、7A的等位基因数进行了分析。“Zhenis”的突变系比“Almaken”和“Erithrospermum-35”的突变系变异性大。这一发现还表明，Saule Kenzhebayeva等人/ IERI Procedia 8（2014）6675诱变对作物改良的潜力。对变异小麦种质资源中抗镰刀菌基因的鉴定，将有助于加快小麦品种的选育，包括不同小麦抗镰刀菌基因在小麦基因型和品种中的鉴定。确认第一作者希望感谢（1）国际原子能机构（奥地利）通过国家技术合作项目KAZ/5002“使用核技术和分子技术改良小麦和玉米”提供的财政支持引用[1] Donini P.，罗先生，Koebner R.M.D.，李维斯Cooke R.J.英国小麦多样性的时间趋势。理论与应用遗传学2000; 100：912[2] 赖夫·JC张平，Dreisigacher S.，Warburton M.L.，金克尔姆湾货车Hoisington D.，博恩M.和Melchinger A.E.小麦驯化育种过程中的遗传多样性变化趋势。理论与应用遗传学2005; 110：859[3] 阿克菲拉特足球会和Uncuoglu A.A.冬小麦遗传多样性研究SSR标记的结果。生化遗传学2013; 51：223[4] 马卢辛斯基湾和Szarejko I.在绿色革命和基因革命中诱发突变。在：Pastorosa R.，Phillips R.L.，盖尔·M（编辑）国际大会的会议记录“在双重阻碍的觉醒：从绿色革命到基因革命”，2003年; 5月27日至31日，博洛尼亚，意大利，pp. 403-425[5] 帕里·马吉Madgwick P.J.，巴戎角，Tearall K. 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