海藻糖在酱油酵母中的积累及其对不同胁迫条件的响应

© 2013年。由爱思唯尔公司出版信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.comwww.sciencedirect.com上在线获取ScienceDirectIERI Procedia 5（2013）321 - 3262013年农业与自然资源工程不同胁迫条件Xiaohua Wang，Yanyan Zhang，Cong Wang，Chunling Wang Lihua Hou*食品营养与安全教育部重点实验室（天津科技大学），天津300457摘要海藻糖可以保护生物体免受不利条件，如高渗透压、热、氧化、干燥和冷冻。本研究首先对酱油酵母产海藻糖的能力进行了研究，结果表明，海藻糖在对数生长期逐渐积累，在稳定期达到一个浓度峰值。研究了酱油酵母的生长条件与胞内海藻糖含量的相关性。能在高渗条件下生长的突变株S3-2、T3-5表现出与其原始生物鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii，S）和鲁氏球拟酵母（Torulopsisrubbella，T）不同的结果。在9%的盐胁迫下，S和T可使海藻糖含量分别从7.0%和7.5%提高到8.4%和9.6%。而突变体在高盐（约12%）条件下比在0%NaCl条件下能积累更多的海藻糖，这是突变体的一个显著特征。出发菌株经热激（40、30min）后，海藻糖含量分别从8.4%和9.6%提高到10.1%和10.9%。此外，在热刺激条件下，突变菌株也能产生更多的海藻糖，但产量低于原始菌株。© 2013作者。由ElsevierB. V.在CC BY-NC-ND许可下开放获取。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：海藻糖;酱油酵母;盐刺激;热刺激;1. 介绍酱油是最受欢迎的调味品之一，几乎被世界各地的人们所使用，特别是在亚洲和东南亚。事实上，它起源于2,500多年前的中国年度我国酱油产量超过500万吨，占世界的55%以上------* 侯丽华。联系电话：电话：022 -60601428传真：022 -60601428邮箱：452457231@163.com2212-6678 © 2013作者由爱思唯尔公司出版 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究所负责的选择和同行评审doi：10.1016/j.ieri.2013.11.110322Xiaohua Wang等人/ IERI Procedia 5（2013）321生产[1，2]，并在未来表现出递增趋势。酱油中含有大量的营养成分，如人体必需的各种氨基酸、锌、钙、铁、锰、天然抗氧化剂和其他微量元素，这些都显示了其巨大的营养价值。此外，酱油与其他发酵大豆食品（如纳豆、豆豉、天培和腐乳）具有相同的功能（降低血压）[3-6]。众所周知，酱油是由蒸汽处理的大豆和烤小麦在工业和传统的曲发酵过程。鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii，S）和鲁氏球拟酵母（Torulopsis pastillo，T）均为耐盐酵母，在盐浓度为17%左右的高盐酱油液体发酵中得到广泛应用。由于S和T可以在18%的盐中生长，而它们的突变株S3-2和T3-5通过基因组重排技术获得的突变株甚至可以在21%~ 22%的盐中生长。酵母菌在酱油酿造中起着重要的作用。例如，Z. Rouxii（S）能提高酱油中重要风味物质HEMF的含量。而T.酱油（T）能充分利用酱油中的还原糖生成多元醇、4-EG和4-EP，适量的4-EG和4- EP能使酱油具有浓郁的酯香，增加酱油的醇香。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1键结合而成的一种非还原性双糖。它是白色，无味的粉末，相对甜度为蔗糖的45%[7]。海藻糖存在于大多数生物体中，包括细菌、真菌、昆虫、植物和无脊椎动物[8-10]。它为它们提供能量，并且由于其固有的特性，即防止淀粉凝沉和稳定蛋白质和脂质，它可以保护细胞和生物分子免受高渗透压的伤害，例如热，氧化，干燥和自然冷冻[11-13]。因此海藻糖被称为迄今为止，关于它如何保护生物体有两种假设。一种是水置换假说，支持海藻糖在细胞失水时可以置换水与生物分子形成氢键，使分子保持一级结构而不丧失生物活性。另一个假设是海藻糖的玻璃形成能力[14]。认为海藻糖在其玻璃化转变温度（Tg）后可形成玻璃态或类似冰的玻璃态，从而将生物分子紧密包裹。其结果是分子在失水的情况下有足够的空间来抵抗有害环境的破坏。这种玻璃化转变或玻璃化理论被认为是解释海藻糖生物保护作用的最广泛接受的假说。无论哪一点是正确的，都不能影响它的应用。例如，实验证实它可以帮助治疗干眼症[15]。实验已经证实，与两种市售滴眼液相比，外部添加的海藻糖（哺乳动物中没有海藻糖）是治疗中度至重度干眼综合征的更好方法。原因可能是海藻糖是一种天然物质。此外，海藻糖在生理反应中起着保护作用，使植物能够更好地耐受非生物胁迫的不利影响[16]。在酵母菌株中，海藻糖的合成需要两步过程。首先，海藻糖-6-磷酸由尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）和葡萄糖-6-磷酸通过海藻糖-6-磷酸合酶（TPS 1）形成。其次，该化合物通过海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPS 2）脱磷酸化为海藻糖[17]。实际上，海藻糖在酵母中的积累始于对数生长期，在稳定期达到峰值。众所周知，海藻糖是一种胁迫诱导物质。许多研究[16，18]还指出，热可以刺激酵母产生更多的海藻糖。在酿酒酵母中，TPS 1基因在正常条件下以非常低的水平表达，并且随着热休克而显著增加，但在对照中没有TPS 2的表达[19]。而高渗透压、高温等刺激与海藻糖水平的相关性也在以往的研究中进行了研究。但对耐盐酵母的研究却很少.本研究旨在研究酱油酵母（S，T，Xiaohua Wang等人/ IERI Procedia 5（2013）321323S3-2和T3-5）以及如何提高它们的海藻糖水平。2. 材料和方法2.1. 培养基培养基为玉米汁，含有酵母所需的全部营养。玉米以其价格低廉、来源丰富、无酵母味等优点，在食品发酵工业中得到广泛应用。其制备方法为：将过60目的玉米粉与水按1：5的比例混合，在液化剂的作用下液化，- 淀粉酶，90 反应10分钟后，再用糖化酶催化液体在55 ℃下反应1小时左右生成小分子糖，直至其不能与碘溶液反应。在离心前，需要加热至100 ℃，持续10分钟以除去酶。最后得到了Brix为13的玉米汁，经杀菌后备用。2.2. 酱油酵母酱油酵母菌由天津科技大学菌种保藏中心提供。在出发菌株的基础上，通过基因组重排获得突变菌株S3-2、T3-5。突变菌株在耐盐性方面比原始菌株有更大的优势。2.3. 测定海藻糖采用蒽酮-硫酸比色法测定海藻糖含量。将不同体积（0.5mL、1 mL、1.5mL、2 mL、2.5mL、3mL、3.5mL）的海藻糖标准溶液（1g/L）与蒽酮硫酸（5 mL）和三氯乙酸（0.5mol/L，4 mL）混合，在沸水中准确反应10 min。冷却后，在630nm的吸收峰处测量吸光度值。制作了海藻糖的标准曲线用三氯乙酸提取细胞内海藻糖，在此期间仅获得海藻糖[20]。具体地，用冰三氯乙酸浸提酵母细胞1小时，然后离心并用冰水洗涤两次。以下步骤与上述步骤相同。3. 结果和讨论酵母菌株在YPD（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物粉末）中预生长，然后转换成玉米汁。为了选择胞内海藻糖的最佳测定时间点，首先研究了酵母菌在玉米汁中的生长曲线。如图1所示，酵母菌的对数生长期均为12 ~ 20 h。因此，我们选择这个时间段来研究细胞内海藻糖的水平。酵母菌的培养条件为13 Brix玉米汁培养基，30、170 r/min。图2清楚地表明酵母菌株可以在对数期积累海藻糖。随着时间的推移，酵母菌的生长条件逐渐变得不利，如营养消耗、PH值变化、代谢废物的产生等，海藻糖的积累有助于酵母菌抵御恶劣的环境，并在对数生长期末期达到高峰。这与前人的研究[21]一致，证明了S.在稳定期（海藻糖积累量高）的酿酒酵母细胞比在对数期的高。在随后的研究中，在20时考察海藻糖的水平。高渗条件可提高TPS1和TPS2的转录水平。研究了不同盐浓度对海藻糖积累图3表明，324Xiaohua Wang等人/ IERI Procedia 5（2013）32114.0012.0010.008.006.004.002.000.000 2 4 6810121416182022 24时间（小时）STS3-2T3-5图1.一、酱油酵母在玉米汁培养基（13 Brix）中的生长曲线8.06.04.02.00.012 14 16 1820时间（小时）STS3-2T3-512.010.08.06.04.02.00.00 3 6 9 1215盐浓度（%）STS3-2T3-5图二.对数生长期酵母生产海藻糖的研究图三.酵母在不同盐浓度下的海藻糖产量以海藻糖占盐容量浓度（0%、3%、6%、9%、12%、15%）干电池在一定范围内，海藻糖的含量随着盐浓度的变化而增加。原始菌株S和T在9%的盐浓度下能积累最多的海藻糖，而突变菌株在12%的盐浓度下能积累最多的海藻糖。如果超出一定范围，则会降低，这可能是由于使用海藻糖作为碳源，或酵母代谢发生变化，葡萄糖被用来合成其他相容性物质。热激可诱导海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶的合成。因此，热激是以盐刺激为基础的。图4（a）显示，S在9%盐中的海藻糖水平随不同温度和不同刺激时间而显著变化，而另一种原始酵母T显示出相同的趋势（图4（b）），即海藻糖水平在40 ℃下30分钟达到峰值。为了研究海藻糖含量与耐盐性的相关性，将原始菌株和突变株分别在9%盐和12%盐的条件下，用不同温度刺激30 min。结果如图5所示，可以得出结论，虽然盐激和热激能够提高酵母中海藻糖的积累，但突变体产生的海藻糖低于原始菌株。这说明突变体中海藻糖基因可能没有发生改变，耐盐酵母的耐盐性与海藻糖水平关系不大。在突变株中，底物可以是合成其他物质，如甘油等。酵母细胞海藻糖水平（%）海藻糖水平Xiaohua Wang等人/ IERI Procedia 5（2013）321325海藻糖水平%12.010.08.06.04.02.00.03035404530 60 90 120(a) 刺激时间分钟12.010.08.06.04.02.00.03035404530 60 90 120(b) 刺激时间分钟见图4。热激条件下S（a）和T（b）酵母生产海藻糖的研究当酵母菌培养至18h时（酵母菌生长较好），分别给予不同时间的热激，热激后恢复至3012108642030 35 4045刺激温度STS3-2T3-5图五. 热激条件4. 结论盐激和热激条件下，酱油酵母菌能积累更多的海藻糖。但最适盐刺激浓度不同，野生酵母菌株在9%的盐刺激下，玉米汁中的积累量最大，而突变酵母菌株在12%的盐刺激下，玉米汁中的积累量最大。在较高的盐浓度下，酵母菌不能积累更多的海藻糖。总的来说，S3-2和T3-5耐盐性较强，但突变菌株积累海藻糖的能力较低，说明海藻糖与酱油酵母耐盐性关系不大。确认这项工作得到了这些中国项目（2012AA022108、2012GB2A100016、31171731、2013AA102106、IRT 1166、2012BAD 33B04、10ZCZDSY 07000和31000768）的支持。%The e level of treh alose海藻糖水平 百分比326Xiaohua Wang等人/ IERI Procedia 5（2013）321引用[1] Wanakhachornkrai P，Lertsiri S.泰国酱油中挥发性成分测定方法的比较。食品化学2003;83：619[2] 严立杰，张英芳，陶伟英，王立平，吴晓锋。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法快速测定酱油中的挥发性风味成分。中国色谱杂志2008;26：285[3] 作者：Jiang S，Yoshida K，Kumada K.日本传统发酵食品纳豆的血管紧张素I转化酶抑制活性。JJpn Soc Food Sci 2006;53（3）：189[4] 李福君，尹立君，陆旭，李立堂。不同发酵剂发酵豆豉成熟过程中血管紧张素转换酶抑制活性的变化。Int J Food Prop 2010;13（3）：512[5] 张文，张文.各种发酵食品的血管紧张素转换酶抑制活性。生物科学生物技术生物学1995;59（6）：1147[6] LJ Wang，Saito M，Tatsumi E，LT Li.腐乳提取物的抗氧化和血管紧张素转换酶抑制活性。Jpn Agr Res Q 2003;37（2）：129[7] Nishant KJ，Ipsita Roy。海藻糖对蛋白质结构的影响蛋白质科学2008;18：24[8] 作者：Zhang G，Zhang R，Zhang G.海藻糖代谢：从细胞保护到信号传导。Int J Mol Sci2009;10：3793[9] [10]杨文忠，张文忠.海藻糖：特性、使用历史和人体耐受性综述，以及多项安全性研究结果。食品化学毒理学2002;40：871[10]Elbein AD.α，α-海藻糖的代谢。AdvCarbohydr Chem Biochem 1974;30：227-256. 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