安石榴苷对糖尿病代谢和心脏功能的影响及作用机制

埃及基础与应用科学杂志2（2015）247主办方：完整文章安石榴苷对链脲佐菌素诱导的细胞凋亡、氧化还原失衡、代谢变化和炎症Mohamed A.El-Missirya，*，Maher A.法里德·阿梅尔Hemiedaa，阿扎岛作者声明：A.海赛姆·萨克尔·阿阿卜杜勒哈迪ba埃及曼苏拉曼苏拉大学理学院动物学系b伊拉克安巴尔安巴尔大学纯科学教育学院生物系A R T I CL EI N F OA B S T R A C T文章历史记录：2015年7月27日收到2015年8月30日收到修订版2015年9月8日接受2015年9月25日在线发布关键词：多酚类心肌病脂质链脲佐菌素心脏研究了安石榴苷对实验诱导糖尿病的代谢风险、氧化应激、炎症、心脏损害和组织病理学改变的影响。通过单次注射链脲佐菌素（STZ; 40 mg/kg，i. p.）在雄性大鼠中诱导糖尿病然后腹腔注射安石榴苷（lmg/kg）。每隔一天给药，持续15天。接受安石榴苷治疗的糖尿病大鼠表现出高血糖和HbA 1c改善;胰岛素水平、HOMA-IR水平和脂质特征改善; IL-1b、IL-6和TNF-α水平正常化。红石榴苷还能降低MDA和H2O2的升高，使心肌GSH、SOD和CAT水平恢复正常，并能改善血清肌钙蛋白T、CK-MB和LDH活性等心功能指标。心脏切片的组织学检查它还通过增强Bcl-2表达来调节心肌细胞凋亡;阻断P53、Bax和caspase-3、8和9的增加;并改善心脏中的DNA损伤目前的研究结果表明，安石榴苷通过改善氧化还原状态，抑制半胱天冬酶和P53，增加Bcl-2，保护心脏免受细胞凋亡，坏死，炎症和DNA损伤结论安石榴苷在治疗和调节糖尿病及减轻心脏相关并发症方面具有很强的治疗潜力© 2015曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一个开放在CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-）下访问文章nc-nd/4.0/）。1.介绍糖尿病心脏的患病率在过去几年中显著增加，并且现在被认为是糖尿病和肥胖人群中患病和死亡的主要原因糖尿病性心肌病与氧化应激增加有关，氧化应激刺激细胞损伤，并导致* 通讯作者。联系电话：+201000964040。电子邮件地址：maelmissiry@yahoo.com（硕士）El-Missiry）。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2015.09.004与糖尿病相关的并发症的发展和进展[1]。细胞凋亡是血糖控制不良导致的糖尿病性心脏病的关键过程许多研究已经证明糖尿病患者和实验诱导的糖尿病动物的心肌细胞中细胞凋亡的发生率增加[2，3]。它至少部分地由线粒体途径的激活介导，线粒体途径通常由活性氧（ROS）触发。2314- 808 X/© 2015曼苏拉大学。Elsevier B. V.制作和托管这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp248埃及基础与应用科学杂志2（2015）247有来自实验和临床环境的证据表明抗氧化剂治疗在预防和 治 疗 糖 尿 病 并 发 症 方 面 的 益 处 [4 石 榴 （ PunicagranatumL.）石榴科）果汁已被证明含有最高的抗氧化能力相比，其他多酚丰富的饮料[7，8]。临床研究表明，石榴汁消费对糖尿病患者的血液糖尿病和氧化应激参数有积极影响此外，有记录表明，石榴汁补充剂对大鼠中异哌啶醇诱导的心脏坏死具有保护作用[10]。石榴的有效抗氧化潜力归因于其主要的抗氧化剂多酚安石榴苷[11]。棕榈酸酯组分对疾病状况发挥其有益作用的主要机制是通过减少氧化应激和脂质过氧化。这种减少可能通过直接中和产生的ROS、增强特定抗氧化酶的活性、促进金属螯合活性以及抑制或激活某些转录因子（如核因子κ B和过氧化物酶体增殖物激活受体γ）而发生[12]。石榴皮苷是一种生物活性鞣花单宁，一种从石榴中分离的酚类化合物，具有高抗氧化和自由基清除活性[13]，具有多种健康益处[14]。它证明了代谢综合征患者的显著结局，如高脂血症、非酒精性脂肪肝和冠心病[12，15红石榴苷通过清除活性羰基物质抑制晚期糖基化终产物的形成[18]和果糖介导的非酶促蛋白质糖基化[19]。已证明使用安石榴苷在脂肪损失[20]和抑制巨噬细胞中氧化LDL摄取[21]除了抗氧化、抗糖尿病和抗动脉粥样硬化作用[12，14]外，安石榴苷还在细胞培养和动物研究中显示出抗炎活性[22，23]。值得一提的是，安石榴苷重复经口给药5周对大鼠无毒性[24]。由于糖尿病与高频率的心力衰竭相关迄今为止，尚未进行关于安石榴苷对糖尿病心脏细胞凋亡和损伤的影响的研究。本研究假设安石榴苷可以对抗氧化应激，进而减轻细胞损伤并减少糖尿病并发症的发生和进展。因此，本研究旨在探讨安石榴苷对糖尿病诱导的心脏损伤和细胞凋亡的潜在有益作用，与其抗脂质过氧化和抗高血压作用有关。2.2.诱导糖尿病通过单次腹膜内（i.p.）注射新鲜制备的STZ（40 mg/kg体重），0.01 M柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5[25]。在STZ注射后48小时，使用葡萄糖监测装置（Elegance，CT-X10，ConvergentTechnologies GmbH Co. KG，Marburg，Germany）测定血糖水平血糖水平高于250 mg/dl的大鼠被认为是糖尿病大鼠2.3.石榴皮苷治疗石榴皮苷是一种水溶性深黄色粉末。每天腹腔注射1 mg/kg溶于0.2 ml生理盐水溶液的应用剂量，持续15天[26]。2.4.实验工作体重为280-300 g的雄性Wister大鼠&在实验前，使动物适应22- 24 °C的实验室条件，12小时光照/黑暗循环两周。本研究获得了Mansoura University的批准，所有实验均按照地区实验动物伦理委员会接受的标准进行。将大鼠随机分为4组，每组7只。第一组作为对照，第二组接受每日剂量的安石榴苷（lmg/kg，i. p.）第3组腹腔注射STZ 40 mg/kg，第4组 腹 腔 注 射 STZ 40 mg/kg ， 共 15 d 。 随 后 是 安石 榴 苷（lmg/kg，i. p.）每隔一天一次治疗15天后，禁食过夜后通过心脏穿刺获得血液将血清和心室保存在冰箱中用于以下研究。2.5.生化研究分别使用Spinreact（St. Esteve d'en Bas Girona，西班牙）、Abcam （ Cambridge ， MA ， USA ） 和 BioSystems（Barcelona，西班牙）提供的试剂盒测定血清中的葡萄糖和胰岛素水平以及血液根据制造商的说明书（Spinreact，St.Esteve 使用由 R D Systems （ Minneapolis ， MN ， USA ） 和Bioscience（San Diego，CA，USA）提供的试剂盒评估血清中的白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1 β（IL-1b）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和原肌球蛋白T&。美国）。肌酸激酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）2.材料和方法2.1.化学品链脲佐菌素（STZ）和安石榴苷（PU）购自Sigma Chemical（St.Louis，MO）。所有其他化学品都是最高等级的。使用购自Elitech（Puteaux，France）的试剂盒测定血清中的活性。通过测定丙二醛（MDA）的量来评估脂质过氧化。根据制造商的说明书（Dokki-Giza，Egypt）估算过氧化氢（H2O2）浓度。测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性及谷胱甘肽（GSH）含量249埃及基础与应用科学杂志2（2015）247使用由Biodiagnostic（Dokki-Giza，Egypt）提供的试剂盒。如前所述测定蛋白浓度[27]。2.6.流式细胞术研究2.6.1.细胞凋亡的测定对于流式细胞术，如前所述制备来自心脏的样品[28]。 将细胞悬浮于含有BSA的PBS中，分成等分试样并储存在4 °C下用于分析。使用CellQuest Pro软件（Becton Dickinson）在FACSCalibur™细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA）上进行流式细胞术分析，以进行数据采集和分析[29]。2.6.2.annexinv/PI着色根据制造商的说明书，使用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V/PI，来自Clontech（Palo Alto，CA）的ApoAlert试剂盒2.6.3.Bcl-2、Bax、P53和CD 95在 PBS/BSA 缓 冲 液 中 制 备 细 胞 悬 浮 液 ， 然 后 用 抗 Bcl-2[100/D5]抗体（ab 692）和抗Bax [6A 7]抗体（ab 5714）孵育30分钟，分别用于Bcl-2和Bax的流式细胞术分析使用小鼠抗P53用单克隆抗Fas（CD 95/Apo-1）抗体测定CD 95。在室温下孵育30分钟后，用PBA/BSA洗涤细胞，以400 × g离心5分钟，重悬于含0.5%多聚甲醛的PBS/BSA中，并使用流式细胞术进行分析。2.6.4.半胱天冬酶-3，-8-9在半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的情况下：分别使用FITC兔抗活性半胱天冬酶-3（CPP 32;Yama;Apopain，BDBioscience）、抗半胱天冬酶-8（E6）抗体（Abcam）或兔单克隆抗半胱天冬酶-9（E23）抗体（ab 32539）。2.7.单细胞凝胶电泳（彗星试验）如前所述，使用单细胞凝胶电泳（彗星试验）方法评估心脏样本中的DNA损伤，该方法是一种经过充分验证的技术，用于测量单个细胞中的DNA链断裂[30，31]。用CASP软件对获得的图像中的DNA链断裂进行定量，以直接获得尾部中的DNA百分比、尾长和尾矩。2.8.组织病理学检查将心室切除并固定在4%多聚甲醛缓冲液中，在递增等级的乙醇中脱水，在二甲苯中清洁并固定在熔融的paraplast 58-62 ℃中切割4微米组织切片，用苏木精和伊红染色，在明视野光学显微镜下检查并拍照。2.9.统计分析数据表示为平均值± SEM。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行Students3.结果安石榴苷单独给药，每隔一天给药一次，持续两周，不影响体重、葡萄糖浓度、胰岛素或血脂谱。同样，安石榴苷处理不影响IL-1b和IL-6的水平。安石榴苷对心肌组织中SOD、CAT活性及脂质过氧化产物（TBARS）无明显影响相反，血清中的HDL水平和心脏中的GSH水平显着增加。3.1.体重与正常大鼠相比，STZ组大鼠体重明显下降，且呈逐渐下降趋势与糖尿病组相比，用安石榴苷（1 mg/kg;每隔一天）治疗的糖尿病大鼠在实验期间显示出体重的显著增加（图1）。1a）;然而，它们仍然显著低于对照组。3.2.血糖、胰岛素和HbA-1c水平实验期间糖尿病大鼠血糖较对照组明显升高。与糖尿病组相比，用安石榴苷治疗的糖尿病大鼠在实验期间（图1b）和实验期结束时（表1）表现出明显的改善，但水平显著低于对照组。糖尿病诱导后两周，STZ注射显著升高血清葡萄糖和HbA-1c水平（表1）。此外，与对照组相比，这些大鼠的胰岛素水平显著降低，HOMA-IR显著升高（表1）。与STZ处理的大鼠相比，在糖尿病诱导后15天的Punicalagin与糖尿病大鼠相比，用安石榴苷治疗的糖尿病大鼠显示胰岛素水平显著升高和HOMA-IR值降低，但结果与对照水平相似3.3.生化观察3.3.1.血脂谱与对照组相比，STZ组大鼠的总脂、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白显著升高，高密度脂蛋白在大鼠中糖尿病诱导后15天，Punicalagin治疗显著改善了这些脂质部分（图1B）。 2）。3.3.2.心功能血清标志物与正常对照组相比，STZ诱导的糖尿病大鼠心肌肌钙蛋白T浓度、CK-MB和LDH活性显著升高（表2）。当用安石榴苷治疗糖尿病大鼠时，两种酶的活性和肌钙蛋白T水平均正常化至与对照大鼠相当的水平，并且显著低于糖尿病动物的水平。250埃及基础与应用科学杂志2（2015）247图1值表示为平均值±SEM。（n= 7）。3.3.3.氧化应激和抗氧化剂STZ诱导的糖尿病大鼠心脏中脂质过氧化产物和H2O2水平显著升高（图3）。此外，STZ还能显著降低大鼠心肌当在糖尿病诱导后给予安石榴苷15天时，这些变化似乎与对照水平相似，并且显著优于糖尿病大鼠的变化（图1）。 3）。3.3.4.促炎细胞因子采用酶免疫分析法检测安石榴苷对不同大鼠血清中IL- 1b、IL-6、TNF-α接受STZ的动物的IL-1b、IL-6和TNF-α水平显著高于对照值（表3）。在糖尿病诱导后施用Punicalagin改善了血清中这些炎症蛋白的增加，并且与糖尿病大鼠相比显示出不显著的变化。表1-控制PUSTZSTZ + PU葡萄糖82.1± 11.98104.9 ± 10.71577.8 ± 18.6*115.2 ± 15.4#胰岛素99.19 ± 3.42108.7 ± 11.838.44 ± 2.14***110.7 ± 11.3#HbA-1c1.39 0.12 ±1.13± 0.115.16± 0.19*1.66± 0.13#HOMA-IR20.31 ± 3.4522.45 ± 2.0352.53 ± 5.56**23.7± 3.0##值表示为平均值± SEM。（n = 7）。*， #P 0.05时具有显著性，**，##P 0.01时具有显著性，***，###P 0.001时具有显著性。*， **，* 表示与对照组的比较#、##、#表示与糖尿病组的比较251埃及基础与应用科学杂志2（2015）247图2 -链脲佐菌素（STZ）和安石榴苷（PU）对不同组大鼠血清中脂质谱[总脂质（a）、胆固醇（b）、甘油三酯（c）、低密度脂蛋白（d）、高密度脂蛋白（e）和极低密度脂蛋白（f）]（以mg/dl表示）的影响。值表示为平均值±SEM。（n= 7）。*， #P 0.05时具有显著性，**，##P 0.01时具有显著性，***，###P 0.001时具有显著性。<<<*、 **、* 表示与对照组的比较。#，##，#表示与糖尿病组的比较。3.4.细胞凋亡和凋亡蛋白3.4.1.Annexin V/Pi流式细胞术用于使用膜联蛋白V-FITC染色评估心脏中的细胞凋亡（图4）。 糖尿病大鼠心脏早期、晚期凋亡细胞和坏死细胞的百分比均显著高于对照组。安石榴苷疗法与糖尿病大鼠相比，最小化了凋亡细胞的数量3.4.2.CD95和P53类似地，STZ处理的大鼠心脏中的CD95和P53表达显著增加（图1）。5a，b）。糖尿病诱导后给予Punicalagin，与对照组相比252埃及基础与应用科学杂志2（2015）247表2-控制PUSTZSTZ + PU肌钙蛋白T104 ± 7.5103 ± 4.97171 ± 9.99*99 ± 6.15###CK-MB171.6 ± 6.9143 ± 18.8396 ± 20.4**216 ± 20.5#LDH153 ± 10.8129 ± 36.1361 ±14.8194 ± 18.9#值表示为平均值± SEM。 （n = 7）。 *， #P 0.05时显著，**，##P 0.01时显著，*，#P 0.001时显著。*、 **、* 表示与对照组的比较。#、##、#表示与糖尿病组的比较表3-控制PUSTZSTZ + PUIL-650.3± 2.4244.2± 1.3472.7± 1.98*45.9± 2.27#IL-1b72.9± 4.661.3± 2.72124.9 ± 4.44*75.7± 2.09#肿瘤坏死因子-α35.6± 0.8133.0± 1.6163.8± 2.75*37.3± 0.42*，#值表示为平均值± SEM。 （n = 7）。 *， #P 0.05时显著，**，##P 0.01时显著，*，#P 0.001时显著。*、 **、* 表示与对照组的比较。#、##、#表示与糖尿病组的比较图3d）、谷胱甘肽（GSH; mg/g蛋白）（e）。值表示为平均值± SEM。（n = 7）。 *，#P <0.05时具有显著性，**，##P <0.01时具有显著性，***，###P <0.001时具有显著性。*、 **、* 表示与对照组的比较。#、##、#表示与糖尿病组的比较。253埃及基础与应用科学杂志2（2015）247图4 -链脲佐菌素（STZ）和安石榴苷（PU）对不同组大鼠细胞凋亡百分比的影响。显示由FACS生成的数据的实例的流式细胞术结果在每个直方图的顶部。值表示为平均值±SEM。（n= 7）。*， #P 0.05时具有显著性， **，##P 0.01时具有显著性，***，###P 0.001时具有显著性<<<*、 **、* 表示与对照组的比较。#、##、#表示与糖尿病组的比较。糖尿病大鼠已经评估了安石榴苷与糖尿病一起对特定凋亡蛋白的影响3.4.3.Bcl-2和Bax流式细胞术数据的分析显示，在STZ诱导的糖尿病大鼠的心脏中，抗凋亡蛋白Bcl-2显著减少，而凋亡蛋白Bax增加（图6a，b）。Punicalagin治疗显着正常化STZ诱导的这些蛋白质的表达的变化。3.4.4.Caspase-3、8和9图 7、Caspase-3、8、9在STZ诱导的糖尿病大鼠心脏中的表达水平显著上调大鼠Punicalagin施用显著地使这些凋亡蛋白正常化（图1A和1B）。6c ，7a，b）。3.5.彗星试验彗星参数水平的变化如图8所示。STZ治疗的大鼠显示所有的水平增加， 彗星 属性， 包括， 尾DNA含量、尾长、尾矩的变化提示糖尿病大鼠存在DNA损伤。同时，治疗糖尿病大鼠与安石榴苷显着抑制彗星参数的增加。254埃及基础与应用科学杂志2（2015）247图5 -链脲佐菌素（STZ）和安石榴苷（PU）对不同组大鼠中CD 95（a）和P53（b）百分比的影响。显示由FACS生成的数据的实例的流式细胞术结果在每个直方图的侧面。值表示为平均值±SEM。（n= 7）。*， #P 0.05时具有显著性，**，##P 0.01时具有显著性，*，#具有显著性<