埃及中胚草属物种遗传变异与遗传结构研究

eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e d sciences 1（ 2014）127e135主办方：评论文章使用不同遗传标记在三个埃及中胚草属物种内和之间的遗传变异玛格达岛穆罕默德·索利曼放大图片创作者：Yasmin M.Heikala，*a埃及曼苏拉大学理学院植物学系b埃及苏伊士运河大学理学院植物学系A R T I C L E I N F O文章历史记录：收到日期：2014年5月17日收到日期：2014年2014年8月30日接受2014年11月20日在线发布关键词：中胚草属物种遗传变异ISSRRAPDSDS-PAGEAB S T R A C T在埃及植物志中记录了中胚草属的三个种（Mesembryonicum stac umL.，黄花中胚草和Mesembryan-themum forsskaolii Hochst。购自Bioss.）。应用多种遗传标记（SDS-PAGE、RAPD和ISSR）对埃及中胚草12个居群内和居群间的遗传变异和遗传结构进行了研究。从国际海岸公路沿线不同地方收集的物种。蛋白质电泳分析显示18条带，分子量范围为11.6 ~ 104.6KDa。5个RAPD标记共扩增出39条带。多态性频率为25%~ 75%，平均61.78%。5个ISSR引物共扩增出37条条带，多态性比率为25%~ 55.5%，平均40.77%。AMOVA分析结果表明，SDS-PAGE、RAPD和ISSR标记的分子变异率居群内分别为73%、77%和53%，居群间分别为27%、23%和47%研究结果表明，M.堆叠um和M。nodiflorum表现出一定范围内的遗传多样性。RAPD和ISSR分子标记显示，黑木耳的遗传多样性较低。forsskaolii。与本地种相比，M. 堆叠um和M。 nodiflorum的遗传多样性较低。版权所有2014年，曼苏拉大学。由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。1.介绍Mesembryoniculoideae 亚 科 包 括 Mesembryoniculum 单属，有102种[1]。该属约有70种，原产于地中海地区、大西洋群岛、沙特阿拉伯、南非、南澳大利亚和加利福尼亚[2]。埃及植物志中记载了中胚草属的三个种（Mesembryonicumstac um L.，结花中胚草和毛中胚藓（Mesembryococcus forsskaoliiHochst.）购自Bioss.）*通讯作者。电子邮件地址：dryoyo_heikal@yahoo.com（Y.M.Heikal）。由曼苏拉大学负责进行同行审查。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2014.08.0012314- 808 X/版权所有2014年，曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇CC BY- NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp128埃及生物多样性公约和应用科学杂志1（ 2014）127e135根据El-Shayeb et al. [3]，M. stackum生长在海边的沙质和壤土生境，其特点是土壤湿度高，降雨量和温度适中。M. forsskaolii生长在以低降雨量和高温为特征的沙质平原或斜坡的栖息地。M.摘要节花生长在降雨量少、温度高的沙质生境和降雨量和温度适中的粉砂和壤土生境中，具有广阔的生态范围。M. 堆叠um和M。nodiflorum可以在盐渍土中生长，而M. 福氏藻生长在低盐土壤中。一些研究已经调查了Aizoaceae物种，如M.堆积具有多种生物活性（例如抗氧化剂、抗病毒和抗微生物）的UM[4e 6]。M. 堆积UM由于其盐累积特性也可用于生物修复[7]。M. forsskaolii种子被研磨成面粉，由于含有高蛋白质含量，用作面包和饼干的小麦替代品[8]。此外，M. nodiflorum和M. 堆叠um被用作食物，并在突尼斯传统医学中用于治疗眼部感染[9]，使这三个物种成为药物或化妆品应用的良好候选者。在种群和进化遗传学研究中，主要关注的是评估和评价遗传变异，它为任何进化变化提供了基础多年来，估计遗传多样性的方法已经从形态性状的孟德尔分析发展到数量性状的统计表征，再到各种生化电泳测定，最近又发展到DNA序列变异的分子估计[10]。分子遗传学方法在遗传多样性评价中的应用日益广泛。它们已被应用于增加我们对物种内和物种间遗传变异的结构和程度的了解[11]。已经开发了几种实验室技术，包括蛋白质方法（如同工酶电泳）或分子方法（如DNA分析），这些方法可以在不受环境因素直接干扰的情况下高度指示物种或种群中发现的遗传变异水平[11，12]。随机扩增多态性DNA（RAPD）是一种可以检测近缘生 物多态 性的DNA技术 [13] 。简 单重 复序列 间（ISSR）-PCR标记也是高度多态性的，并且在遗传多样性、基因组作图、遗传学、进化生物学以及种群和保护遗传学的研究中是有用的[14，15]。与等位酶是共显性标记不同，RAPD和ISSR是显性标记[11]。在本研究中，分子分析（RAPD和ISSR）旁边的生化分 析 （ SDS-PAGE ） ， 以 评 估 埃 及 Mesembryan-themum种内和之间的遗传变异自然生长在不同的沿海地区的埃及。2.材料和方法2.1.人口抽样植物样品收集自三种中胚草属物种的12个自然群体，代表不同的表1e代表三种中胚草的12个取样种群的位置和生境类型爸号位置物种GPS记录省生境纬度（北）31 120 19.320031 220 32.78002019 - 01-2800： 00：31- 350 9.880031- 220 57.810031 150 54.370031岁 150 57.60031 150 54.370031 220 32.78002019 - 01-2800： 00：经度（E）2018年12月 24日31 480 44.6002019 - 01- 2500：00：0031.050 39.840030 250 54.630032 180 6.630032 180 6.720032 180 6.630031 480 44.6002019 - 01- 2500：00：00123456789101112迪巴新Demiatta Zaian（Kalabshou）Baltim罗塞塔·贾米勒塞得港市El-Gamil新Demiatta Zaian（Kalabshou）Baltim罗塞塔中胚草路侧滨海沙滩路边沿海沙丘路边石灰质沙滩海岸沙滩公路边海岸沙丘路边塞得港卡费尔·谢赫·贝希拉塞得港塞得港DemiattaEl-Dakahlia卡费尔·谢赫·贝希拉毛叶中胚藓来自Boss。黄花中胚草129eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e d sciences 1（ 2014）127e135图1e埃及国际沿海公路沿线中胚藓种群采样地点（*）地理图。国际沿海公路沿线的地点，如表1所列，图1所示。1.一、M. 斯塔克乌姆湖 和M.节花 种群收集自五个地点（Port said，Demiatta，El-Dakahlia，Kafr El-sheikh和El-Beheira），而 M. 毛蕨来自Boss。仅从两个地点（El-Gamil和Port Said市）收集了种群抽样人口的数量取决于实际人口规模。种子和新鲜的嫩叶收集作为散装样品从每个种群的每个物种在研究区域的遗传分析。2.2.生化分析（SDS-PAGE）使用Laemmli [16]所述的脱氧乙酰硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来区分所研究的12个M种群。叠加这个，M. forsskaolii和M. nodiflorum种子的蛋白质谱。它是根据分子量分离和区分蛋白质的标准方法。对凝胶中的带型进行拍照，并对每个分类群的带数进行评分。2.3.植物材料和DNA提取使用Dellaporta的改良方案提取基因组DNA[17]。 通过琼脂糖凝胶电泳定量DNA的量。DNA样品保存在-20℃用于RAPD和ISSR分析。2.4.RAPD扩增根据Williams等人[13]进行聚合酶链反应（PCR）。12个RAPD引物进行了初步筛选，筛选，但在分析中仅使用五种引物（OPO 9、OPO 10、OPO 11、OPO 12和OPO 13），并列于表3中。所产生的清晰和可重复的带型被用来评估遗传多样性。对反应条件进行了优化，混合物由dNTPs（5ml ）、MgCl 2（5ml）、10×缓冲液、引物（5ml）、DNA（10ml）、Promega Taq DNA聚合酶（2.5单位）组成DNA扩增在热循环仪（PTC-100）中进行，程序为95℃ 5 min（一个循环）;然后94 ℃ 1 min，36 ℃ 1 min和72 ℃ 2 min（45个循环）; 72℃ 5 min（一个循环），然后4 ℃（无限循环）。将扩增产物（10ml）与5ml溴酚蓝混合，在1.5%琼脂糖凝胶上分离，并用3ml溴化乙锭染色，然后拍照。2.5.ISSR扩增根据Zietkiewicz et al.[18]使用5种基因型的选择性ISSR引物（HB 11、HB 12、HB 13、HB 14和HB 15），所述引物在AGERI，ARC（埃及）的ABI 392 DNA/RNA合成仪（Applied Biosystems）上合成，并在表3中表示。DNA扩增在Stratgene PCR 96中进行，其被编程为在94℃变性（一个循环） 2分钟，随后30个循环：如下94 ℃ 30秒，44 ℃ 45秒，72℃ 1分钟，最后一个循环在72 ℃延伸20分钟，和4℃（不定式）。将15ml PCR产物在含1×TAE运行缓冲液的1.5% GTG琼脂糖凝胶电泳运行在80 V下进行180 min，凝胶用溴化乙锭染色，然后拍照。在中心实验室的UV透射仪下，通过凝胶记录系统（Biometra Bio Doc Analyze 2000）对130埃及生物多样性公约和应用科学杂志1（ 2014）127e135表2e十二个不同群体的蛋白质图谱的SDS-PAGE数据矩阵中胚草属在埃及图1显示了中胚草属12个不同种群的蛋白质带型的电泳图。在埃及，M ¼标记为1、2、3、4和5 ¼M。堆积6.7 ¼M。forsskaolii和8、9、10、11和12 ¼M。nodiflorum。沙漠研究中心乐队被评为存在(1)或不存在（0），无论其强度如何。仅记录清晰从分析中排除涂片和弱的细胞通过将多态性条带除以评分条带的总数，使用生成的二进制数据来估计多态性水平2.6.遗传多样性和遗传结构使用GenAlEX 6.2[19]，计算每个物种遗传多样性的标准措施，包括不同等位基因数 （Na ）、有效等位基因数（Ne ）/（ p2<$q2 ）、Shannon信息指数（SI ）/（pLn（p ）<$qLn（q））、期望杂合度（He）/（2 pq）、无偏期望杂合度 （ UHe ） / （ 2N/ （ 2N-1） ） He 和多 态 位 点 百 分 率（%P）。对所有测量值进行评估，并表示为种群内基因 座 和 物 种 内 种 群 间 基 因 座 的 平 均 值 和 标 准 误 差（SE）[20]。使用分子变异分析（AMOVA）程序[21]估计物种间的遗传差异（PhiPT），以研究物种间遗传变异的分层划分。PhiPT是131eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e d sciences 1（ 2014）127e135基于RAPD-PCR和ISSR-PCR的中胚草DNA多态性分析埃及人口，人口数量见表1。计 算 为 物 种 间 方 差 相 对 于 总 方 差 的 比 例 。 使 用GenAlEX 6.2[22]计算物种对之间的无偏遗传同一性和距离[23]。分子量范围为11.6 - 104.61（KDa）的条带，如表2所示和平板1所示。In M. 结果表明，该蛋白质谱由13条带组成，其中5条为单态带，8条为多态带。发现了五条独特的条带，分子量如下（71.5、50.8、44.9、12.7和11.6 KDa）。聚乙烯的百分比3.结果3.1.SDS-PAGE电泳图谱蛋白质样品的电泳分析显示出独特的电泳模式。中胚草属植物的蛋白质电泳图谱为18态射率为61.54%。 In M. forsskaolii共扩增出11条带，其中5条为单态带，6条为多态带。在分子量分别为86.2、73.4、50.8、40.5、16.8和10.5的菌株中12.7KDa）。多态性频率为54.54%。 In M.结果表明，在供试的15条谱带中，3条为单态谱 带 ，12条为多态谱带。四个独特132埃及生物多样性公约和应用科学杂志1（ 2014）127e135表3e引物及其核苷酸序列表，不同RAPD和ISSR引物产生的条带产物范围，共有条带数和多态性条带数以及多态性百分比分子类型引物编码核苷酸序列50到30大小范围（bp）条带总数单态带多态带%多态性RAPDOPO9TCC CAC GCA小行星1465e35082675OPO 10TCA GAG CGC C910E 13072571.42OPO 11广汽AGG AGG T第1112集第115集82675OPO 12CAG TGC TGT G950E 30586225OPO 13GTC AGA1120e9583562.5平均7.834.861.78%ISSRHB11(GT)6CC1500E 45084450HB12(CAC)3GC1800E 40094555.55HB13(GAG)3GC1900e300106440HB14(CTC)3GC1200E 50043125HB15(GTG)3GC1300E 70064233.33平均7.44.23.240.77%用分子量（73.4、44.9、12.7和12.8）对条带进行评分。11.6 KDa）。多态性百分率估计为80%。3.2.分子分析使用5个引物（OPO 9、OPO 10、OPO 11、OPO 12和OPO13）的RAPD分析和5个引物（HB 11、HB 12、HB 13、HB 14和HB 15）的ISSR分析的DNA图谱结果见平板2。表3和表5列出了不同引物产生的单态和多态性条带的带型范围、产物数。3.2.1.RAPD分析RAPD-PCR结果表明，在菊花居群中具有较高的多态性。共扩增出39条清晰、多态性条带数在2 ~ 6条之间。平均每个引物扩增出4.8个多态性片段。多态性的百分比范围从（OPO 12）中的最小值25%到（OPO 9和OPO11）中的最大值75%，平均值为61.78%，如表3和5所示。引物OPO 12扩增出分子量为950 bp和895 bp的两条M.水晶此外，分子量为1120 bp的引物Opo13条带可被认为是M的唯一（私有等位基因）。堆积这个。引物OPO9、OPO 10和OPO 13的分子量分别为475 bp、560 bp和220 bp，为M. forsskaolii。 引物OPO 9在一个位点上扩增出分子量为350 bp、1465 bp和1120 bp的条带，而在其它位点上扩增出分子量为350 bp、1465 bp和1120 bp的条带。此外，引物OPO 10的分子量为250 bp和910 bp的条带存在于一个位点，而在其他位点不存在。在引物OPO13中 ，分 子 量 为450 bp 和 1120 bp 的特异性条带为 M.nodiflorum。3.2.2.ISSR分析在ISSR分析中，引物扩增出37条重复性好的条带，条带大小在300 ~ 1900 bp之间。如表3和表5所示，其中16条具有多态性，平均每个引物3.2条多态性带，其余21条为单态带。多态性分布在HB 14和HB 12之间，多态性分布范围最小为25%，最大为55.5%，平均为40.77%。结果表明，引物HB 11和HB 12分别扩增出分子量为900 bp和1600 bp的特异性条带。 forsskaolii种群（6）。发现分别对应于引物HB 12、HB 13和HB 15的分子量为1800 bp、500 bp和1100 bp的条带是用于PCR的独特条带（私有等位基因）。M.堆积这个。In M.引物HB 11的分子量为900 bp和1500bp的条带仅在一个居群（10个）中出现，其余居群均未出现。另外，分别属于引物HB 12的分子量为1200 bp和1600 bp的条带以及属于引物HB 13和HB 15的分子量为500 bp和800 bp的条带被记录为独特条带（即，私人等位基因只记录在一个种群内的物种），M. nodiflorum中（表4）。3.3.遗传多样性和遗传结构虽然RAPD和ISSR标记的条带数分别为39、37和18条，高于SDS-PAGE，但SDS-PAGE测定的多样性参数均高于RAPD和ISSR标记。用SDS-PAGE电泳分析，三个种的平均多态性为48.15%，而RAPD分析和ISSR分析的平均多态性分别为29.06%和20.72%。RAPD和ISSR标记一致 认 为 ， M. nodiflorum 其 次 为 M. 堆叠um 比 M 。forsskaolii。SDS-PAGE鉴定为M.堆叠最高分集值，然后是M。nodiflorum。它分配给M。forsskaolii的多样性值最低（表6）。鉴于M中的样本量，应谨慎处理结果。forsskaolii小于5。总体而言，AMOVA结果显示，在物种（PhiPT）中发现的总遗传变异比例较高（表6）。RAPD标记的阳性率（23%）低于SDS-PAGE标记（27%）。结果表明，ISSR标记的总遗传变异率较高此外，物种种群内的分子变异百分比为133eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e d sciences 1（ 2014）127e135表4中胚草不同基因型的RAPD和ISSR图谱。每个标记使用5个引物，群体数见表1。经SDS-PAGE、RAPD和ISSR标记检测，其阳性率分别为73%、77%和53%。4.讨论评估遗传多样性是任何种群遗传调查的重要前提，它影响物种和种群的进化潜力[23]。这项研究提供了 一 些 详 细 的 遗 传 变 异 和 结 构 的 三 个 埃 及Mesembryocyanum种生长在不同的自然栖息地的基础上，已被证明是有价值的遗传多样性的测定生化和分子标记表5e中胚草属物种RAPD和ISSR标记产生的条带特征的比较分析。号参数RAPDISSR1筛选的种属332使用的底漆数量553标记物范围95e1465bp700e 1500 bp4乐队总数39375单形带15216多态性条带24167多态性%61.78%40.77%134埃及生物多样性公约和应用科学杂志1（ 2014）127e135RAPD引物OPO 11和OPO 12分别扩增出分子量为1112bp和950 bp的特异条带，OPO 12扩增出分子量为895 bp的特异条带。在罗塞塔市堆积人口（人口5）。引物OPO9扩增出分子量为475 bp的条带，为M的一个私有等位基因。forsskaolii群体（群体7），引物OPO 9的分子量为350 bp 的 条 带 为 M 的 私 有 等 位 基 因 。nodiflorumpopulation at New Demiatta city（population 9）. 同时，利用HB12引物进行ISSR标记，得到1200bp的条带，为M的私有 等 位 基 因 。nodiflorum population at Baltim city（population 11）.结果表明，RAPD和ISSR分子标记技术可用于不同产地中胚草属植物的DNA指纹分析、遗传变异检测和品种鉴定。DNA序列的变异导致多态性。更大的多态性反映了更高的遗传多样性。RAPD、ISSR和SDS-PAGE标记的多态性分别为61.78%、40%、77%和80%如先前关于三个同属野生物种（M. Stacker um L.，M.节花 和M. 毛蕨购自Bioss.）结果表明，在10个RAPD标记中均出现了明显的多态性条带，表明供试种间的遗传分化程度差异不大。在对五爪草属植物的遗传多样性评价中也得到了类似的结果。 还有劳娜娅·卡斯利用RAPD和ISSR标记[25，26]。随机扩增多态性DNA（RAPD）和简单重复序列间（ISSR）标记只需要少量的DNA，不涉及放射性标记，更简单，更快。 RAPD已被证明在检测遗传变异和用于遗传多样性和鉴定植物物种种质方面非常有效[27，28]。ISSR已被证明提供了一种强大、快速、简单、可重复和廉价的方法来评估遗传多样性，并确定许多物种中密切相关的品种之间的差异[29]。ISSR可能是植物品种DNA指纹分析的一个有价值的工具[30]。Yildiz等人[31]指出，通过ISSR、SRAP和RAPD标记测量的遗传变异也显示了土耳其甜瓜基因型之间的高度多样性（H1/4 0.30、I 1/4 0.45和87.6%）。与其它短命、异交的多年生植物相比（P <43.7%和32.1%，H <0.123），M. 堆叠UM和M. nodiflorum表现出一定范围内的遗传多样性。RAPD和ISSR分子标记显示，黑木耳的遗传多样性较低。forsskaolii。 这可能是由于样本量小于5。 在地方尺度上 ， 有 唇 形 科 （ Lamiaceae ） 的 三 种 假 单 胞 菌 属（Artistata）; undulata（Fresen.）本特，B. 岩生C. Presel和B. kaiseriTackh. 已经分析了西奈半岛南部的原生植物的等位酶多样性[33]，并且已经分析了金丝桃和牛至亚种的AFLP [34]。与多年生异交草本植物M.堆叠um和M。nodiflorum的遗传多样性较低。对于使用不同遗传标记的研究之间的比较，杂合性的估计似乎是最合适和最常报告的参数，尽管这些参数受到条带和基因座选择的影响[35]。表6e不同遗传标记（RAPD、ISSR和SDS-PAGE）显示的遗传多样性参数遗传标记物种NNBF≥5%NBPSNaNeSI他uHe百分比PAMOVA（%）内之间RAPDM. 堆叠umM. 福斯考利M. 节花总数/平均数M. 堆叠umM. 福斯考利M. 节花总数/平均数M. 堆叠umM. 福斯考利M. 节花3728353934293437151113185254525452543728353934293437151113183110303041001.207（0.055）1.054（0.031）1.259（0.057）1.174（0.029）1.154（0.053）1.038（0.027）1.1721.282（0.090）0.795（0.091）1.359（0.107）1.145（0.060）1.162（0.091）0.838（0.082）1.2430.120（0.030）0.032（0.018）0.154（0.031）0.102（0.016）0.088（0.028）0.022（0.016）0.1030.179（0.043）0.047（0.026）0.233（0.044）0.153（0.023）0.131（0.040）0.033（0.023）0.15833.33%7.69%46.15%29.06%（11.31）24.32%5.41%32.43%20.72%（8.01）66.67%33.33%44.44%0.133（0.033）0.042（0.024）0.171（0.034）0.115（0.018）0.097（0.031）0.030（0.021）0.114772353ISSR47SDS-PAGE7327N<$4样品数量; NB<$4不同条带数量; NBF ≥ 5%<$4频率≥5%的不同条带数量; PS<$4单个物种特有的条带数量; Na<$4不同等位基因（条带）数量; Ne<$4有效等位基因数量<$1/（p^2<$q^2）; He<$4预期杂合性<$2 * p * q; uHe<$4无偏预期杂合性<$4（2 N/（2 N-1））* He; SI<$4香农信息指数<$4 - 1*（p *Ln（p）<$q *Ln（q））; %P1/4多态位点百分比;（括号内）为平均值±标准误差。135eGYPTI anjournalofbasI cand aPPlI e d sciences 1（ 2014）127e135雷弗伦 CES[1] Klak C，Bruyns PV，Hedderson TAJ.中胚草亚科（Aizoaceae）的一个新分类. 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